專利名稱：具有高艾杜糖醛酸含量的多糖類的制作方法
現(xiàn)有技術(shù)葡糖胺聚糖屬于含有艾杜糖醛酸的多糖類物質(zhì)，它們從不同來源的動物組織提取得到，這些組織如腸粘膜，肺等。肝素，硫酸乙酰肝素，condroitin sulfates和透明質(zhì)酸屬于葡糖胺聚糖族系。
不同的葡糖胺聚糖具有不相同的化學結(jié)構(gòu)，它們由糖醛酸和己糖胺重復(fù)構(gòu)成的多糖鏈形成。具體講，在肝素和硫酸乙酰肝素中，糖醛酸(uronicacid)由糖醛酸(glycuronic acid)或艾杜糖醛酸構(gòu)成，而己糖胺則由葡糖胺構(gòu)成。
葡糖胺可優(yōu)先被N-乙?；?硫酸乙酰肝素)或優(yōu)先N-硫酸鹽化(肝素)和6-O硫酸鹽化。此外，還發(fā)現(xiàn)在葡糖胺的3位上也帶有硫酸根。糖醛酸可被2-O硫酸鹽化。
在臨床實踐中，肝素作為抗凝血劑和抗血栓形成劑具有十分重要的作用。
對肝素和硫酸乙酰肝素來講，除上述這種治療應(yīng)用外，還希望它們在若干其它病理學方面具有有用的應(yīng)用，例如具有抗血脂，抗增生，抗病毒，抗腫瘤和抗生成血管功能等作用。
肝素和硫酸乙酰肝素在這些新治療應(yīng)用方面的使用包括必需用不同于提取的方法，特別是用適應(yīng)性更強的可以制備不同結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的方法，制得這些產(chǎn)物或類似產(chǎn)物。
并且，提取動物組織的方法不能保證得到無病毒產(chǎn)物。
WO92/17507專利申請中描述了通過生物合成制備抗凝血劑葡糖胺聚糖的方法。在此方法中，使用從大腸桿菌中得到的多糖K5為原料，采用下述反應(yīng)順序進行-N-脫乙酰化作用；-N-硫酸鹽化作用；-差向異構(gòu)作用，以便將D-糖醛酸的至少某些殘基轉(zhuǎn)移到L-艾杜糖醛酸的殘基上；和-至少某些游離羥基的硫酸鹽化作用。
此方法中，其關(guān)鍵步驟在于差向異構(gòu)作用，這種差向異構(gòu)作用最多限于20％。差向異構(gòu)是在由HEPES、氯化鉀、EDTA和TRITON X-100組成的pH為7.4的經(jīng)典反應(yīng)介質(zhì)中，于D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向異構(gòu)酶(D-glycuronyl-L-iduronyl-C5-epimerase)存在下室溫進行兩天。以前已闡述了限于三分之一糖醛酸差向異構(gòu)作用(M.Hook等人，生物化學(The J.of Biol.Chem.)249，123908-3915，1974年6月25日)。并且這種差向異構(gòu)程度似乎至今仍是無法逾越的。此外，必須注意的是，在此文獻中，細胞環(huán)境中的差向異構(gòu)作用是在生物合成方法的各種因素存在的條件下于鼠肥大細胞瘤中進行。
但是，象從現(xiàn)有技術(shù)中得到的差向異構(gòu)程度不允許得到具有各種治療應(yīng)用所需特征的產(chǎn)物。
事實上，艾杜糖醛酸賦予糖醛酸產(chǎn)物優(yōu)越的柔性(Casu B.，Petitou M.，Provasoli M.，和Sinay P.(1988)構(gòu)象柔性一種解釋包含艾杜糖醛酸的葡糖胺聚糖結(jié)合和生物特性的新概念。Trends Biochem.Sci.13，221-225)。因此，正如由肝素相對于硫酸乙酰肝素具有更強的抗凝和抗血栓形成活性和其它活性如對堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的活性所指出的那樣，含有高百分比量艾杜糖醛酸的產(chǎn)物較之那些含有糖醛酸的產(chǎn)物具有更高活性，其中艾杜糖醛酸被認為是活性部位的必需部分(Maccarana M.，Casu B，.和Lindahl U.(1993).結(jié)合堿性成纖維細胞生長因子所需要的肝素/硫酸乙酰肝素中的最低序列(Minimal sequence in Heparin/Heparan SulfateRequired for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor).生物化學(J.Biol.Chem.)，268，23898-23905)。因此，從工業(yè)角度來看，存在著這樣難題，即尋求能得到具有可接受的產(chǎn)率和時間的高度差向異構(gòu)作用的產(chǎn)物的方法。概述我們已發(fā)現(xiàn)，具有高艾杜糖醛酸含量的多糖類可通過下述方法以由大腸桿菌得到的多糖K5或以肝素或硫酸乙酰肝素為原料制得，該方法包括a)N-脫乙?；龆嗵荎5或硫酸乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b) N-硫酸鹽化a)步所得產(chǎn)物；c)在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5差向異構(gòu)酶存在下進行一次或多次差向異構(gòu)處理；d)將至少某些游離羥基進行硫酸鹽化，其特征在于差向異構(gòu)步驟是在由由HEPES、氯化鉀和EDTA形成的pH為7.4的經(jīng)典緩沖溶液構(gòu)成的、加有TRITON X-100和一種或多種選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿的添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進行。
按照本發(fā)明方法，可以制得相對于糖醛酸總含量，艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖。發(fā)明詳述下文詳盡的說明過程中基本上完全指出了本發(fā)明方法和所得多糖的特征及優(yōu)點。
按Manzoni M.，Bergomi S.，Cavazzoni V.(生物活性和相容聚合物(Journal of Bioactive and Compatible Polymers).Vol VIII，1993年7月，251-257)所述由大腸桿菌得到的多糖K5特別適合用作本發(fā)明方法的起始原料。
肝素和硫酸乙酰肝素也可用作第一步中操作條件有某些改變的本發(fā)明方法的起始原料。
起始原料可以具有2,000至大于50,000D的分子量。
當使用多糖K5時，其結(jié)構(gòu)首先通過N-脫乙酰化改性，這種改性可通過用肼和硫酸肼混合物處理來進行，或者在堿性環(huán)境中通過用氫氧化鈉或氫氧化鉀處理進行。
然后通過用三乙胺-三氧化硫或用三甲胺-三氧化硫處理，進行N-硫酸鹽化。利用這些操作，可以得到各種，例如25％至100％的N-硫酸鹽化產(chǎn)物。
N-脫乙?；蚇-硫酸鹽化的反應(yīng)按照已知技術(shù)進行，例如按照WO92/17507中所述方法進行。
當使用肝素作為起始原料時，先進行O-脫硫酸鹽化，然后進行N-硫酸鹽化，以便再硫酸鹽化O-脫硫酸鹽化作用期間脫去硫酸根的氨基位置。
當硫酸乙酰肝素被用作起始原料時，不僅進行N-脫乙?；蚈-脫硫酸鹽化，而且還進行形成N-再硫酸鹽化。
按上所述由多糖K5或硫酸乙酰肝素得到的N-硫酸鹽化產(chǎn)物進行差向異構(gòu)處理，以轉(zhuǎn)化糖醛酸成艾杜糖醛酸，另一方面，為了由艾杜糖醛酸得到糖醛酸，則可用酶處理由肝素得到的產(chǎn)物。
差向異構(gòu)作用是在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向異構(gòu)酶(以下用C5差向異構(gòu)酶簡單表示)進行，這種酶是從貓肝臟中提取出并按A.Malmstron在J.B.C 255，3878-3883(1980)中所述方法純化得到。
本申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)，用適當添加劑改性經(jīng)典反應(yīng)介質(zhì)，能獲得非常高程度的差向異構(gòu)作用。
本發(fā)明的反應(yīng)介質(zhì)為由HEPES，氯化鉀，EDTA和TRITON X-100構(gòu)成的pH為7.4的緩沖溶液，并加有一種或多種選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，特別是具有15,000至90,000分子量的聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿的添加劑，其加入量為適于增加緩沖溶液粘度至1.1至3厘沲的量。
具體講，所述反應(yīng)介質(zhì)由下述pH為7.4的緩沖溶液制備HEPES0.04M，KCl 0.4M和EDTA 0.06M，并向25ml此緩沖溶液中加入100至1000μlTRITON X-100，0.5ml至60ml添加劑，并加蒸餾水至100ml。
將進行差向異構(gòu)作用的多糖加到所述反應(yīng)介質(zhì)中，其加入量為每100ml反應(yīng)介質(zhì)5至1000mg，得到溶液A。
將C5差向異構(gòu)酶獨立加到與上所述相同的反應(yīng)介質(zhì)中，其量為每100ml反應(yīng)介質(zhì)21至2000μg，得到溶液B。
以能得到每100ml進行差向異構(gòu)作用的混合物含1.5至15.000μgC5差向異構(gòu)酶量的比例，將溶液B加到溶液A內(nèi)。攪拌均化混合物，并在恒溫室中于30至40℃溫度下加熱90分鐘至15小時。
在100℃加熱混合物5分鐘，停止反應(yīng)。
產(chǎn)物通過DEAE-Sephacel柱純化，采用0.05M(NH4)HCO3作為緩沖液，并用2M(NH4)HCO3緩沖液洗脫產(chǎn)物。
收集各餾份并通過Sephadex G-15柱脫鹽。凍干含產(chǎn)物部分的餾份，并通過1H-NMR分析產(chǎn)物。
依據(jù)1H-NMR譜，計算D-糖醛酸和L-艾杜糖醛酸的含量。所得產(chǎn)物可再溶于溶液A中并用溶液B再次處理，進一步差向異構(gòu)化處理后，L-艾杜糖醛酸的含量增加。
為評估抗凝和抗血栓形成活性，使用吡啶-三氧化硫作為硫酸鹽化劑，按照如Ogamo等人在第XIV屆國際碳水化合物討論會文摘(1988年8月14-19日，Stockholm)中所述方法，將差向異構(gòu)化產(chǎn)物O-硫酸鹽化。如下文所報道的用本發(fā)明方法得到的，進行了O-硫酸鹽化的實施例1，3，4，5，6，7和9的產(chǎn)物，顯示出優(yōu)越的抗凝和抗血栓形成活性，而按照已知技術(shù)制得的實施例2和8的產(chǎn)物則顯示出非常低的活性。
所得結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)物具有適于臨床使用特性的抗凝和抗血栓形成作用，因此，它們可用于制備混合有輔劑和賦形劑物質(zhì)的有關(guān)藥物組合物。
為說明本發(fā)明方法，報道了下述實施例。實施例1制備含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl的緩沖溶液(pH7.4)，取4.5ml此溶液，向其中加入27μlTRITON X-100，9ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，1.62ml乙二醇，并加水至總體積18ml。
所得溶液的粘度為1.41厘沲。在此溶液中溶入1mg100％N-脫乙酰、N-硫酸鹽化K5，得到溶液A。
向0.8mlpH為7.4且含有8.9μgC5差向異構(gòu)酶的相同起始緩沖溶液中加入1.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液、288μl乙二醇并加水至總體積3.2ml，得到溶液B。
將溶液A與1.6ml溶液B混合，混合物在37℃的溫室中保持4小時。4小時后，加入1.6ml溶液B，并將反應(yīng)在37℃保持過夜。通過在100℃加熱5分鐘使反應(yīng)停止。產(chǎn)物通過DEAE-Sephacel柱(2×1.5cm)純化，采用0.05M(NH4)HCO3作為緩沖液，并用2M(NH4)HCO3緩沖液洗脫產(chǎn)物。
將含產(chǎn)物餾分通過Sephadex G-15柱(0.3×5cm)脫鹽并凍干。產(chǎn)物通過1H-NMR分析，其光譜見

圖1。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為55。實施例2(對比)重復(fù)實施例1，區(qū)別在于不加聚乙烯吡咯烷酮和乙二醇。
所用緩沖液的粘度約等于水的粘度，即大約為0。
所得產(chǎn)物的1H-NMR譜見圖2中報道。結(jié)果，相對于艾杜糖醛酸與糖醛酸的總和，L-艾杜糖醛酸的含量等于18％。實施例3重復(fù)實施例1，區(qū)別在于使用N-脫乙酰和50％N-硫酸鹽化多糖K5作為起始原料。
通過1H-NMR分析所得產(chǎn)物，其相關(guān)光譜見圖3中報道。結(jié)果，相對于局限于N-硫酸鹽化葡糖胺的糖醛酸總和，L-艾杜糖醛酸含量等于51％。實施例4將0.06M EDTA，0.4M KCl(pH7.4)，30μlTRITON X-100，10.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，0.85ml乙二醇和4.42ml水加到5.3ml含0.04M HEPES的緩沖溶液中。
所得溶液的粘度為1.2厘沲。在9ml此溶液中溶入2mg100％N-脫乙酰、N-硫酸鹽化K5，得到溶液A。
在8ml相同溶液中溶入1.7μgC5差向異構(gòu)酶，得到溶液B。
混合溶液A和B，混合物在37℃的溫室中保持4小時。通過在100℃加熱5分鐘使反應(yīng)停止。
產(chǎn)物如實施例1所述純化。
冷凍干燥后，將純化產(chǎn)物溶于1ml溶液A中并與含8.9μgC5差向異構(gòu)酶的3.2ml溶液B混合。
混合物于37℃保持過夜，在100℃加熱5分鐘使酶失活。按實施例1所述純化產(chǎn)物并通過1H-NMR分析，光譜如圖4所示。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為53。實施例5制備含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl，pH為7.4的緩沖溶液，取2ml此溶液，向其中加入22.8μlTRITON X-100，1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5，4ml20％含40％乙二醇的聚乙烯吡咯烷酮K15溶液，并加水至總體積8ml。向6ml此溶液內(nèi)加入6ml含下述組成的溶液0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.01MKCl，0.015％TRITON X-100和134.4μgC5差向異構(gòu)酶。
所得溶液的粘度為1.36厘沲。
混合物在37℃保持1小時。通過在100℃沸騰5分鐘使反應(yīng)停止。
產(chǎn)物按實施例1所示純化。
冷凍干燥后，產(chǎn)物溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)6.25ml pH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl溶液，2.5g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.5ml乙二醇，71.21μlTRITON X-100，加水至總體積25ml。
將1.9μgC5差向異構(gòu)酶溶于12ml含0.015％TRITON X-100的0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.1M KCl溶液(pH7.4)內(nèi)，并將它們加到12ml上面所得混合物中。
混合物的粘度為1.4厘沲。
反應(yīng)在37℃保持過夜。在反應(yīng)最后，于100℃加熱溶液5分鐘使酶失活。產(chǎn)物如實施例1所述純化，并測定1H-NMR譜(圖5)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為52。實施例6重復(fù)實施例5，只是在第一步中，將反應(yīng)于37℃保持4小時。
在與實施例1相同的條件下純化和冷凍干燥后，將產(chǎn)物溶于1ml水中，并加到含有下述組成的緩沖溶液內(nèi)50ml(pH7.4)的0.04M HEPES，0.06MEDTA，0.4M KCl溶液，283.5μlTRITON X-100，100ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15，20ml乙二醇，2ml90％甘油，1.9μgC5差向異構(gòu)酶，并加水至總體積200ml?；旌衔锏恼扯葹?.41厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時，于100℃加熱5分鐘失活酶。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并測定1H-NMR譜(圖6)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為55。實施例7將1.5mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)7mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl溶液，210μlTRITON X-100，1.4g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.8ml乙二醇，1.5mgC5差向異構(gòu)酶和至總體積28ml量的水。
溶液的粘度為1.36厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時，于100℃加熱5分鐘失活酶。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并冷凍干燥。
然后將產(chǎn)物溶于24ml含1.3mgC5差向異構(gòu)酶的相同溶液內(nèi)，將反應(yīng)在37℃保持4小時，并在100℃加熱5分鐘使酶失活。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并冷凍干燥。
然后將產(chǎn)物溶于8.4ml含1mgC5差向異構(gòu)酶的相同溶液內(nèi)，將反應(yīng)在37℃保持4小時。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并測定1H-NMR譜(圖7)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為80。實施例8(對比)將1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)3mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，18μlTRITON X-100，1.2ml丙酮，1.9μgC5差向異構(gòu)酶和至總體積12ml量的水。
溶液的粘度為0.09厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并測定1H-NMR譜(圖8)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為0。實施例9將1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)2mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，12μlTRITON X-100，1.336m12.4％聚乙烯吡咯烷酮K90，304μgC5差向異構(gòu)酶和至總體積8ml量的水。
溶液的粘度為1.29厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時，于100℃加熱5分鐘失活酶，溶液通過0.22μm裝置過濾。
取8ml含304μgC5差向異構(gòu)酶的相同混合物，加到過濾后溶液內(nèi)，并將反應(yīng)在37℃保持4小時，于100℃加熱5分鐘使酶失活并用0.22μm裝置過濾溶液。
取8ml含304μgC5差向異構(gòu)酶的相同混合物，加到此溶液內(nèi)，并將反應(yīng)在37℃保持4小時，于100℃加熱5分鐘使酶失活，溶液通過0.22μm裝置過濾。
如實施例1所述純化產(chǎn)物并測定1H-NMR譜(圖9)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為59。
權(quán)利要求
1.以大腸桿菌得到的多糖K5或由肝素或硫酸乙酰肝素為原料，制備相對于糖醛酸總含量，L-艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖的方法。該方法包括a) N-脫乙?；龆嗵荎5或硫酸乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b)N-硫酸鹽化a)步所得產(chǎn)物；c)在C5差向異構(gòu)酶存在下進行一次或多次差向異構(gòu)處理；d)將至少某些游離羥基進行硫酸鹽化，其特征是差向異構(gòu)步驟是在由由HEPES、氯化鉀和EDTA構(gòu)成的pH為7.4的經(jīng)典緩沖溶液組成的、加有適于增加所述緩沖溶液的粘度值至1.1至3厘沲量的TRITON X-100和一種或多種添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述添加劑選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述添加劑為分子量為15,000至90,000的聚乙烯吡咯烷酮。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對于每100ml所述緩沖溶液，所述的一種或多種添加劑以2至240ml的量加入到所述緩沖溶液內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對于每100ml反應(yīng)介質(zhì)，所述原料化合物以5至1000mg的量溶于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對于每100ml反應(yīng)介質(zhì)，C5差向異構(gòu)酶以21至2000μg的量溶于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，每100ml進行差向異構(gòu)作用的混合物含有1.5至15,000μgC5差向異構(gòu)酶。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述差向異構(gòu)反應(yīng)是在恒溫室中于30至40℃的溫度下進行。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述起始產(chǎn)物為25％至100％N-磁酸鹽化的。
10.按權(quán)利要求1的方法得到的多糖，其特征在于，相對于糖醛酸的總含量，它們含有大于50％含量的L-艾杜糖醛酸。
11.權(quán)利要求10所述的多糖在制備具有抗凝和抗血栓形成活性的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備具有高含量艾杜糖醛酸的多糖的方法，包括a)N-脫乙?；瘡拇竽c桿菌得到的多糖K5或硫酰乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b)N-硫酸鹽化a)部所得產(chǎn)物；c)在C5差向異構(gòu)酶存在下進行差向異構(gòu)化；d)將至少某些游離羥基進行硫酸鹽化，其特征是步驟c)是在由HEPES、氯化鉀和EDTA形成的經(jīng)典緩沖溶液，和TRITON X-100構(gòu)成的并加有適當添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進行。
文檔編號A61K31/715GK1162339SQ95196040
公開日1997年10月15日 申請日期1995年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月4日
發(fā)明者G·佐派逖, P·奧里斯特, G·希波萊逖 申請人:伊納爾科公司