一種阿維菌素人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種阿維菌素人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的阿維菌素人工抗原為將式I所示的阿維菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。本發(fā)明所提供阿維菌素人工抗原合成方法簡(jiǎn)單，純度高和產(chǎn)率高，對(duì)于阿維菌素抗體的制備，以及阿維菌素藥物殘留檢測(cè)具有重大價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種阿維菌素人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種阿維菌素人工抗原及其制備方法與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿維菌素是一種廣譜高效的抗寄生蟲(chóng)藥物，獸醫(yī)臨床上廣泛用于動(dòng)物體內(nèi)外寄生 蟲(chóng)的防治。但是，阿維菌素類藥物主要作用于神經(jīng)肌肉接頭，具有潛在的神經(jīng)毒性，且脂溶 性強(qiáng)，在動(dòng)物體內(nèi)的殘留超過(guò)35天，世界衛(wèi)生組織將其歸為高毒化合物。阿維菌素酶聯(lián)免疫 試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品檢測(cè)。
[0003] 目前，獸藥殘留檢測(cè)常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用等理化 分析方法。雖然這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也 不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫化學(xué)分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特的優(yōu) 勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在 阿維菌素的殘留檢測(cè)中起著越來(lái)越重要的作用。
[0004] 影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定于 免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分 子獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種阿維菌素人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的阿維菌素人工抗原是在阿維菌素半抗原的基礎(chǔ)上構(gòu)建所得的抗 原。
[0007] 所述阿維菌素半抗原屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其結(jié)構(gòu)如式I所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了制備所述阿維菌素半抗原的方法。
[0010] 本發(fā)明所提供的制備所述阿維菌素半抗原的方法，具體可包括如下A-C的步驟：
[0011] A.按照包括如下步驟(1 )_(5)的方法制備中間體1:
[0012] (1)將阿維菌素溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入咪唑，混合，得到I液；
[0013] 其中，所述阿維菌素、所述二甲基甲酰胺（DMF)和所述咪唑的配比為1 g : 6m 1: 〇.47g；
[0014] (2)將叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2SiCl)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，得到II液；
[0015] 其中，所述叔丁基二甲基氯娃烷(t-BuMe2SiCl)與所述二甲基甲酰胺(DMF)的配比 為0·52g:2ml;
[0016] (3)將所述I液與所述11液混合，30 °C攪拌反應(yīng)2h，得至lj III液；
[0017] 其中，所述I液中的所述阿維菌素和所述II液中的所述叔丁基二甲基氯硅烷（t-BuMe2SiCl)的配比為 lg:0.52g;
[0018] 將所述I液與所述II液混合具體為:將所述II液逐滴加入到所述I液中。
[0019] (4)采用乙酸乙酯(EtoAc)對(duì)所述III液進(jìn)行萃取，分離乙酸乙酯層，MgS〇4干燥，減 壓濃縮，將所得濃縮物(微黃色粘稠物)溶解于二氯甲烷(CH2C12 )，得到IV液；
[0020] (5)將所述IV液進(jìn)行硅膠柱層析，采用的硅膠粒度為200-300目，洗脫液由體積比 為95:5的二氯甲烷(012(：12)、和甲醇(0130!〇混合而成，采用所述洗脫液進(jìn)行洗脫后收集符 合條件A的組分，然后進(jìn)行減壓濃縮，真空干燥(24h，避光），得到所述中間體1;
[0021] 所述符合條件A的組分為:在以體積比為95:5的二氯甲烷和甲醇的混合液作為展 開(kāi)劑，以粒度為300-400目的硅膠作為固定相的薄層層析中，比移值為Rf = 0.3的組分；
[0022] B.按照包括如下步驟(6)-(9)的方法由所述中間體1制備中間體2:
[0023] (6)將所述中間體1溶解于二氯甲烷(CH2C12)后，依次加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)、 三乙胺和琥珀酸酐，得到V液；
[0024] 其中，所述中間體1、所述二氯甲烷(CH2C12)、所述4-二甲氨基吡啶(DMAP)、所述三 乙胺和所述琥珀酸酐的配比為〇. 5g: 12ml: 0.28g: 0.45g: 0.92g;
[0025] (7)將所述V液于40°C水浴回流2.5h(溶液由無(wú)色變?yōu)樽厣?、黑色），減壓蒸干所述 二氯甲烷(CH2C12)，得到VI液；
[0026] (8)采用乙醚對(duì)所述VI液進(jìn)行萃取，過(guò)濾除去不溶物，分離乙醚層，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為3.6 %的HC1洗滌（2次），再用水洗滌（2次），然后用MgS〇4干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物 (淡黃色粘稠物)溶解于二氯甲烷(CH 2C12)，得至IjVII液；
[0027] (9)將所述VII液進(jìn)行薄層色譜分離，展開(kāi)劑由體積比為95: 5: 5的二氯甲烷 (CH2C12)、四氫呋喃(THF)和甲醇(CH30H)混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠，收集 比移值(Rf)為〇. 5的區(qū)帶，用由體積比為1:1的二氯甲烷(CH2C12)和甲醇(CH30H)混合而成的 淋洗液進(jìn)行淋洗，減壓濃縮，真空干燥(24h，避光），得到所述中間體2;
[0028] C.按照包括如下步驟(10)-( 14)的方法由所述中間體2制備所述化合物：
[0029] (10)將所述中間體2溶解于甲醇(CH30H)，得到VIII液；
[0030] 其中，所述中間體2與所述甲醇(CH30H)的配比為0.3g:17ml;
[0031] (11)將對(duì)甲苯磺酸溶解于甲醇(CH30H)，得到IX液；
[0032] 其中，所述對(duì)甲苯磺酸與所述甲醇(CH30H)的配比為0.26g:10ml;
[0033] (12)于20-25°C，將所述VIII液與所述IX液混合，攪拌反應(yīng)25min，40°C減壓濃縮得 到X液；
[0034] 其中，所述VIII液中的所述中間體2與所述IX液中的所述對(duì)甲苯磺酸的配比為 0.3g:0.26g;
[0035] 將所述VIII液與所述IX液混合具體為:攪拌下將所述IX液逐滴加入到所述VIII液 中。
[0036] (13)采用乙酸乙酯(EtoAc)對(duì)所述X液進(jìn)行萃取，先以2 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaH⑶3溶液 洗滌1次，再以水洗滌3次，然后用MgS04干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物溶解于二氯甲烷 (OfeCh)，得到 XI 液；
[0037] (14)將所述XI液進(jìn)行薄層色譜分離，展開(kāi)劑由體積比為90:9.5:0.5的二氯甲烷 (CH 2C12)、四氫呋喃(THF)和乙酸(HAc)混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠，收集比 移值(Rf)為0.3的區(qū)帶，用乙酸乙酯(EtoAc)進(jìn)行淋洗，減壓濃縮，真空干燥(24h，避光），得 到所述化合物。
[0038] 在阿維菌素半抗原的基礎(chǔ)上構(gòu)建所得的阿維菌素抗原也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 [0039]所述阿維菌素，為將所述阿維菌素半抗原(式I)與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述載體蛋白具體為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0040] 其中，所述阿維菌素半抗原(式I)與所述載體蛋白偶聯(lián)的摩爾比為8.14:1。
[0041] 所述阿維菌素抗原的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042] 所述阿維菌素抗原的制備方法，具體可包括如下步驟:將所述阿維菌素半抗原(式 I)與載體蛋白通過(guò)酰胺鍵偶聯(lián)，獲得所述阿維菌素抗原。
[0043] 在本發(fā)明中，所述阿維菌素抗原具體是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：
[0044] (al)將所述阿維菌素半抗原(式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，20-25°C磁力攪 拌反應(yīng)3h，得到溶液I;
[0045] 其中，所述阿維菌素半抗原(式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)、所述N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的配比為43.6mg: 1.5ml：26mg：25mg；
[0046] (a2)將所述載體蛋白置于0.1M碳酸緩沖液中，4000rpm攪拌10mn，充分溶解，得到 溶液II;所述〇. 1M碳酸緩沖液的pH為9.6，溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:碳酸鈉0. lmol/L，碳 酸氫鈉〇. lmol/L;所述載體蛋白與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為5〇-67mg: 3.5ml;
[0047] 其中，若所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)，則所述牛血清白蛋白（BSA)與所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為50mg:3.5ml;若所述載體蛋白為卵清蛋白（0VA)，則所述卵清蛋白 (0VA)與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為67mg: 3.5ml;
[0048] (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件B進(jìn)行混合，混合后后于20_25°C磁力攪 拌反應(yīng)24h，得到溶液III;
[0049] 所述條件B為:所述溶液I中的所述阿維菌素半抗原(式I)與所述溶液II中的所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為43.6mg: 3.5ml;
[0050] 其中，將所述溶液I和所述溶液II混合，具體為在4°C條件下，將所述溶液I逐滴加 入到所述溶液Π 中，邊加邊攪拌；
[0051 ] (a4)用磷酸鹽緩沖液(0.01M ros，pH = 7.4)，于4°C對(duì)所述溶液III攪拌透析3天， 得到所述阿維菌素抗原;所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、 氯化鈉和氯化鉀;所述磷酸二氫鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為〇. 27g/L，所述磷酸氫二 鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.42g/L，所述氯化鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為 8g/L，所述氯化鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.2g/L;所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。
[0052]所述阿維菌素半抗原(式I)或所述阿維菌素抗原在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0053] (a)定性或定量檢測(cè)阿維菌素；
[0054] (b)制備阿維菌素抗體。
[0055]利用所述阿維菌素抗原制備的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050 ]所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體或抗血清。
[0057] 本發(fā)明所提供的阿維菌素半抗原，以及所述阿維菌素抗原，合成方法簡(jiǎn)單，純度高 和產(chǎn)率高，對(duì)于阿維菌素抗體的制備，以及阿維菌素藥物殘留檢測(cè)具有重大價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0058] 圖1為阿維菌素半抗原4〃-〇_succinoylAVM的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
[0059]圖2為BSA的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
[0060]圖3為阿維菌素抗原"阿維菌素半抗原+BSA"的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0061 ]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0062]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0063]阿維菌素:百靈威科技有限公司，其產(chǎn)品編號(hào)為P-615N。
[0064]實(shí)施例1、阿維菌素半抗原的制備及結(jié)構(gòu)鑒定
[0065] 一、阿維菌素半抗原的制備
[0066] 1、中間體5-〇-t-BuMe2Si-R-4"-OH的合成
[0067] (1)取1.0g阿維菌素(AVM)，加6mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合，得 到I液。
[0068] (2)取0.52g叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2SiCl)溶于2mL DMF，得到II液。
[0069] (3)機(jī)械攪拌所得I液，將所述II液逐滴加入，30 °C攪拌約2h，得到III液。
[0070] (4)向所述III液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)，混合，混合液用水洗滌(3次，每次 50mL)，分離EtoAc層，MgS04干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物(微黃色粘稠物)溶解于適量二氯 甲烷(CH2C12)，得到IV液。
[0071] (5)將所述IV液進(jìn)行硅膠柱層析，采用的硅膠粒度為200-300目，洗脫液由體積比 為95:5的二氯甲烷(01 2(：12)、和甲醇(0130!〇混合而成，洗脫時(shí)的流速為1~2滴/8，采用所述 洗脫液進(jìn)行洗脫后收集符合如下條件的組分:在以體積比為95:5的二氯甲烷和甲醇的混合 液作為展開(kāi)劑，以粒度為300-400目的硅膠作為固定相的薄層層析中，比移值為Rf = 0.3的 組分。然后減壓濃縮，真空干燥24h(避光），得到中間體5-〇-t-BuMe2Si-R-4〃-OH。
[0072] 2、中間體 5-〇-t_BuM2Si-R-4〃-〇-succinoyl的合成
[0073] (1)取步驟1 合成的中間體5-〇-t-BuM2Si-R-4"-OH 0 · 50g，加12mLCH2Cl2使其溶解， 依次加入0.28g二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，得到V液。
[0074] (2)將所述V液于40°C水浴回流2.5h，溶液由無(wú)色變?yōu)樽厣?、黑色（與反應(yīng)原料無(wú) 關(guān)），減壓蒸干CH2C12,得到VI液。
[0075] (3)向所述VI液中加入100mL乙醚，過(guò)濾除去不溶物后轉(zhuǎn)至250mL分液漏斗中，分離 乙醚層，先用l〇〇mL 3.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))此1洗滌2次，再用10〇1^水洗滌2次，然后用1^3〇4干 燥，減壓濃縮，將所得濃縮物(淡黃色粘稠物）以適量CH 2C12溶解，得到VII液。
[0076] (4)將所述VII液進(jìn)行薄層色譜(TLC)分離，展開(kāi)劑由體積比為95:5:5的二氯甲烷 (CH 2C12)、四氫呋喃(THF)和甲醇(CH30H)混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠。TLC 出現(xiàn)三條區(qū)帶，將中間最大的區(qū)帶（比移值Rf為0.5)刮下，用由體積比為1:1的二氯甲烷 (CH2C1 2)和甲醇(CH30H)混合而成的淋洗液進(jìn)行淋洗，減壓濃縮，真空干燥24h(避光），得到 所述中間體 5-o-t_BuM2Si-R-4〃-〇-succinoyl 〇
[0077] 3、阿維菌素半抗原4〃 -o-succinoy 1AVM的合成
[0078] (1)將步驟2合成的中間體5-〇-t-BuM2Si-R-4"-〇-succinoyl 0 · 30g加入到17mL甲 醇使其溶解，得到VIII液。
[0079] (2)將0.26g對(duì)甲苯磺酸溶于1 OmL甲醇，得到IX液。
[0080] (3)室溫（20-25°C )攪拌下，將所述IX液逐滴加入到所述VIII液中，繼續(xù)攪拌 25min，40 °C減壓濃縮得到X液。
[0081 ] (4)用80mL EtoAc將所述X液洗滌，轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中，先用40mL 2%(質(zhì)量分 數(shù))NaHC03溶液洗滌1次，再以80mL水洗滌3次，然后用MgS〇4干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物用 適量CH2C12溶解，得到XI液。
[0082] (5)將所述XI液進(jìn)行TLC分離純化，展開(kāi)劑由體積比為90 : 9.5 :0.5的二氯甲烷 (CH2C12)、四氫呋喃（THF)和乙酸(HAc)混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠，TLC顯 示三條區(qū)帶，將比移值Rf為0.3中間區(qū)帶刮下，EtoAc淋洗，減壓濃縮后真空干燥(避光)24h， 得到所述阿維菌素半抗原4〃-〇-succinoylAVM。
[0083] 反應(yīng)方程式如下：
[0085]二、阿維菌素半抗原的結(jié)構(gòu)鑒定
[0086] 結(jié)果如圖1所示，對(duì)步驟一所得4〃-〇_811(^;[1107]^\^[進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，]\1+:1+似= 995·5，Μ-:Μ-Η=971·5。
[0087] 結(jié)果顯示其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示，即為阿維菌素半抗原。
[0089] 實(shí)施例2、阿維菌素人工抗原的制備及結(jié)構(gòu)鑒定
[0090] 一、阿維菌素人工抗原的制備
[0091] 1、免疫原的合成
[0092] (1)將實(shí)施例1制備得到的半抗原（式1)43.61^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)3h，得到溶液I。
[0093] (2)稱取50mg牛血清白蛋白（BSA)，溶解于3.5mL 0· 1M碳酸緩沖液中，400rpm攪拌 lOmin，充分溶解，得到溶液II。
[0094]其中，所述0. 1M碳酸緩沖液的pH為9. 6,溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下： Na2C〇3l.59g/L，NaHC〇3 2.94g/L。
[0095] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )環(huán)境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)24h，得到溶液III。
[0096] (4)將所述溶液III裝入1個(gè)蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL 0.01M PBS(pH7.4) (配方:磷酸二氫鉀0.27g，磷酸氫二鈉1.42g，氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，加去離子水約800mL充 分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L，即為0.01M pH7.4PBS)透析3天，4 °C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產(chǎn)物4500rpm離心6min，0.5ml/管分裝，將抗原編 號(hào)，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0097] 2、包被原的合成
[0098] (1)將實(shí)施例1制備得到的半抗原（式1)43.61^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)3h，得到溶液I。
[0099] (2)稱取67 · Omg卵清蛋白（0VA)，溶解于3 · 5mL 0 · 1Μ碳酸緩沖液pH = 9 · 6 (配方同 上）中，400rpm攪拌1 Omin，充分溶解，得到溶液II。
[0100] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C)環(huán)境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應(yīng)24h，得到溶液III。
[0101] (4)將所述溶液III裝入1個(gè)蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL 0.01M PBS(pH7.4) (配方同上）透析3天，4°C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產(chǎn)物4500rpm離心6min， 0.5ml/管分裝，將抗原編號(hào)，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0102]二、阿維菌素人工抗原的鑒定
[0103] 如圖2、圖3所示，免疫原MALDI-T0F-MS鑒定結(jié)果顯示偶聯(lián)比為：1?=(74205.876-66291.676)/972.5 = 8.14。即免疫原中，所述阿維菌素半抗原(式I)與牛血清白蛋白（BSA) 偶聯(lián)的摩爾比為8.14:1。
[0104] 實(shí)施例3、阿維菌素人工抗原免疫動(dòng)物制備抗血清
[0105] 一、動(dòng)物免疫
[0106] 用步驟實(shí)施例2獲得的阿維菌素人工抗原"阿維菌素-BSA"作為免疫原免疫新西蘭 大白兔，每次免疫劑量為1〇〇~200!^，免疫方式為雙肩部和后大腿皮下多點(diǎn)注射，每個(gè)區(qū)域 大約用1/4的免疫原。首免時(shí)將免疫原用生理鹽水稀釋，然后與弗氏不完全佐劑進(jìn)行1:1(體 積比）混合制成乳化劑，每間隔2周取相同劑量免疫原加等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后 加強(qiáng)免疫一次，采用此方式共加免3次后，間隔3~4周再取相同劑量免疫原加弗式不完全佐 劑進(jìn)行末次免疫，耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。末次免疫7-10天后采用頸動(dòng)脈放血，每只兔子 可得血100-120ml左右，取完的血在4°C冰箱放置5~6小時(shí)，然后以5000rpm離心10min，分離 血清。
[0107] 二、抗血清效價(jià)測(cè)定
[0108] 采用間接ELISA法測(cè)定步驟一所得血清的抗體效價(jià)，具體如下：
[0109] 1)包被:在96孔酶標(biāo)板中加入1 OOyL濃度為2yg/mL的"阿維菌素-OVA"溶液(用包被 緩沖液進(jìn)行稀釋），同時(shí)設(shè)置不包被抗原的對(duì)照，4°C包被過(guò)夜，用PBS緩沖液洗滌3次。
[0110]包被緩沖液:PH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(溶劑為水，溶質(zhì)及其濃 度如下：Na2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0111] 2)封閉：加入150μ!7孔的封閉液，在37 °C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍干。置于4 °(：冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0112] 封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸鹽緩 沖液，PH7.4。
[0113] 3)加待測(cè)樣品：吸取不同稀釋度的待測(cè)血清100μΙ，加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板中，37°C孵 育30min，洗板4次，拍干。
[0114] 同時(shí)設(shè)置未經(jīng)免疫的兔血清的對(duì)照；以PBS代替待檢測(cè)樣品的對(duì)照（陰性對(duì)照孔）。
[0115] 4)加酶標(biāo)二抗:取HRP標(biāo)羊抗兔IgG抗體(Jackson ImmunoResearch公司，貨號(hào)111-035-003)，按體積比1:5000倍稀釋后，100μΙ/孔，37°C孵育20至30min，洗滌4次，拍干。
[0116] 5)顯色:將 20 X TMB 稀釋至1 X TMB，按100μΙ/孔加入，37 °C 顯色 15-30min。
[0117] 6)終止:加入終止液(2M H2S〇4)50yl/孔。
[0118] 7)讀數(shù)：以450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔0D值，以與陰性對(duì)照孔（以PBS代替待測(cè)樣品的對(duì) 照)0D值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為血清效價(jià)的臨界點(diǎn)。
[0119] ELISA結(jié)果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀釋倍數(shù)表示。
[0120] 結(jié)果表明血清中的抗體效價(jià)為1:16000。
[0121] 實(shí)施例4、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿維菌素
[0122] -、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝
[0123] 1、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的組成包括如下：
[0124] (1)阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品工作液:6瓶，1.5mL/瓶，濃度為0ng/ml、0.5ng/ml、l .5ng/ml、 4.5ng/ml、13·5ng/ml、40·5ng/ml;
[0125] ⑵阿維菌素酶標(biāo)板：1塊(8孔X 12條），為包被了實(shí)施例2制備得到的"阿維菌素-0VA"的酶標(biāo)板。
[0126] (3)酶標(biāo)記物稀釋液：1瓶(1 OmL)，為PBS。
[0127] (4)酶標(biāo)記物工作液：1瓶（11 X，lmL)，其中酶標(biāo)記物具體為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的 抗阿維菌素的抗體，所述抗體為實(shí)施例3制備得到的抗血清。
[0128] (5)樣品稀釋液：1 瓶(50ml)，為0.1M ρΗ7·4的PBS。
[0129] (6)洗滌液：1 瓶（20Χ，25mL)，為0.01mol/L ρΗ7·4的PBST溶液。
[0130] (7)底物Α液、底物Β液各1瓶(7mL)。其中，底物Α為2%過(guò)氧化脲水溶液。底物Β為1 % 四甲基聯(lián)苯胺水溶液。
[0131] (8)終止液：1瓶(7mL)，為2mol/L H2S〇4溶液。
[0132] (9)蓋板膜；
[0133] (10)自封袋。
[0134] 2、需要而未提供的設(shè)備和材料
[0135] (1)設(shè)備
[0136] 酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm)、漩渦振蕩器、離心機(jī)(4000g)、氮吹儀、 微量移液器、計(jì)時(shí)器。
[0137] (2)試劑
[0138] 25%甲醇緩沖液:準(zhǔn)確量取5mL甲醇和15mL樣品稀釋液，混勻備用。
[0139] 乙腈(分析純）、正己烷(分析純）。
[0140] 3、貯存
[0141] 該試劑盒貯存于2_8°C，切勿冷凍，有效期1年。
[0142] 未使用完的酶標(biāo)板條應(yīng)密封，2_8°C保存。
[0143] 4、試劑盒檢測(cè)原理
[0144] 樣品中的阿維菌素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)記物，通過(guò)酶催化底物 顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中阿維菌素的含量。含量少，顯色深;含量多，顯色淺。
[0145] 二、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法
[0146] 1、樣品前處理
[0147] (1)原奶方法一(稀釋系數(shù):2)
[0148] a)取lmL新鮮原奶于10mL離心管中，加入3mL甲醇，高速禍動(dòng)lmin;b)4000g離心 10min; c)取lmL上清于4mL離心管中，50 °C水浴中氮?dú)獯蹈?d)加入0.5mL 25 %甲醇緩沖液 (見(jiàn)步驟一2)，充分渦動(dòng)lmin;e)取50yL進(jìn)行檢測(cè)。
[0149] (2)原奶方法二(稀釋系數(shù):10)
[0150] a)取lmL新鮮原奶于10mL離心管中，加入3mL甲醇，充分禍動(dòng)lmin;b)4000g離心 10min; c)取300yL上清液于新的離心管中，加入600yL樣品稀釋液，充分禍動(dòng)lmin; d)取50yL 進(jìn)行檢測(cè)。
[0151] (3)雞肉、豬肉、雞肝(稀釋系數(shù):4)
[0152] a)準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)后的組織樣品于50mL離心管中；b)依次加入3mL正己烷、 6mL乙腈，迅速逐一禍散后，高速禍動(dòng)lmin; c )4000g離心10min，棄去上層正己燒;d)取2.7mL 上清液于4mL離心管中，離心管中預(yù)先加入0.4g純化劑A和0.5g純化劑B，立即高速渦動(dòng) lmin;e)4000g離心5min;f)取lmL上清液于4mL離心管中，60°C水浴中氮?dú)獯蹈?g)豬肉、雞 肉樣本:先加入250yL甲醇，禍動(dòng)5s后加入750yL樣品稀釋液;雞肝樣本:先加入150yL甲醇， 渦動(dòng)5s后加入850yL樣品稀釋液;h)高速渦動(dòng)lmin; i)取50yL進(jìn)行檢測(cè)。
[0153] 2、檢測(cè)步驟
[0154] (1)將板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，建議均做雙孔平 行，未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2_8°C環(huán)境中；
[0155] (2)將50yL各濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品工作液(或待測(cè)樣品溶液)分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo) 準(zhǔn)品(或待測(cè)樣品孔)中；
[0156] (3)在每孔中加入80yL酶標(biāo)記物工作液(見(jiàn)步驟1);
[0157] (4)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25 ± 2 °C )，避光反應(yīng) 40min；
[0158] (5)揭開(kāi)蓋板膜；
[0159] (6)倒掉板孔中液體，在每孔加入260yL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15-30s ；
[0160] (7)倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干；
[0161] (8)立即在每孔中加入lOOyL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按體 積1:1混合，必須充分混勾，混合液在5min內(nèi)使用，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑）；
[0162] (9)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25 ± 2 °C )，避光反應(yīng)10-15min；
[0163] (10)揭開(kāi)蓋板膜，在每孔中加入50yL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻；
[0164] (11)終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值。
[0165] 3、結(jié)果計(jì)算或判定
[0166] (1)各標(biāo)準(zhǔn)品（或待測(cè)樣品）的平均吸光度值，除以零標(biāo)(濃度為Ong/ml的標(biāo)準(zhǔn)品） 吸光度值，乘以1〇〇,可以得到各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
[0168] (2)以各標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光度值為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的阿維菌素濃度為橫坐標(biāo)繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0169] (3)將待測(cè)樣品的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可得出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的濃度， 再乘以相應(yīng)樣品的稀釋倍數(shù)，方得待測(cè)原樣品中阿維菌素的實(shí)際含量。
[0170] 三、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿維菌素
[0171] 1、特異性檢測(cè)
[0172] 阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性是通過(guò)與相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)來(lái)確 定的。交叉反應(yīng)越小，特異性越好。
[0173] 將阿維菌素及其它類似物(伊維菌素、埃普菌素、多拉菌素)分別做系列稀釋，分別 按照如上步驟二2進(jìn)行操作，以阿維菌素及其它類似物的系列稀釋液替代其中的"阿維菌素 標(biāo)準(zhǔn)品工作液"，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出各自50%抑制濃度（IC5Q)，具體方法如下： 得到縱坐標(biāo)數(shù)值等于50%對(duì)應(yīng)的阿維菌素濃度(ng/mL)，即IC5Q值。用下式計(jì)算試劑盒對(duì)阿 維菌素和各類似物的交叉反應(yīng)率。
[0175] 結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)各種類似物的交 叉反應(yīng)率均小于1%。這說(shuō)明阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)阿維菌素具有極高的特異性，可有 效的排除其它類似物的干擾，可專門用于阿維菌素的檢測(cè)。
[0176] 表1阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性
[0178] ~2、不同樣品的最低檢測(cè)限測(cè)定
[0179] 分別測(cè)定采用阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)原奶、雞肝、豬肉和雞肉中阿維菌素進(jìn) 行檢測(cè)時(shí)的最低檢測(cè)限。具體方法如步驟二。
[0180] 結(jié)果顯示，采用以上步驟二2(1)中的樣品前處理方法處理原奶，測(cè)得的最低檢測(cè) 限可達(dá)2ng/ml(即每ml原奶中含有2ng的阿維菌素即可被檢測(cè)到，下同）；采用以上步驟2(2) 中的樣品前處理方法處理原奶，測(cè)得的最低檢測(cè)限可達(dá)5ng/ml;采用以上步驟2(3)中的樣 品前處理方法處理雞肝、豬肉和雞肉，測(cè)得的最低檢測(cè)限可達(dá)2ng/g。
[0181] 3、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒板內(nèi)板間誤差的測(cè)定
[0182] 分別測(cè)定阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的板內(nèi)誤差和板間誤差。具體方法如步驟二。
[0183] 結(jié)果顯示，試劑盒吸光度的板內(nèi)誤差小于5%，板間誤差小于10%。
[0184] 4、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿維菌素的回收率測(cè)定
[0185] 測(cè)定采用阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿維菌素的回收率。具體方法如步驟二。 [0186]結(jié)果顯示，采用阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)阿維菌素的回收率范圍為90% ± 30% 〇
[0187] 5、阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度測(cè)定
[0188] 測(cè)定阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度。具體方法如步驟二。
[0189]結(jié)果顯示，阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度為0.5ppb，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0.5ppb-40 · 5ppb (注：ppb=yg/kg)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示：2. 制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，包括如下A-C的步驟： A. 按照包括如下步驟(1 )-(5)的方法制備中間體1: (1) 將阿維菌素溶解于二甲基甲酰胺，然后加入咪唑，混合，得到I液； 其中，所述阿維菌素、所述二甲基甲酰胺和所述咪唑的配比為lg:6ml:0.47g; (2) 將叔丁基二甲基氯硅烷溶解于二甲基甲酰胺，得到II液； 其中，所述叔丁基二甲基氯硅烷與所述二甲基甲酰胺的配比為〇. 52g: 2ml; (3) 將所述I液與所述11液混合，30 °C反應(yīng)2h，得到III液； 其中，所述I液中的所述阿維菌素和所述II液中的所述叔丁基二甲基氯硅烷的配比為 lg：0.52g； (4) 采用乙酸乙酯對(duì)所述III液進(jìn)行萃取，分離乙酸乙酯層，MgS04干燥，減壓濃縮，將所 得濃縮物溶解于二氯甲烷，得到IV液； (5) 將所述IV液進(jìn)行硅膠柱層析，采用的硅膠粒度為200-300,洗脫液由體積比為95:5 的二氯甲烷和甲醇混合而成，采用所述洗脫液進(jìn)行洗脫后收集符合條件A的組分，然后進(jìn)行 減壓濃縮，真空干燥，得到所述中間體1; 所述符合條件A的組分為:在以體積比為95:5的二氯甲烷和甲醇的混合液作為展開(kāi)劑， 以粒度為300-400目的硅膠作為固定相的薄層層析中，比移值為Rf = 0.3的組分； B. 按照包括如下步驟(6)-(9)的方法由所述中間體1制備中間體2: (6) 將所述中間體1溶解于二氯甲烷后，依次加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺和琥珀酸酐， 得到V液； 其中，所述中間體1、所述二氯甲烷、所述4-二甲氨基吡啶、所述三乙胺和所述琥珀酸酐 的配比為 0.5g:12ml:0.28g:0.45g:0.92g; (7) 將所述V液于40°C水浴回流2.5h，減壓蒸干所述二氯甲烷，得到VI液； (8) 采用乙醚對(duì)所述VI液進(jìn)行萃取，分離乙醚層，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6%的HC1洗滌，再 用水洗滌，然后用MgS04干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物溶解于二氯甲烷，得到VII液； (9) 將所述VII液進(jìn)行薄層色譜分離，展開(kāi)劑由體積比為95:5:5的二氯甲烷、四氫呋喃 和甲醇混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠，收集比移值為0.5的區(qū)帶，用由體積比 為1:1的二氯甲烷和甲醇混合而成的淋洗液進(jìn)行淋洗，減壓濃縮，真空干燥，得到所述中間 體2; C.按照包括如下步驟(10)-(14)的方法由所述中間體2制備所述化合物： (10) 將所述中間體2溶解于甲醇，得到VIII液； 其中，所述中間體2與所述甲醇的配比為0.3g: 17ml; (11) 將對(duì)甲苯磺酸溶解于甲醇，得到IX液； 其中，所述對(duì)甲苯磺酸與所述甲醇的配比為〇.26g: 10ml; (12) 于20-25°C，將所述VIII液與所述IX液混合，反應(yīng)25min，40°C減壓濃縮得到X液 其中，所述VIII液中的所述中間體2與所述IX液中的所述對(duì)甲苯磺酸的配比為0.3g: 〇.26g； (13) 采用乙酸乙酯對(duì)所述X液進(jìn)行萃取，先以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaHC03溶液洗滌，再以水 洗滌，然后用MgS0 4干燥，減壓濃縮，將所得濃縮物溶解于二氯甲烷，得到XI液； (14) 將所述XI液進(jìn)行薄層色譜分離，展開(kāi)劑由體積比為90:9.5:0.5的二氯甲烷、四氫 呋喃和乙酸混合而成，固定相是粒度為300-400目的硅膠，收集比移值為0.3的區(qū)帶，用乙酸 乙酯進(jìn)行淋洗，減壓濃縮，真空干燥，得到所述化合物。3. 阿維菌素抗原，為將權(quán)利要求1所述化合物與載體蛋白偶聯(lián)所得的抗原。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的阿維菌素抗原，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或 卵清蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的阿維菌素抗原，其特征在于:權(quán)利要求1所述化合物與所述 載體蛋白偶聯(lián)的摩爾比為8.14:1。6. 權(quán)利要求3-5中任一所述的阿維菌素抗原的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1 所述化合物與載體蛋白通過(guò)酰胺鍵偶聯(lián)，獲得所述阿維菌素抗原。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟： (al)將權(quán)利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，20-25°C反應(yīng)3h，得到溶液I; 所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、 所述N-羥基琥泊酰亞胺的配比為43.6mg: 1.5ml: 26mg: 25mg; (a2)將所述載體蛋白溶解于0.1M碳酸緩沖液中，得到溶液II; 所述載體蛋白與所述〇. 1M碳酸緩沖液的配比為50-67mg: 3.5ml; (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件B進(jìn)行混合，混合后后于20-25°C反應(yīng)24h，得 到溶液III; 所述條件B為:所述溶液I中的所述化合物與所述溶液II中的所述0.1M碳酸緩沖液的配 比為43 ? 6mg: 3 ? 5ml; (a4)用磷酸鹽緩沖液，于4°C對(duì)所述溶液III透析3天，得到所述阿維菌素抗原。8. 權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求3-5中任一所述的阿維菌素抗原在如下(a)或(b) 中的應(yīng)用： (a) 定性或定量檢測(cè)阿維菌素； (b) 制備阿維菌素抗體。9. 利用權(quán)利要求3-5中任一所述的阿維菌素抗原制備的抗體。
【文檔編號(hào)】C07H1/00GK106046083SQ201610387441
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】劉志萍, 蘇麗芳, 吳小平, 于書(shū)英, 秦譽(yù), 溫凱, 王照鵬, 王文珺, 楊柳, 邢維維, 陳銀輝, 丁亞芳
【申請(qǐng)人】北京維德維康生物技術(shù)有限公司, 西南大學(xué)