專利名稱：多環(huán)抗寄生蟲劑，其制備的方法和菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景新的抗寄生劑是熟知的，例如US 4310519和4199569中公開的除蟲菌素。然而，所述除蟲菌素化合物盡管是抗內(nèi)外寄生蟲的有潛力的試劑，但其在結(jié)構(gòu)上與本發(fā)明化合物有顯著的不同。除蟲菌素，作為從放線菌中分離的大環(huán)試劑，與本發(fā)明多環(huán)真菌代謝產(chǎn)物無關(guān)。在deJesus等在J.Chem.Soc.Perkin Trans I，pg 697-701，(1984)中描述了鑒定為janthitrem的真菌代謝產(chǎn)物，所述janthitrem具有多環(huán)結(jié)構(gòu)，但沒有數(shù)個本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)元素。本發(fā)明綜述本發(fā)明涉及新抗寄生蟲劑和體外殺寄生蟲劑的制備方法。因此本發(fā)明的一個目的是公開所述的新化合物。另一目的是提供制備所述化合物的新方法。另一目的是描述用于制備所述化合物的微生物和用于所述生產(chǎn)的發(fā)酵條件。還有一目的是描述用本發(fā)明化合物作為抗寄生蟲劑的組合物和方法。在閱讀下列描述的過程中其他目的將是顯而易見的。
附圖描述

圖1，2和3分別是化合物1，2和3的質(zhì)子核負共振譜。在圖中，用“X”標(biāo)出了數(shù)個共振峰。這些峰是溶劑存在的結(jié)果，并且對于所述化合物的結(jié)構(gòu)來說不明顯。
圖1于25℃在Varian Unity 500 NMR光譜儀上，CD2Cl2中于500MHz記錄的化合物I的核磁共振譜。以在δ5.32的溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，以TMS零ppu為標(biāo)準(zhǔn)，用ppu來表示化學(xué)位移。僅注明了診斷峰。
圖2于25℃在Varian Unity 400 NMR光譜儀上，CD2Cl2中于400MHz記錄的化合物II的核磁共振譜。以在δ5.32的溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，以TMS零ppu為標(biāo)準(zhǔn)，用ppu來表示化學(xué)位移。僅注明了診斷峰。
圖3于25℃在Varian Unity 300 NMR光譜儀上，CD2Cl2中于300MHz記錄的化合物III的核磁共振譜。以在δ7.24的溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，以TMS零ppu為標(biāo)準(zhǔn)，用ppu來表示化學(xué)位移。僅注明了診斷峰。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及一種獨特結(jié)構(gòu)的新化合物。本發(fā)明還涉及在Nodulisporium種或其變異體的發(fā)酵培養(yǎng)基中制備本發(fā)明化合物的新方法。
本發(fā)明的化合物具有下列結(jié)構(gòu) 化合物1 化合物2 化合物3上述結(jié)構(gòu)式未在特定的位置描述確定的立體化學(xué)，而在其他特定的位置描述了具體的立體化學(xué)，應(yīng)將本發(fā)明解釋為包括了所有上述的立體異構(gòu)體。具體地說，可將在不同不對稱中心的立體異構(gòu)體定向為分別在上述分子一般平面下或上的α或β代表的上述基團。
發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明化合物在治療和/或預(yù)防因寄生蟲，例如節(jié)肢動物寄生蟲，蜱，虱，蚤，以及在家畜和家禽中的其他咬嚙昆蟲，例如，Tenophalides，硬蜱，瘙螨，綠蠅和Hemotobia而引起的疾病中作為抗寄生蟲劑的主要應(yīng)用。它們在治療包括人的其他動物中發(fā)生的寄生蟲病方面也是有效的。為了達到最佳結(jié)果而使用的最佳劑量當(dāng)然要取決于被治療動物的種類和寄生蟲感染或侵染的類型及嚴(yán)重程度。通常，通過口服約0.001到約100mg/kg動物體重的我們的新化合物會得到好的結(jié)果，所述總劑量可以一次或在相對短的時間，例如1-5天內(nèi)分幾次劑量給藥。用本發(fā)明的新化合物，通過以約0.025到約50mg/kg體重的單次劑量施用會極好地控制動物中的所述寄生蟲。在需要抵御重復(fù)感染時要進行重復(fù)治療，而且所述的重復(fù)治療取決于寄生蟲種類和所用的飼養(yǎng)技術(shù)。將這些物質(zhì)施用給動物的技術(shù)是獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。
本發(fā)明化合物對于抗家庭的害蟲，例如蟑螂，Blatella sp.，螞蟻，火蟻、衣服蠹，蛾，毯子甲蟲，毛蠹，和家蠅也是有效的。
本發(fā)明化合物對于抗貯存糧食中的昆蟲害蟲，例如谷盜，粉蟲和農(nóng)作物害蟲例如蜘蛛螨(Tetranychus sp.)，蚜蟲，長管蚜，遷移直翅目，例如飛蝗和以植物組織為生的不成熟階段的昆蟲也是有用的。所述化合物對于用于控制農(nóng)業(yè)中重要的土壤線蟲和植物寄生蟲，例如根瘤線蟲的殺線蟲劑是有用的。
可以經(jīng)口以單位劑量形式，例如膠囊，藥團或片劑，或作為活性成分通常在水中與懸浮劑，例如膨潤土和潤濕劑等賦形劑一起的溶液，懸浮液或分散劑的獸用頓服藥施用本發(fā)明的化合物。通常獸用頓服藥還含有一種抗泡劑。獸用頓服藥制劑通常含有約0.001到約1.0％重的活性化合物。優(yōu)選的獸用頓服藥制劑可含有約0.01到0.1％重的活性化合物。膠囊和藥團含有與載體例如淀粉，滑石，硬脂酸鎂或磷酸二鈣混合的活性成分。
若需要施用干燥，固體單位劑量形式的本發(fā)明化合物，則通常施用含有所需量本發(fā)明化合物的膠囊、藥團或片劑。通過均勻或不均勻地將所述活性成分與適宜的良好分散的稀釋劑，填充劑，崩裂劑和/或粘合劑，例如淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸鎂、植物膠等混合而制備這些劑量形式。所述的單位劑量形式根據(jù)例如待治療的宿主動物類型，感染的嚴(yán)重性和類型以及宿主的體重，隨其總重量和抗寄生蟲劑的含量可以有很大的變化。
若經(jīng)動物的食料施用本發(fā)明的化合物，則將所述化合物不均勻地分散在飼料中或灑在飼料上或以然后可加到拌好的飼料中的顆粒形式使用或單獨飼喂。另外，可以不經(jīng)腸地，例如經(jīng)芻內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)或皮下注射將本發(fā)明的抗寄生蟲化合物施用給動物，在所述的皮下注射中，將活性成分溶解或分散在液體載體中。對于不經(jīng)腸施用來說，將活性物質(zhì)與可接受的載體，優(yōu)選與各種植物油，例如花生油，棉花籽油等適宜地混合。也可以使用其他不經(jīng)腸載體，例如利用solketal，甘油的有機制品，有效和含水的不經(jīng)腸制劑。將本發(fā)明化合物溶解或懸浮在不經(jīng)腸制劑中用于施用；所述制劑通常含有約0.55％到約5％重的本發(fā)明化合物。
若將本文所述的化合物作為動物飼料的成分施用，或溶解或懸浮在飲用水中，則提供組合物，其中將活性化合物不均勻地分散在惰性載體或稀釋劑中。惰性載體指與抗寄生蟲劑不發(fā)生反應(yīng)并可以安全地施用給動物的那些。優(yōu)選的，用于飼喂施用的載體是即為或可以為動物食物的那些。
適宜的組合物含有飼料預(yù)混合物或補充物，其中本發(fā)明化合物以相對大的數(shù)量存在，而且所述飼料預(yù)混合物或補充物適于直接飼喂給動物或直接或在過渡的稀釋或混合步驟后加入到飼料中。適用于所述組合物的典型載體或稀釋劑包括例如，干酒糟，玉米粉，柑橘粉(citrusmeal)發(fā)酵殘留物，磨碎的貝殼，小麥細麩子，糖蜜可溶物(molassessolubles)，玉米穗軸粉，可食的豆粉飼料feed，soya grits，碎的石灰石等。通過例如研磨，攪拌，碾碎或磨滾方法將本發(fā)明的化合物不均勻地完全分散在載體中。含有約0.005％到約2.0％重本發(fā)明化合物的組合物特別適于作為飼料預(yù)混物。直接飼喂給動物的飼料補充物含有約0.0002％到約0.3％重的本發(fā)明化合物。
將所述補充物以治療和控制寄生蟲疾病所需的活性化合物濃度的量加入動物飼料中以得到加工好的飼料。盡管所需的本發(fā)明化合物的濃度將隨上述因素以及所用的特定化合物而不同，但是通常以在飼料中約0.001％到約0.2％的濃度飼喂本發(fā)明的化合物以達到所需的抗寄生蟲效果。
另外，若將所述化合物加到動物飼料中，則可以使用來自發(fā)酵液的干菌絲餅。菌絲含有較大的活性而且由于可以確定菌絲的活性水平，因此可將其直接加到動物飼料中。
本發(fā)明化合物可用于抗在作物生長或貯存時使其遭受損壞的農(nóng)業(yè)害蟲。利用如噴霧，噴粉，乳化等已知的技術(shù)應(yīng)用本發(fā)明的化合物于正在生長的或貯存中的作物以便使其抵御所述的農(nóng)業(yè)害蟲。
通過將飼料、單一化合物樣品、所述化合物的混合物、濃縮的提取物等口服施用給用適當(dāng)?shù)募纳x已經(jīng)感染了3天的小鼠，來確定本發(fā)明化合物的抗寄生蟲活性。在開始給藥后的11，12和13天，檢測小鼠糞便中的卵，在接下來的一天殺死小鼠，確定在小腸鄰近部分中的蟲數(shù)。與感染的未給藥控制的對照相比卵和蟲計數(shù)明顯減少時，觀察活性化合物。
通過發(fā)酵真菌屬Nodulisporium的菌株而制備本發(fā)明的新化合物。一種所述的培養(yǎng)物是在Merck and Co.，Inc.，Rahway，New Jersey培養(yǎng)物保藏中心的MF-5954。MF-5954的生產(chǎn)菌株已成為位于12301Parklawn Drive，Rockville，Md.20852的美國典型培養(yǎng)物保藏中心的的永久保藏品，保藏號為74245。根據(jù)用于專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約，于1993年9月21日完成了保藏。Nodulisporium種MF-5954的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征如下
用Bill和Polishook(1991)的表面滅菌法從木本植物組織中分離稱為JP337的MF-5954(生產(chǎn)L-954，967)(一種植物內(nèi)生真菌)。在下列描述中，用大寫字母開頭的顏色名稱來自Ridgway(1972)。
于25℃，50％相對濕度培養(yǎng)6天并經(jīng)12小時的熒光光照期后，在玉米粉瓊脂(Difco)上得到直徑為42mm的菌落。Colony mat在瓊脂表面內(nèi)生長，表面緊貼粘結(jié)在一起，完全無色；沒有滲出物和可溶的色素；背面無色；有甜的芳香的氣味。
在相同的條件下6天后，在燕麥粉瓊脂(Difco)上得到直徑為42mm的菌落。Colony mat緊貼，呈零星的棉狀，菌落中心呈棕黃色(MarsYellow，Raw Sienna)，中部到邊緣呈淡棕黃色(Light Orange，AntimonyYellow)；邊緣完整，白色；沒有滲出物，氣味和可溶色素；背面呈淡棕色。
在相同的條件下培養(yǎng)6天后，在馬鈴薯-蔗糖瓊脂(Singleton等人，1992)上得到直徑為43mm的菌落。Colony mat緊貼，呈零星的棉狀，中心為紅棕色(Light Russet-Vinaceous)逐漸變淡，在邊緣透明，邊緣不清楚；沒有滲出物，氣味和可溶的色素；背面紅棕色(DarkVinaceous)。
于37℃在玉米粉瓊脂上，黑暗中，6天后得到直徑為82mm菌落；除mat緊貼的接種點外，Colony mat完全呈棉狀，白色；邊緣完整，白色；沒有滲出物和可溶色素；背面不能著色；有甜的芳香氣味。
菌絲透明呈淡棕色，有隔膜，壁光滑稍有些粗糙，厚壁，2.5-3.5μm厚。分生孢子梗，單絲狀，豎直的，150-400×3.0-4.0μm，青霉?fàn)罘种?，透明呈淡棕色，有隔膜，厚壁，光滑較粗糙，多疣，有時有橄欖色的圓的突出(直徑2.5μm)。產(chǎn)分生孢子(conidiogenous)細胞是全裂的，末端分生，16-24×1.5-2.0μm，較粗糙，多疣，柱狀，頂部不規(guī)則。分生孢子倒卵形到長橢圓-橢圓，帶有截斷的附著點，4.1-5.7×1.6-2.5μm，透明，沒有隔膜，薄壁，從分生細胞的頂部合軸產(chǎn)生，積累為頂部的簇或小齒。
將MF-5954分在真菌屬Nodulisporium(Hyphonycetes，Deuteromycotina)中。該屬的關(guān)鍵分類性狀包括典型分枝并合軸產(chǎn)生分生孢子的單絲狀分生孢子。另外，由于產(chǎn)生豐富的分生孢子，分生孢子攜帶區(qū)在末端或居中的而且有球結(jié)(Jong和Rogers，1972)。這些特征將Nodulisporium屬與其他相似的真菌，例如GeniculosporiumZylocladium和Ustilina區(qū)別開來。這些屬是許多xylariaceous(Ascomyxotina)真菌，例如Hypoxylon，Xylaria，Rosellinia等的無性(變形)狀態(tài)。
與Nodulisporium的大多數(shù)分離物不同，MF-5954于37℃生長良好，但在培養(yǎng)基中未表現(xiàn)出與一已知種相關(guān)的任何其他區(qū)別特征。因此，將其稱為Nodulisporium種。引述的文獻1.Bills，G.F.and Polishook，.J.D.1991.“Microfungi from Carpinuscaroliniana”.，Can.J.Bot.69(7)1477-1482.2.Jong，S.C.and Rogers，J.D.1972.“Illustrations and descriptions ofconidial states of some Hypoxylon species”.Wash.State Agric.Exp.Sta.Tech.Bull.No.71.51p.3.Ridgway，R.1912.Color standards and color nomenclature，publ.by theauthor，Washington，D.C.43p.+53pl.4.Singleton，L.L，Mihail，J.D.and Rush，C.M.(Eds).1992.Methods forresearch on soilborne phtopathogenic fungi，appendix A，p.247.APS Press，St.Paul，Minnesota.
用Nodulisporium種的生產(chǎn)菌株在下文所述的條件下，于適宜固體或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的需氧發(fā)酵期間生產(chǎn)本發(fā)明化合物。例如用于生產(chǎn)許多抗生素物質(zhì)的液體和固體培養(yǎng)基均適于在這些多環(huán)化合物的生產(chǎn)過程中使用。
所述營養(yǎng)培養(yǎng)基含有可由微生物吸收的碳和氮源以及通常低水平的無機鹽。另外，發(fā)酵培養(yǎng)基可含有微生物生長及生產(chǎn)所需化合物所必需的痕量金屬。這些物質(zhì)常常以足夠的濃度存在，于復(fù)合碳和氮源中，可作為營養(yǎng)源，當(dāng)然如果需要可分別加到所述培養(yǎng)基中。通常，如糖的碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，乳糖，右旋糖，cerelose，玉米粉，燕麥粉等以及淀粉是營養(yǎng)培養(yǎng)基中適宜的可吸收碳源。在培養(yǎng)基中所利用的碳源的精確量部分取決于培養(yǎng)基中的其他組分，但發(fā)現(xiàn)碳水化合物的量通常在1到150g/l培養(yǎng)基是令人滿意的?？梢允褂眠@些碳源中的一種或?qū)?shù)種碳源在相同的培養(yǎng)基中結(jié)合使用。
各種氮源，例如酵母水解產(chǎn)物，酵母自溶產(chǎn)物，酵母細胞，番茄膏，玉米粉，燕麥粉，大豆粉，酪蛋白水解產(chǎn)物，酵母提取物，玉米漿，酒糟，棉籽粉，肉提取物等在本發(fā)明化合物的生產(chǎn)中很容易為Nodulisporium種所吸收。各種氮源可以以1到5g/l培養(yǎng)基的量單獨或結(jié)合使用。
可摻入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)無機鹽是能夠產(chǎn)生鈉，鉀，鎂，銨，鈣，磷酸鹽，硫酸鹽，氯，碳酸鹽等離子的常規(guī)鹽。培養(yǎng)基中還包括了痕量的金屬，例如鐵，鋅，錳，銅，硼，鉬等。
應(yīng)注意到，下文和實施例中描述的培養(yǎng)基僅僅是為了說明可使用的各種的培養(yǎng)基，而不是為了進行限制。
下列是適于生長Nodulisporium種MF-5954，ATCC 74245菌株的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基的組分酵母提取物 4g麥芽提取物 10g葡萄糖 4gBacto Agar 20g蒸餾水 1000mlpH 7.0接種和生產(chǎn)培養(yǎng)基的組分接種培養(yǎng)基組分 g/L酵母提取物4.0麥芽提取物8.0葡萄糖4.0Junlon1.5用蒸餾水制備所述培養(yǎng)基，滅菌前將pH調(diào)到7.0，以每250ml未分隔的Erlenmeyer燒瓶50ml的量分開。用棉花密封。于121℃滅菌20分鐘。
生產(chǎn)培養(yǎng)基1固體部分將1250cc蛭石加到4L旋轉(zhuǎn)瓶中。用乳膠塞子塞上；于60℃高壓滅菌，再加上30分鐘的干燥。2液體部分組分 g/L葡萄糖150.0脲4.0NZ A型胺 4.0K2HPO40.5MgSO4·7H2O 0.25KCl0.25ZnSO4·7H2O 0.9CaCO316.5用蒸餾水制備所述培養(yǎng)基(不用調(diào)pH)。將其以425ml/1LErlenmeyer燒瓶分開。用棉塞塞上，于121℃將培養(yǎng)基滅菌15分鐘。
生產(chǎn)培養(yǎng)基組分 (g/l)甘油75.0葡萄糖 10.0Ardamine PH 5.0(NH4)2SO4 2.0
大豆粉5.0番茄膏5.0檸檬酸鈉 2.0用蒸餾水制備所述培養(yǎng)基，在滅菌前，將pH調(diào)到7.0。將培養(yǎng)基以50ml/250ml未分隔的Erlenmeyer燒瓶分開。用棉花將燒瓶塞上然后于121℃將其滅菌20分鐘。
使用Nodulisporium種的發(fā)酵可以在約20℃到約40℃的溫度完成。為了達到最佳結(jié)果，最方便的是在約22℃到約36℃的范圍內(nèi)完成發(fā)酵。約22℃到約27℃的溫度是最佳的。生產(chǎn)本發(fā)明化合物的適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH為約6.5到約8.0，優(yōu)選的范圍在約6.8到約7.3。
通過將適宜量的營養(yǎng)培養(yǎng)基放在燒瓶中利用已知滅菌技術(shù)滅菌，用Nodulisporium種的孢子或營養(yǎng)細胞培養(yǎng)物接種燒瓶，用棉花松松地將燒瓶塞上，然后在95到300rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩儀上于約25℃的恒定室溫發(fā)酵約7到35天來完成小規(guī)模的發(fā)酵。對于進行大規(guī)模生產(chǎn)來說，有效地是在備有攪拌器和使發(fā)酵培養(yǎng)基通氣的裝置的適宜罐中完成發(fā)酵。在罐中制備營養(yǎng)培養(yǎng)基，滅菌后用Nodulisporium種的營養(yǎng)細胞培養(yǎng)物接種。使發(fā)酵在約22℃到約27℃持續(xù)7到25天，同時攪拌和/或使?fàn)I養(yǎng)培養(yǎng)基通氣。通氣的程度取決于幾個因素，例如發(fā)酵罐的大小，攪拌的速度等。通常在進行較大規(guī)模的發(fā)酵時，以約95到約300rpm和約50到約500L/分(LPM)的空氣攪拌。
用溶劑抽提和使用各種層析技術(shù)及溶劑系統(tǒng)的層析分級分離從全部的發(fā)酵液中分離本發(fā)明的化合物并回收所述的化合物。
本發(fā)明化合物在水中溶解性很小，但是溶于有機溶劑?？梢院芊奖愕乩迷撎匦詮陌l(fā)酵液中回收所述的化合物。因此，在一種回收方法中，將全部的發(fā)酵液與約等體積的有機溶劑混合。盡管可以使用任何有機溶劑，但，優(yōu)選的是使用水不混溶的溶劑，例如，乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿等。通常需要抽提數(shù)次以達到最佳的回收。溶劑提出了本發(fā)明化合物和沒有本發(fā)明抗寄生蟲活性的其他物質(zhì)。如果溶劑是水不混溶的，則會分層，在減壓條件下濃縮有機溶劑。將殘留物放在優(yōu)選的含有硅膠的層析柱上。所述柱留下了所需的產(chǎn)物和一些雜質(zhì)，但是許多雜質(zhì)，特別是非極性雜質(zhì)可以通過。用中度的極性有機溶劑例如，二氯甲烷或氯仿，洗滌該柱以進一步除去雜質(zhì)，然后，用二氯甲烷或氯仿與優(yōu)選的丙酮，甲醇，和乙醇等有機溶劑中的一種的混合物洗滌。蒸發(fā)掉溶劑，利用含有硅膠，氧化鋁，離子交換樹脂，葡聚糖凝膠等作為層析介質(zhì)，以各種溶劑和溶劑的組合作為洗脫劑的柱層析，薄層層析，制備性的薄層層析等將殘留物再進行層析?？梢杂帽樱邏?，液體和制備性薄層層析檢測本發(fā)明化合物的存在并分離所述化合物。
使用前述的技術(shù)及本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的其他技術(shù)，可以提供含有本發(fā)明化合物的組合物。通過分析各層析組分的生物活性或物理-化學(xué)特性確定所需化合物的存在。通過詳細分析所述化合物的各種譜特征，特別是其核磁共振，質(zhì)譜，紫外光譜和紅外光譜已確定了這兩種化合物。
實施例11培養(yǎng)在瓊脂斜面上接種MF-5954，然后用于制備FVM(冷凍的營養(yǎng)菌絲)。將部分瓊脂斜面無菌轉(zhuǎn)移到種子培養(yǎng)基A(50ml 250ml未分隔的燒瓶)中。在直徑2-英寸旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以220rpm于25℃，85％的相對濕度(rh)培養(yǎng)3天以達到生物量。將部分生物量轉(zhuǎn)移到含有甘油的無菌小瓶中，然后冷凍(作為FVM)。在-75℃，終濃度為10-15％的甘油中保持。通過將1.0ml融解的初級FVM轉(zhuǎn)移到種子培養(yǎng)基中，然后在25℃，220rpm培養(yǎng)2-3天，并按上述冷凍而制備次級FVM。2 接種將冷凍的小瓶(FVM)融解到室溫，然后以0.5-1.0ml/50ml種子培養(yǎng)基接種MF-5954的種子培養(yǎng)物。使其在25℃，85％rh的旋轉(zhuǎn)振蕩器(220rpm)上生長2-3天。有時使用第二個階段的種子。到此，將1ml上述第一階段的接種物稀釋到50新鮮的種子培養(yǎng)基A中，然后于25℃，220rpm，85％rh培養(yǎng)24-30小時。3 生產(chǎn)生產(chǎn)培養(yǎng)基A的組分是固體底物的發(fā)酵培養(yǎng)基。將一份種子(18-24ml)加到425ml的生產(chǎn)培養(yǎng)基A中。使勁地旋轉(zhuǎn)該燒瓶以分散生物量。通過注入到含有1250立方厘米大顆粒蛭石的4L旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器中而將內(nèi)含物分開。將旋轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)含物振蕩和/或混合以確保均勻接種和覆蓋。將旋轉(zhuǎn)瓶水平于22-25℃，50-75％rh培養(yǎng)，在Wheaton旋轉(zhuǎn)器上以約4rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)19-28天以便在發(fā)酵培養(yǎng)基中得到次級代謝產(chǎn)物。
對大量的液體培養(yǎng)基進行檢測，以確定其是否生產(chǎn)了本發(fā)明化合物，以便將發(fā)酵更容易地擴大到大容器中。僅在少量所檢測的液體培養(yǎng)基中檢測到生產(chǎn)。使用液體生產(chǎn)培養(yǎng)基B。按上述接種種子培養(yǎng)物，然后于25℃85％rh在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以220rpm生長3天。用一份種子(1ml)接種含50ml的各生產(chǎn)燒瓶(2％接種量)。于25℃50％rh，在旋轉(zhuǎn)振蕩器(220rpm)上將燒瓶培養(yǎng)21-28天。
兩種生產(chǎn)方法在生產(chǎn)的產(chǎn)量方面基本上相等。但是，第二種方法(液體生產(chǎn)培養(yǎng)基B)有優(yōu)點，原因在于可以將其擴大到攪拌的容器中，以便可進行大量生產(chǎn)。固體生產(chǎn)方法(培養(yǎng)基A的旋轉(zhuǎn)瓶)擴大生產(chǎn)有困難。
從該培養(yǎng)基廣口容器(22L桶)也被用到生產(chǎn)本化合物中。實施例2純化和初步表征在100rpm旋轉(zhuǎn)器上各用650ml甲基乙基酮(MEK)將12個含有在培養(yǎng)基中生長了21天的培養(yǎng)物的2-升旋轉(zhuǎn)瓶抽提4小時。將提取物過濾，混合，真空下蒸發(fā)至干燥，得到8克的產(chǎn)物。將該物質(zhì)溶解在20ml二氯甲烷中，注到二氯甲烷∶甲醇為95∶5的800ml硅膠柱(E.Merck)上一柱體積的下列各種溶劑被用作洗脫劑95∶5，9∶1，3∶1，1∶1二氯甲烷∶甲醇。收集按生物量確定的在有最大活性的級分51-55中的40ml級分(Lucilia)。將級分混在一起，在真空下蒸發(fā)至干燥，重量為200mg。將該樣品溶解在8.5ml甲醇中，注到在甲醇中的Sephadex LH20柱(Pharmacia)上，以6.5ml/分的流速收集13ml級分。確定活性在級分41-50，集中這些級分，干燥，重量為90mg。將該物質(zhì)溶解在0.5ml甲醇中，在室溫于270nm監(jiān)測，以4ml/分的流速在EkaNobel C-18 HPLC柱(9.6mm×250mm)上注射兩次。所用的溶劑系統(tǒng)是含有0.1％TFA的70∶30的乙腈∶水，在第一次分離中活性物質(zhì)分離在級分26-27中，在第二次中分離在26-28中。用分析HPLC確定所述化合物的純度以1ml/分的流速，于40℃的Eka Nobel柱(4.6×250mmC-18)以及在數(shù)個溶劑系統(tǒng)中的TLC。在真空下濃縮集中的級分，用二氯甲烷抽提，干燥，得到4.8克的純產(chǎn)物(化合物1)。
來自上述硅柱的較后的級分也有生物活性的；將其混合，在真空下干燥，重量為1.4g。用甲醇將固體洗滌數(shù)次，含有與化合物1的UV光譜相似的成分。用該光譜學(xué)特性監(jiān)測進一步的純化步驟，最終證實了純化合物的生物活性。因此，在甲醇中的250ml Sephadex LH-20柱分離含有500mg重的甲醇溶液。這些混合的級分占了大部分重量。將所述物質(zhì)干燥，然后再溶于3ml甲醇中，在室溫，在用80-20乙腈-水(0.1％TFA)溶劑系統(tǒng)的制備性Zorbax C-18柱(22.5mm×250mm)，以8ml/分的流速注射1ml，在270nm進行UV檢測，收集8ml的流分。將分別來自三個組分的級分29混合在一起以得到化合物2，級分21-22含有化合物3。將兩個溶液進行濃縮，用乙酸乙酯抽提，用水洗滌，然后干燥。化合物2的重量為1.8mg，化合物3的為1.0mg。經(jīng)NMR和MS研究，兩種化合物均為化合物I的類似物。
在JEOL HX110質(zhì)譜儀上記錄快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜。用二硫蘇糖醇∶二硫赤蘚糖醇(20/80)的基質(zhì)得到FAB譜。以ultramark1960(Fomblin)為參照化合物，在以分辨率測量精確的質(zhì)量。重要的高分辨率數(shù)據(jù)如下所示?；衔?發(fā)現(xiàn)的 計算的 分子式 排列680.3891 680.3951 C43H53NO6+HM+H662.3790 662.3845 C43H51NO5+H680-H2O化合物2發(fā)現(xiàn)的計算的 分子式 排列695.3806 695.3822 C43H53NO7M+13C NMR數(shù)據(jù)于25℃，分別在Varian Unity400和500NMR分光計上于100和125MHz在CD2Cl2中記錄13C NMR譜。以四甲基硅烷(TMS)為零ppm給出化學(xué)位移的ppm值，使用在53.8ppm的溶劑峰為內(nèi)標(biāo)。化合物1(125MHz)198.0，172.6，162.0，154.7，154.6，140.8，140.0，138.4，135.9，134.0，125.9，125.1，122.7，122.0，121.8，117.5*，116.7，113.1，76.8，76.4*，75.3，73.9，72.6，58.2，56.1，48.0，47.8，45.2，39.1，32.3，32.0，30.1，29.9，27.8，26.0，25.7，24.7，23.5，19.6，18.1*，15.1，12.6，11.2ppm。43個碳原子與經(jīng)HR FAB-MS得到的分子式C43H53NO6一致?；衔?(100MHz)198.1，172.0，162.0，154.8，147.1，140.1，138.3，135.9，134.0，126.8，122.6，122.0，121.8，117.8*，116.7，113.2，106.9，76.6*，75.3，73.9，73.3，72.7，58.2，55.5，49.6，48.1，44.5，41.3，39.5，32.0，30.4，30.1，30.0，29.9，27.8，26.0，24.8，23.4，18.0*，17.7，16.7，15.3，12.5ppm。
43個碳原子與經(jīng)HR FAB-MS得到的分子式C43H53NO7一致。
在寬共振觀察到用*表示的碳。1H NMR數(shù)據(jù)在300，400或500MHz分光計記錄1H NMR譜。用溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，用在零ppm的TMS以ppm表示化學(xué)位移。化合物1(見圖1)(500MHz)δ0.96(3H，s)，1.07(3H，s)，1.12(3H，s)，1.14(3H，s)，1.31(3H，s)，1.33(3H，s)，1.42(3H，s)，～1.46(3H，br.s)，1.96(3H，d，J＝1Hz)，2.32(1H，dd，J＝11，14Hz)，2.75(1H，dd，J＝6.5，14Hz)，2.81(1H，dd，J＝3，6.0Hz)，2.85(1H，m)，3.43(1H，m)，4.96(1H，br.s)，5.09(1H，s)，5.20(1H，br.s)，5.22(1H，d，J＝6.0Hz)，5.95(1H，d，J＝15Hz)，6.06(1H，d，J＝3Hz)，6.40(1H，dd，J＝11，15Hz)，7.33(1H，br.d，J～11Hz)，7.71(1H，s).
化合物2(見圖2)(400MHz)δ0.95(3H，s)，1.07(3H，s)，1.122(3H，s)，1.126(3H，s)，1.31(3H，s)，1.34(3H，s)，1.42(6H，s)，1.73(1H，dd，J＝9.5，12.5Hz)，1.86(3H，d，J＝1.5Hz)，2.34(1H，br.dd，J＝7.5，12.5Hz)，2.36(1H，dd，J＝11，14Hz)，2.78(1H，dd，J＝6.5，14Hz)，2.81(1H，dd，J＝3，6.5Hz)，2.93(1H，m)，4.88(H，br.q.J～8Hz)，5.00(1H，br.s)，5.10(1H，s)，5.20(1H，dq，J～1Hz)，5.21(1H，d，J＝6.5Hz)，6.06(1H，d，J＝3Hz)，6.93(1H，dq，J＝8，1.5)，7.72(1H，s).
化合物33(見圖3)(300MHz)δ0.91(3H，s)，1.05(3H，s)，1.09(3H，s)，1.11(3H，d，J～7.5Hz)，1.13(3H，s)，1.33(3H，s)，1.34(3H.s)，1.47(3H，s)2.30(1H，dd，J＝10.5，13.5Hz)，2.72(1H，dd，J＝6.5，13.5Hz)，2.87(1H，dd，J＝3，6.0Hz)，4.00(1H，dd.J＝2.5，10.5Hz)，4.58(1H，m)，5.02(1H，br.s)，5.07(1H，s)，5.17(1H，br.s)，5.23(1H，d，J＝6.0Hz)，6.02(1H，d，J＝3Hz)，7.67(1H，s).
Abbreviationss＝單峰，d＝雙重峰，q＝四重峰，br＝寬峰，m＝多重峰，J＝1H-1H用赫茲表示偶合常數(shù)(±0.5Hz，～＝近似地)。
權(quán)利要求
1.具有式 或 的化合物。
2.制備權(quán)利要求1化合物的方法，包括在碳，氮源和痕量元素源的培養(yǎng)基中發(fā)酵Nodulisporium sp.MF-5954生產(chǎn)菌株，然后分離所述化合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述菌株是Nodulisporium sp.MF-5954，ATCC 74245。
4.治療動物寄生蟲感染的方法，包括用有效量權(quán)利要求1的化合物治療寄生蟲感染的動物。
5.用于治療動物寄生蟲感染的組合物，含有惰性載體和權(quán)利要求1的化合物。
6.治療植物或植物作物寄生蟲感染的方法，包括給植物或其生長的土壤施用有效量的權(quán)利要求1的化合物。
7.用于治療植物寄生蟲感染的組合物，含有惰性載體和權(quán)利要求1的化合物。
8.能夠制備權(quán)利要求1的化合物的Nodulisporium sp.MF-5954的生物純培養(yǎng)物。
9.權(quán)利要求8的生物純培養(yǎng)物是Nodulisporium sp.MF-5954，ATCC74245。
全文摘要
本發(fā)明公開了由Nodulisporium屬菌株發(fā)酵得到的具有式I-Ⅲ的新化合物。所述化合物是高潛力的體外殺寄生蟲，抗寄生蟲及殺昆蟲劑。
文檔編號A61K31/40GK1137796SQ9419452
公開日1996年12月11日 申請日期1994年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月1日
發(fā)明者A·W·唐布勞斯基, R·G·恩德里斯, G·L·赫爾姆斯, O·D·亨森斯, J·G·安迪卡, D·A·奧斯林, J·D·波利索克, D·L·辛克 申請人:麥克公司