專利名稱：添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物物質(zhì)分離純化領(lǐng)域，特別涉及一種添加醛酮酯到陽離子型反膠團(tuán)相中形成陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相，從而提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)等生物物質(zhì)萃取率和反萃率的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法。
反膠團(tuán)相是表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成的分子聚集體，其中的微水池能溶解蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)。通過調(diào)節(jié)水相pH值、離子強(qiáng)度等條件，可以選擇性地萃取目標(biāo)蛋白質(zhì)。理論上，反膠團(tuán)相法萃取蛋白質(zhì)僅需要通過萃取和反萃過程，即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的濃縮純化，其操作步驟簡單，與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)如鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析等相比，具有處理量大、選擇性好和可連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于生物產(chǎn)品的大規(guī)模分離純化，因其有可能大幅度降低生物產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。但是反膠團(tuán)相法萃取蛋白質(zhì)至今未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，原因很多，其中之一是該方法的反萃過程十分困難。
影響蛋白質(zhì)在水相和反膠團(tuán)相間分配的因素很多，如水相pH值、離子強(qiáng)度和鹽的種類，有機(jī)相表面活性劑的類型、濃度、助表面活性劑的使用與否、用量多少和溶劑的種類，萃取過程的溫度和壓力等。其中最重要的是水相的pH值和離子強(qiáng)度。當(dāng)使用陽離子型表面活性劑形成反膠團(tuán)相時(shí)，水相pH值高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI，有利于蛋白質(zhì)的萃?。划?dāng)使用陰離子型表面活性劑形成反膠團(tuán)相時(shí)，水相pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI，有利于蛋白質(zhì)的萃取。當(dāng)水相離子強(qiáng)度較低時(shí)，有利于蛋白質(zhì)的萃取；而水相離子強(qiáng)度較高時(shí)，不利于蛋白質(zhì)的萃取。
眾所周知，因?yàn)榇嬖诤芨叩膫髻|(zhì)界面阻力，蛋白質(zhì)的反萃即蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)相到反萃水相的轉(zhuǎn)移十分困難。一般認(rèn)為，在不利于萃取的條件下進(jìn)行反萃，蛋白質(zhì)應(yīng)該實(shí)現(xiàn)完全反萃。但是，蛋白質(zhì)的反萃似乎并非一個(gè)平衡過程，即使在很高的離子強(qiáng)度和完全不利于萃取的pH條件下，蛋白質(zhì)的反萃也不能完全實(shí)現(xiàn)，甚至反萃率很低或完全不發(fā)生反萃。
近年來，許多研究人員進(jìn)行了新的嘗試，提出一系列提高反膠團(tuán)法蛋白質(zhì)反萃率的新方法。這些新方法是1)Ermin(Prikl Biokhim Kikrobiol，1988，24，42-49)和Woll(Biotechnol. Prog.，1989，5，57-62)等人嘗試加入第二種溶劑破壞反膠團(tuán)相，從而釋放反膠團(tuán)相中的蛋白質(zhì)；2)Dekker(Chem. Eng. J.，1991，46，B69-74)等人通過先增加反萃溫度然后離心的方法分離出多余的水相，濃縮蛋白質(zhì)于分離出的水相；3)Carison(Biotechnol. Prog. 1992，8，85-90)等人添加10％到50％的異丙醇到反萃水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的反萃；4)Leser(Chimia，1990，44，270-282)加入硅膠吸收水分，從而使蛋白質(zhì)與有機(jī)相分離；5)Gupta(Biotechnol. Bioeng.，1994，44，830-836)通過分子篩使反膠團(tuán)相脫水，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與有機(jī)相的分離；6)Hayes(Biotechnol. Bioeng.，1998，59(5)，557-566)加入少量的助表面活性劑到W/O微乳液，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的反萃；7)Jarudilokkul(Biotechnol. Bioeng.，1999，62(5)，593-601)通過添加帶有相反電荷的表面活性劑，在低鹽和溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃。
以上幾種方法雖然能夠從反膠團(tuán)相分離出蛋白質(zhì)，但僅添加異丙醇和加入相反電荷表面活性劑的方法易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，其他幾種僅有學(xué)術(shù)研究價(jià)值。而添加異丙醇的方法的缺點(diǎn)是反膠團(tuán)相二次萃取蛋白質(zhì)的能力急劇下降，導(dǎo)致有機(jī)相不能循環(huán)使用；添加帶相反電荷表面活性劑的缺點(diǎn)是完全破壞反膠團(tuán)相，有機(jī)相失去萃取蛋白質(zhì)的能力。因此，反膠團(tuán)相萃取蛋白質(zhì)的反萃問題并未根本解決。
本發(fā)明的目的是針對反膠團(tuán)相萃取蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的過程反萃困難的問題，而提供一種可同時(shí)提高陽離子型反膠團(tuán)相對蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的萃取率和反萃率的萃取方法，在很寬的pH范圍和不同離子強(qiáng)度下能顯著提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)的反萃率，顯著降低反膠團(tuán)相達(dá)到反萃平衡的時(shí)間，并且反膠團(tuán)相能夠循環(huán)使用。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下本發(fā)明提供的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其工藝步驟如下1.配制由陽離子型表面活性劑、助表面活性劑、醛酮酯有機(jī)物、水和有機(jī)溶劑組成的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相；所述陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相的配制如下首先稱取或移取一定量的陽離子型表面活性劑，并向其中依次加入助表面活性劑、醛酮酯有機(jī)物、水和有機(jī)溶劑，混合均勻，振蕩后靜置，至陽離子型表面活性劑和醛酮酯有機(jī)物完全溶解，再加入有機(jī)溶劑定容，即制得陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的助表面活性劑的體積比為100∶0.10-20；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的醛酮酯物質(zhì)的體積比為100∶0.5-20；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的水的體積比為100∶0.5-3；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相中，陽離子型表面活性劑所占的濃度為10毫摩爾-200毫摩爾/升；2.將陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，進(jìn)行萃取；3.將陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，進(jìn)行反萃；所述醛酮酯為醛RCHO、酮RR′CO、酯RCOOR′所述醛RCHO、酮RR′CO、酯RCOOR′中的烷基可為直鏈或支鏈；所述烷基R、R′為1個(gè)碳至15個(gè)碳原子的烷基；所述陽離子型表面活性劑為三烷基甲基季胺鹽、二烷基二甲基季胺鹽、烷基三甲基季胺鹽；所述的助表面活性劑為烷基醇類物質(zhì)；所述的有機(jī)溶劑為單一液態(tài)烷烴或混合液態(tài)烷烴。
本發(fā)明的方法，在單一陽離子型反膠團(tuán)相中添加醛酮酯有機(jī)物形成陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相，將產(chǎn)生兩方面的作用一是增加反膠團(tuán)相的大小，陽離子表面活性劑帶一定的正電荷，是一種路易斯酸，而醛酮酯的極性頭具有孤對電子，是一種路易斯堿，醛酮酯極性頭在反膠團(tuán)相內(nèi)壁的出現(xiàn)降低了陽離子表面活性劑極性頭間的相互斥力，從而反膠團(tuán)相變大，能夠容納更大的生物物質(zhì)分子，具有比單一反膠團(tuán)相更大的萃取能力；二是降低反膠團(tuán)相的界面阻力，有利于生物物質(zhì)進(jìn)出反膠團(tuán)相，從而在較高的離子強(qiáng)度和不利于生物物質(zhì)萃取的pH值條件下提高生物物質(zhì)的反萃率。
另外，具有疏水尾的醛酮酯有機(jī)物在水相的溶解度較少，大部分溶解于有機(jī)溶劑，萃取過程的損失較少，有利于反膠團(tuán)相的循環(huán)使用。如果反膠團(tuán)相因?yàn)槿┩ト芙庥谒嘟档蛯ι镂镔|(zhì)的反萃率，可以在有機(jī)相中添加少量醛酮酯。
適用于本發(fā)明方法分離的生物物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、酶、氨基酸和核酸等。
本發(fā)明可以顯著地增加反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)的萃取率，同時(shí)在很寬的pH范圍和不同離子強(qiáng)度下能顯著提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)的反萃率，顯著降低反膠團(tuán)相達(dá)到反萃平衡的時(shí)間，其突出優(yōu)點(diǎn)還在于反膠團(tuán)相能夠循環(huán)使用。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明附

圖1為單一反膠團(tuán)相和陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨萃取水相pH值的變化而變化的示意圖；附圖2為CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨醛酮酯添加量的變化而變化的示意圖；附圖3為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意圖；附圖4為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化(反萃水相含1.0mol/L的KBr，pH＝4.3)的示意圖；附圖5為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相離子強(qiáng)度的變化而變化(反萃水相pH＝4.3)的示意圖；附圖6為CTAB-酮酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化(反萃水相含1.0mol/L的KBr)的示意圖；附圖7為CTAB-酮酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化(1.0mol/L的KBr，pH＝4.3)而變化的示意圖；附圖8為CTAB-酮酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相離子強(qiáng)度的變化而變化的示意圖；其中-■-為十六烷基三甲基溴化銨(縮寫為CTAB)-●-為CTAB+正庚醛-▲-為CTAB+甲基異丁基酮--為CTAB+乙酸丁酯實(shí)施例1用本發(fā)明的方法萃取BSA本實(shí)施例中，陽離子表面活性劑選用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨，分析純)；助表面活性劑選用正己醇；醛酮酯分別選用甲基異丁基酮、正庚醛、乙酸丁酯；有機(jī)溶劑選用石油醚；水采用蒸餾水；
萃取水相為含0.10摩爾/升的氯化鉀和1.0毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)的不同pH的緩沖液(在pH值為3-6范圍，使用0.05摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液；在pH值為6-8范圍，使用0.05摩爾/升的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液；pH值為8-11范圍使用0.05摩爾/升的硼砂-鹽酸緩沖液)；其具體工藝步驟如下1.分別配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相以配制100毫升CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相為例，其配制過程如下稱取1.822克CTAB，并向其中依次加入20毫升正己醇(助表面活性劑)、5毫升的甲基異丁基酮、50毫升的石油醚和1.2毫升的蒸餾水，振蕩靜置，至CTAB和甲基異丁基酮完全溶解，加入石油醚定容至100毫升，混合均勻，從而制得100毫升的CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相；采用與配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相相同的配制過程分別配制100毫升CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相和100毫升CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相；單一CTAB反膠團(tuán)相的配制過程除不加醛酮酯有機(jī)物外，與上述混合反膠團(tuán)相的配制過程相同；CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的20％，正庚醛的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的5％，蒸餾水的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的20％，甲基異丁基酮的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的5％，蒸餾水的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相體積的20％，乙酸丁酯的體積占CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相體積的5％，蒸餾水的體積占CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積1.2％，其余為石油醚；2.萃取BSA的過程如下；向盛有等體積萃取水相的5個(gè)三角瓶中分別加入等體積的CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相，CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相，CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相，在室溫(18攝氏度)下，150次/分鐘振蕩20分鐘，3500rpm離心分相，即完成萃取。
用紫外法測定有機(jī)相蛋白質(zhì)的含量，Brandford方法測定水相的蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果如圖1所示，圖1中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨萃取水相pH值的變化而變化的曲線；-●-為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨萃取水相pH值的變化而變化的曲線；-▲-為CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨萃取水相pH值變化而變化的曲線；--為CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨萃取水相pH值變化而變化的曲線；由圖1可知，在很寬的pH值下，CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相對BSA的萃取率比單一CTAB反膠團(tuán)相對BSA的萃取率顯著提高。
實(shí)施例2用本發(fā)明的方法萃取BSA本實(shí)施例所選用的陽離子表面活性劑、助表面活性劑、醛酮酯和水均與實(shí)施例1相同，選用正己烷為有機(jī)溶劑；萃取水相的pH值為7.0。
1.分別配制具有不同醛酮酯體積百分比的CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相；配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度均為200毫摩爾/升，正己醇的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的3.0％，在CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相中，其醛酮酯的體積分別占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的1％、2％、3％、4％和5％，其余均為正己烷；2.萃取過程同實(shí)施例1；其萃取結(jié)果見附圖2，圖2中，-●-為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨正庚醛添加量的變化而變化的曲線；-▲-為CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨甲基異丁基酮添加量的變化而變化的曲線；--為CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相萃取BSA的萃取率隨乙酸丁酯添加量的變化而變化的曲線；由圖2可知，在pH值為7.0時(shí)，CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相和CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相對BSA的萃取率比單一CTAB反膠團(tuán)相對BSA的萃取率明顯提高，而且，其萃取率隨醛酮酯有機(jī)物添加量的增加而提高。
實(shí)施例3用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相為含1.0摩爾/升的溴化鉀的不同pH值的緩沖液；1.分別配制CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相；配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的20％，正庚醛占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，蒸餾水的體積均占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的為1.2％，其余為石油醚；在單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程如下向50毫升三角瓶中加入等體積的反萃水相和含1.0毫克/毫升的BSA的有機(jī)相，250次/分鐘振蕩一小時(shí)，4000rpm離心分相，完成其反萃；Brandford方法測定反萃水相的蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果見附圖3，圖3中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化的曲線；-●-為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH的變化而變化的曲線；從圖3可知，當(dāng)反萃水相含1.0摩爾/升的溴化鉀時(shí)，CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相在很寬的pH范圍內(nèi)對BSA的反萃率比單一CTAB反膠團(tuán)相對BSA的反萃率高。
實(shí)施例4用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相為含1.0摩爾/升的氯化鉀的pH＝4.30的緩沖液；1.分別配制CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相；配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相中，其CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的20％，正庚醛的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，蒸餾水的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的3.0％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，采用不同的反萃時(shí)間，其結(jié)果見附圖4，圖4中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化的曲線；-●-為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化的曲線；從圖4可知，當(dāng)反萃水相含1.0摩爾/升的氯化鉀時(shí)，CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相能顯著降低CTAB體系達(dá)到反萃平衡的時(shí)間，而單一CTAB反膠團(tuán)相需要較長的時(shí)間才能達(dá)到反萃平衡；經(jīng)過相同混合時(shí)間，混合反膠團(tuán)相的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率高于單一反膠團(tuán)相的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率。
實(shí)施例5用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相為含不同濃度的溴化鉀、pH值為4.30的緩沖液；1.分別配制CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的20％，正庚醛的體積均占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，蒸餾水的體積占CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，其結(jié)果見附圖5，圖5中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相離子強(qiáng)度的變化而變化的曲線；-●-為CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相離子強(qiáng)度的變化而變化的曲線；從圖5可知，當(dāng)反萃水相pH值為4.30，含不同濃度的溴化鉀時(shí)，CTAB-正庚醛混合反膠團(tuán)相較單一CTAB反膠團(tuán)相的反萃率高。
實(shí)施例6用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相為含1.0摩爾/升的氯化鉀的、pH值為4.30的緩沖液；1.配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相和CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度均為50毫摩爾/升，正己醇的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的20％，甲基異丁基酮的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，乙酸丁酯的體積占CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相體積的4％，蒸餾水的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，采用不同的反萃時(shí)間，其結(jié)果見附圖6，圖6中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化的曲線；▲-為CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化的曲線；--為CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相pH值的變化而變化的曲線；從圖6可知，CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相較單一反膠團(tuán)相的對BSA的反萃率高。
實(shí)施例7用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相含有1.0mg/ml的溴化鉀、pH值為4.30的緩沖液；1.配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相和CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度均為50毫摩爾/升，正己醇的體積均占CTAB-酮酯混合反膠團(tuán)相體積的20％，甲基異丁基酮的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，乙酸丁酯的體積占CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，蒸餾水的體積均占CTAB-酮酯混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，其結(jié)果見附圖7，圖7中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化的曲線；▲-為CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化的曲線；--為CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃時(shí)間的變化而變化的曲線；從圖7可知，當(dāng)反萃水相含1.0mol/L溴化鉀，pH值為4.30的緩沖液時(shí)，CTAB-CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相能顯著降低CTAB體系達(dá)到反萃平衡的時(shí)間，而單一CTAB反膠團(tuán)相需要較長的時(shí)間才能達(dá)到反萃平衡；經(jīng)過相同混合時(shí)間，混合反膠團(tuán)相的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率高于單一反膠團(tuán)相的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率。
實(shí)施例8用本發(fā)明的方法萃取并反萃BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，pH值為9.10；反萃水相為含不同濃度的溴化鉀、pH值為4.30的緩沖液；1.分別配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的兩種CTAB-混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度均為50毫摩爾/升，正己醇的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的20％，甲基異丁基酮、乙酸丁酯的體積分別占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的2.0％，蒸餾水的體積均占CTAB-醛酮酯混合反膠團(tuán)相體積的1.2％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的2.0％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，其結(jié)果見附圖8，圖8中，-■-為單一CTAB反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相的離子強(qiáng)度的變化而變化的曲線；▲-為CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相的離子強(qiáng)度的變化而變化的曲線；--為CTAB-乙酸丁酯混合反膠團(tuán)相反萃BSA的反萃率隨反萃水相的離子強(qiáng)度的變化而變化的曲線；從圖8可知，當(dāng)反萃水相pH值為4.30，含不同濃度的溴化鉀時(shí)，甲基異丁基酮的添加能顯著提高CTAB體系對BSA的反萃率。
實(shí)施例9用本發(fā)明的方法萃取BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1；1.配制CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為10毫摩爾/升，正丁醇的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的5％，蒸餾水的體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的0.5％，甲基異丁基酮體積占CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的2％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTAB-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相對BSA的萃取率比單一CTAB反膠團(tuán)相對BSA的萃取率高。
本實(shí)施例，也可采用三甲基烷基(C10-C16)氯化銨或三甲基烷基(C17-C20)氯化銨，配置三甲基烷基(C10-C16)氯化銨-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相或三甲基烷基(C17-C20)氯化銨-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相，其對BSA的萃取率也高于單一三甲基烷基(C10-C16)氯化銨相或單一三甲基烷基(C17-C20)氯化銨反膠團(tuán)相對BSA的萃取率。
本實(shí)施例也可采用正辛醛、十五醛、甲基己基甲酮、乙酸戊酯或乙酸異戊酯，配置CTAB-正辛醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-十五醛混合反膠團(tuán)相、CTAB-甲基己基甲酮混合反膠團(tuán)相、CTAB-乙酸戊酯混合反膠團(tuán)相或CTAB-乙酸異戊酯混合反膠團(tuán)相，其對BSA的萃取率也高于單一CTAB反膠團(tuán)相對BSA的萃取率。
實(shí)施例10用本發(fā)明的方法萃取BSA本實(shí)施例中，萃取水相同實(shí)施例1，1.分別配制二烷基二甲基氯化銨-甲基丁基酮混合反膠團(tuán)相和單一CTAB反膠團(tuán)相；配制方法同實(shí)施例1，得到的二烷基二甲基氯化銨-甲基丁基酮混合反膠團(tuán)相中，二烷基二甲基氯化銨的濃度為100毫摩爾/升，正辛醇的體積占二烷基二甲基氯化銨-甲基丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的10％，甲基丁基酮的體積占二烷基二甲基氯化銨-甲基丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的20％，蒸餾水的體積占二烷基二甲基氯化銨-甲基丁基酮混合反膠團(tuán)相體積的1.0％，其余為石油醚；單一CTAB反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為100毫摩爾/升，正辛醇的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的5％，蒸餾水的體積占單一CTAB反膠團(tuán)相體積的0.5％，其余為石油醚；2.萃取過程同實(shí)施例1；3.反萃過程同實(shí)施例3，反膠團(tuán)相與反萃水相的體積比為50∶1；其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲基丁基酮的添加能顯著提高二烷基二甲基氯化銨反膠團(tuán)相對BSA的反萃率。
本實(shí)施例，也可采用氯化甲基三辛銨或氯化甲基三正十二銨，配制氯化甲基三辛銨-乙酸戊酯混合反膠團(tuán)相或氯化甲基三正十二銨-乙酸戊酯混合反膠團(tuán)相，其對BSA的萃取率也高于單一氯化甲基三辛銨相或單一氯化甲基三正十二銨反膠團(tuán)相對BSA的萃取率。
實(shí)施例11用本發(fā)明的方法萃取α-淀粉酶本實(shí)施例中，萃取水相為含0.10摩爾/升的氯化鉀和1.0毫克/毫升的α-淀粉酶(AM)的不同pH的緩沖液；1)配制Aliquat 336(三烷基甲基氯化銨)-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相和單一Aliquat 336反膠團(tuán)相，配制方法同實(shí)施例1，得到的Aliquat 336(三烷基甲基氯化銨)-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占混合反膠團(tuán)相體積的0.5％，甲基異丁基酮的體積占混合反膠團(tuán)相體積的2％，蒸餾水的體積占混合反膠團(tuán)相體積的0.5％，其余為石油醚；單一Aliquat 336反膠團(tuán)相中，CTAB的濃度為50毫摩爾/升，正己醇的體積占單一Aliquat 336反膠團(tuán)相體積的0.5％，蒸餾水的體積占單一Aliquat 336反膠團(tuán)相體積的0.5％，其余為石油醚。2)萃取過程同實(shí)施例1，萃取水相與反膠團(tuán)相的體積比為50∶1；其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aliquat 336-甲基異丁基酮混合反膠團(tuán)相對α-淀粉酶的萃取率比單一Aliquat 336反膠團(tuán)相對α-淀粉酶的萃取率高。
本實(shí)施例，也可采用氯化甲基三辛銨或氯化甲基三正十二銨，配制氯化甲基三辛銨-乙酸戊酯混合反膠團(tuán)相或氯化甲基三正十二銨-乙酸戊酯混合反膠團(tuán)相，其對α-淀粉酶的萃取率也高于單一氯化甲基三辛銨相或單一氯化甲基三正十二銨反膠團(tuán)相對α-淀粉酶的萃取率。
權(quán)利要求
1.一種添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其工藝步驟如下1)配制由陽離子型表面活性劑、助表面活性劑、醛酮酯有機(jī)物、水和有機(jī)溶劑組成的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相；所述陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相的配制如下首先稱取或移取一定量的陽離子型表面活性劑，并向其中依次加入助表面活性劑、醛酮酯有機(jī)物、水和有機(jī)溶劑，均勻混合，振蕩后靜置，至陽離子型表面活性劑和醛酮酯完全溶解，再加入有機(jī)溶劑定容，即制得陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的助表面活性劑的體積比為100∶0.10-20；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的醛酮酯物質(zhì)的體積比為100∶0.5-20；所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與所加入的水的體積比為100∶0.5-3；陽離子型表面活性劑在所配制的陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相中的濃度為10毫摩爾-200毫摩爾/升；2)將陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與萃取水相按1∶1-1∶50的比例混合，進(jìn)行萃取；3)將陽離子-醛酮酯混合反膠團(tuán)相與反萃水相按1∶1-50∶1的比例混合，進(jìn)行反萃。
2.按權(quán)利要求1所述的添加醛酮酯萃取劑提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述醛酮酯有機(jī)物為醛RCHO、酮RR′CO或酯RCOOR′。
3.按權(quán)利要求2所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述烷基為直鏈或支鏈。
4.按權(quán)利要求3所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述烷基R、R′為1個(gè)碳至15個(gè)碳原子的烷基。
5.按權(quán)利要求2所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述烷基R、R′為1個(gè)碳至15個(gè)碳原子的烷基。
6.按權(quán)利要求1所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述陽離子型表面活性劑為三烷基甲基季胺鹽、二烷基二甲基季胺鹽、烷基三甲基季胺鹽。
7.按權(quán)利要求1所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述的助表面活性劑為烷基醇類。
8.按權(quán)利要求1所述的添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為單一液態(tài)烷烴或混合液態(tài)烷烴。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物物質(zhì)分離純化領(lǐng)域,特別涉及一種添加醛酮酯提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率和反萃率的方法,該方法通過添加醛酮酯到陽離子型表面活性劑中形成陽離子－醛酮酯混合反膠團(tuán)相,從而提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)萃取率,并在很寬的pH范圍和不同離子強(qiáng)度下顯著提高反膠團(tuán)相對生物物質(zhì)的反萃率,顯著降低反膠團(tuán)相達(dá)到反萃平衡的時(shí)間,其突出優(yōu)點(diǎn)還在于反膠團(tuán)相可以循環(huán)使用。
文檔編號B01D11/00GK1353000SQ0013270
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月13日
發(fā)明者張偉, 劉會洲, 陳家鏞 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所