專利名稱：一種定量檢測(cè)腫瘤壞死因子α的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定一種定量檢測(cè)腫瘤壞死因子α的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子，簡(jiǎn)稱TNF，是由巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白。腫瘤壞死因子 α (TNF- α )主要由單核一巨噬細(xì)胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，兩者有相似致熱性。小劑量呈單峰熱，大劑量呈雙峰熱；TNF在體內(nèi)外均能刺激IL-I的產(chǎn)生。人類的TNF-α基因長(zhǎng)約2. 76kb,小鼠為2. 78kb,結(jié)構(gòu)非常相似，均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，與MHC基因群密切連鎖，分別定位于第6對(duì)和第17對(duì)染色體上。1984 年從HL-60、U937等細(xì)胞中克隆成功rHu TNF-α CDNA，并在大腸桿菌中獲得高表達(dá)。人 TNF-α前體由233個(gè)氨基酸殘基組成，含76個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，切除信號(hào)肽后成熟型 TNF-α為157氨基酸殘基，非糖基化，第69位和101位兩個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。 rHu TNF-α分子量為17kDa。成熟的小鼠TNF-α與rMu TNF-α有79%氨基酸組成同源性，TNF-α的生物學(xué)作用似無明顯的種屬特異性。TNF-α參與了多種體內(nèi)的生物學(xué)過程，能夠殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，抗病毒細(xì)菌感染，促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化等。應(yīng)用TNF-α在治療腫瘤等方面開始臨床II期試驗(yàn)，也可與IL-2聯(lián)合治療腫瘤，目前認(rèn)為全身用藥的療效不及局部用藥，后者如病灶內(nèi)注射，局部濃度高且副作用也較輕。近年來已采用TNF基因治療開始對(duì)黑素瘤等腫瘤進(jìn)行臨床驗(yàn)證。TNF還與一些臨床某些疾病的病變程度有關(guān)，例如大骨節(jié)病、結(jié)腸炎、腦膜炎以及哮喘等等，臨床上可通過檢測(cè)TNF-α等生化指標(biāo)來分析疾病的發(fā)生程度。過去以放免為代表的檢測(cè)腫瘤壞死因子的檢測(cè)試劑盒受方法學(xué)的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴(yán)重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場(chǎng)，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時(shí)方法簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測(cè)方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相(ELISA板反應(yīng)孔)表面進(jìn)行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng) ELISA相比具有靈敏度高，檢測(cè)用時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種定量檢測(cè)TNF-α的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，采用該試劑盒進(jìn)行TNF-α檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間和更簡(jiǎn)便的操作方式。
本發(fā)明提供的試劑盒，其包含的試劑有TNF-α磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物。所述的磁分離試劑含有標(biāo)記有TNF-α單克隆抗體的磁性微球。所述的酶標(biāo)抗體是含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的TNF- α單克隆抗體。所述的增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液。所述的校準(zhǔn)品及控制品是含有一定量的TNF-α抗原的溶液。所述濃縮液是含有TWEEN-20和ftx)clin-300的緩沖液。所述的底物為酶促化學(xué)發(fā)光底物。本發(fā)明TNF-α的定量檢測(cè)試劑盒，優(yōu)選通過如下步驟制備而成第一步磁分離試劑的制備步驟1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、用移液槍吸取步驟1中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中， 置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次； 將步驟3獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重復(fù)操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為(均為質(zhì)量體積比)0. 1% BSA,0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存。9、將步驟8獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。第二步酶標(biāo)抗體制備步驟1、2. 5mgTNF-a單克隆抗體溶于1. Oml的N，N_二甲基甲酰胺中，加入Iml的IOmg/ ml辣根過氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亞胺，1小時(shí)后將1. 0ml 20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜；2、將步驟1的溶液裝入透析袋中，對(duì)0. 15M的PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；然后加入IOml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；最后將收集到的辣根過氧化物酶與TNF-a單克隆抗體的偶聯(lián)物用酶標(biāo)抗體稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。第三步增強(qiáng)劑配制步驟1、稱取TRIS1. 56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將Proclin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中； 2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾
器過濾ο第四步校準(zhǔn)品和控制品的配制校準(zhǔn)品濃度分別為0. 10,0. 20,0. 40,0. 80、1. 60ng/ml ；控制品濃度分別為0. 20、 0.80ng/mlo第五步濃縮液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；3、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?、調(diào)PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um濾器過濾即得。第六步底物配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Nei2SO3O. 002g 和 Proclin-3000· 2ml 于 IL 燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于1、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。2、本發(fā)明公開了一種新的專用增強(qiáng)劑以及濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏有效，可精確到O.Olng，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本；3、本試劑盒中的TNF-α磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測(cè)性能提供了有力保障。4、本試劑盒采用免疫磁微粒分離技術(shù)與競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合，與現(xiàn)有技術(shù)的試劑盒相比，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以在10分鐘內(nèi)檢測(cè)數(shù)個(gè)生物樣本，對(duì)于尿液、血清等樣本可以不需前處理直接進(jìn)行檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、一、TNF-α磁分離試劑制備步驟1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α單克隆抗體 (Santa Cruz公司產(chǎn)品)溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、用移液槍吸取步驟1中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中， 置室溫90min ；3、將步驟2的溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；磁珠為本領(lǐng)域常用磁珠，優(yōu)選濃度25mg/mL，直徑為800nm。5、每次加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重復(fù)操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為0. 1 % BSA, 0. 05 %吐溫-20，0. 02 % NaN3, 20 %乙醇(均為質(zhì)量體積比)，4°C保存。9、將步驟8獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。實(shí)施例2一、酶標(biāo)抗體的制備步驟1、2. 5mgTNF-a單克隆抗體溶于1. Oml的N，N_二甲基甲酰胺中，加入Iml的IOmg/ ml辣根過氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亞胺，1小時(shí)后將1. 0ml 20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜；2、將步驟1的溶液裝入透析袋中，對(duì)0. 15M的PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；然后加入IOml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；最后將收集到的辣根過氧化物酶與TNF-a單克隆抗體的偶聯(lián)物用酶標(biāo)抗體稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。實(shí)施例3增強(qiáng)劑配制步驟1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將ftx)clin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾。Mak33是羅氏公司的商品化的試劑。實(shí)施例4校準(zhǔn)品和控制品的配制步驟1、最高點(diǎn)最高濃度點(diǎn)為X，目標(biāo)點(diǎn)濃度為A，B，C，D，E，F(xiàn)，配制V體積的溶液時(shí)，需加入原料的體積為分別為表權(quán)利要求
1. 一種定量檢測(cè)TNF-α的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含TNF-α磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物；所述試劑盒按照如下方法制備而成第一步TNF-α磁分離試劑的制備步驟1)將1.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α單克隆抗體溶于 PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2)用移液槍吸取步驟1中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；3)將步驟2獲得的溶液加入到濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮 30min至體積為0. 5ml ；4)取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；5)加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6)加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；7)加入1.5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清；8)用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方為0.1 % BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存；9)將步驟8獲得的溶液用磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得試劑盒中磁分離試劑；所述磁珠緩沖液為濃度是lmol/L的TRIS-HCl緩沖液。第二步酶標(biāo)抗體制備步驟1)2.5mgTNF- α單克隆抗體溶于1. Oml的N，N- 二甲基甲酰胺中，加入Iml的10mg/ml 辣根過氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亞胺，1小時(shí)后將1. 0ml 20mg/ml的碳化二亞胺加入，混合物不斷攪拌，4°C過夜；2)將步驟1的溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M的PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液； 然后加入IOml濃度為15mg/ml的BSA溶液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫蛔詈髮⑸鲜鋈芤河妹笜?biāo)抗體稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶標(biāo)抗體；所述酶標(biāo)抗體稀釋液為濃度是lmol/L的 TRIS-HCl緩沖液。第三步增強(qiáng)劑配制步驟1)稱取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將Proclin_300量取0. 2ml 于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2)用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH在 7. 35-7. 45 之間；3)稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾ο第四步校準(zhǔn)品和控制品的配制將TNF-α配制濃度分別為0. 10,0. 20,0. 40,0. 80、1. 60ng/ml的校準(zhǔn)品；將TNF-α配制成濃度分別為0. 20,0. 80ng/ml的控制品。第五步濃縮液配制步驟，配制IL :1)稱取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2)稱取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；3)用移液器將ftx)Clin-300量取0.2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；4)用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?)調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7. 45之間；6)最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得。 第六步底物配制步驟，配制IL :1)稱取TRIS 2. 35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3O. 002g 和 Proclin-3000. 2ml 于 IL 燒杯中；2)用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH在7.95-8. 05 之間；3)加入250mlLumi-Phos 530后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下1)、加15μ 1 TNF-α校準(zhǔn)品、TNF-α控制品、待測(cè)標(biāo)本至對(duì)應(yīng)試管底部；2)、加25μ 1酶標(biāo)抗體至每一試管中；3)、加25μ 1增強(qiáng)劑至每一試管中；4)、加25μ 1磁分離試劑至每一試管中；5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；6)、然后放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液；7)、濃縮液用純化水稀釋10倍后，加100μ 1稀釋后的濃縮液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；8)、加100μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求1或者2所述的試劑盒在診斷疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了定量檢測(cè)腫瘤壞死因子α的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒包含TNF-α磁分離試劑，酶標(biāo)抗體，增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、控制品，濃縮液以及底物。本發(fā)明試劑盒采用免疫磁微粒分離技術(shù)與競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合，具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，并且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以在10分鐘內(nèi)檢測(cè)數(shù)個(gè)生物樣本，對(duì)于尿液、血清等樣本可以不需前處理直接進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102495215SQ201110399728
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者任慶遠(yuǎn), 李守瑋 申請(qǐng)人:任慶遠(yuǎn), 李守瑋