專利名稱：治療病毒性疾病的脂質(zhì)體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療病毒性疾病、尤其是治療由病毒(例如人免疫缺損病毒和細(xì)胞肥大病毒)引起的感染的脂質(zhì)體組合物及其方法。
背景技術(shù)：
目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種用于對(duì)人免疫缺損病毒(HIV)感染的患者進(jìn)行治療的抗病毒藥物。然而，在使用任何抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或其聯(lián)合形式治療的HIV感染的患者中，僅能觀察到短暫并且有限的治療效果。由于這些藥物減少病毒負(fù)荷的能力有限、耐藥性的迅速產(chǎn)生以及大多數(shù)藥物的毒副作用限制了它們的長(zhǎng)期效果。對(duì)患者進(jìn)行抗病毒藥物給藥的一個(gè)主要問(wèn)題是這些藥物對(duì)感染細(xì)胞的穿透及定向能力很差。藥物的迅速清除以及母體化合物或其代謝產(chǎn)物的毒性也構(gòu)成了一些主要的缺點(diǎn)，從而延緩了許多抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)和使用。針對(duì)目前使用的治療AIDS及其它病毒性疾病的抗病毒藥物的嚴(yán)重毒性以及它們對(duì)感染細(xì)胞的有限的定向能力，應(yīng)當(dāng)研究旨在在感染細(xì)胞內(nèi)達(dá)到藥物的治療濃度并降低毒性的策略。將藥物包裹于脂質(zhì)體中構(gòu)成了一條改善活性藥物向感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)并減少與給藥有關(guān)的毒副作用的引人注目的途徑。脂質(zhì)體是一種可以將多種藥物摻入其中的微囊。由于脂質(zhì)體的主要成分與天然的膜相似，所以脂質(zhì)體一般無(wú)毒并可以被生物降解。我們相信，通過(guò)更好地理解脂質(zhì)體作為抗病毒藥物載體的角色，將導(dǎo)致改善治療AIDS及其它病毒性疾病所用藥物的效力和安全性的新策略。
目前，有許多證據(jù)表明巨噬細(xì)胞在HIV的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，它可起到病毒在免疫系統(tǒng)中播散的病毒貯主的作用(Gendelman等，1989，AIDS 3475-495；Meltzer等，1990，免疫學(xué)年評(píng)，8169-194)。最近報(bào)道，在感染早期以及整個(gè)臨床潛伏期，盡管HIV在外周血中的活性很弱，但其在淋巴器官內(nèi)的聚集和復(fù)制卻很活躍(Pantaleo等，1993，自然，362355-358；Embretson等，1993，自然，362359-362；Fox等，1994，自然，370256)。據(jù)報(bào)道，淋巴組織中觀察到的高病毒負(fù)荷與生發(fā)中心的濾泡樹(shù)狀細(xì)胞捕集的HIV顆粒有關(guān)。在HIV感染過(guò)程中，濾泡樹(shù)狀細(xì)胞網(wǎng)逐漸紊亂并最終被破壞。由于淋巴組織的微環(huán)境對(duì)有效的免疫應(yīng)答非常重要，從而必需減少或終止HIV在淋巴組織中的聚集以保持該微環(huán)境網(wǎng)的完整性。使用脂質(zhì)體作為藥物傳送系統(tǒng)特別適用于控制HIV疾病的進(jìn)展。由于脂質(zhì)體必然被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)的細(xì)胞攝取，基于脂質(zhì)體的治療可以在易被HIV感染的細(xì)胞內(nèi)富集抗病毒藥物，并同時(shí)減少可能會(huì)產(chǎn)生藥物潛在毒性的區(qū)域內(nèi)的藥物量。因此，脂質(zhì)體包封的藥物可以代表一種方便地策略，該策略可減少HIV向淋巴組織的播散并保持濾泡樹(shù)狀細(xì)胞微環(huán)境，從而有可能防止感染的宿主出現(xiàn)特征性的免疫缺損狀態(tài)。
與母體藥物相比，使用脂質(zhì)體作為釋藥系統(tǒng)具有很多益處。例如，脂質(zhì)體可以防止藥物被酶降解、改善它們的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布并控制治療藥物向適當(dāng)?shù)募?xì)胞中釋放。另外，脂質(zhì)體的分布及其治療利用度可以通過(guò)其體積、層數(shù)、類脂組成、電荷以及表面性質(zhì)的改變進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此必需使脂質(zhì)體的理化性質(zhì)與所需的治療目的相適應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)目的是生產(chǎn)一種用于治療AIDS及其它病毒性疾病的藥物脂質(zhì)體組合物。這種靶向釋藥系統(tǒng)有望在患有AIDS或其它病毒性疾病的患者中增強(qiáng)抗病毒藥物的效果并減弱其毒性。另外，將藥物包封于脂質(zhì)體中所產(chǎn)生的改善的藥物生物利用度可以縮短服藥間隔，從而改善HIV及其它病毒感染的患者的生活質(zhì)量。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療病毒性疾病的方法，包括給予包封于脂質(zhì)體內(nèi)的抗病毒藥物。本發(fā)明還涉及用于治療病毒性疾病、尤其是治療由病毒(例如HIV和CMV)引起的感染的脂質(zhì)體組合物。該脂質(zhì)體組合物由特定種類的類脂成分組成并含有包封的可有效抵抗病毒性疾病的藥物。本發(fā)明的創(chuàng)造性是該藥物脂質(zhì)體組合物可以在不同的細(xì)胞系中具有高的細(xì)胞穿透能力，在體外對(duì)HIV和CMV具有良好的抗病毒活性，在體內(nèi)對(duì)HIV貯主具有有效的靶向能力，并且對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)具有顯著的改善(參見(jiàn)實(shí)施例)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體組合物由摩爾比為10∶3的二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)∶二硬脂?；字８视?DSPG)組成，平均顆粒直徑在大約0.05到0.5μm之間，含有2’，3’-二脫氧肌苷(ddI)作為抗病毒藥物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體組合物由摩爾比為10∶3∶1.45的DSPC∶DSPG∶二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG)組成，平均顆粒直徑在大約0.05到0.5μm之間，含有2’，3’-二脫氧肌苷(ddI)作為抗病毒藥物。在上述優(yōu)選實(shí)施方案中，聚乙二醇的分子量在大約500至5000道爾頓之間。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體組合物由摩爾比為4∶1∶5的二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)∶磷酸三十二烷酯(DP)∶膽甾醇(CHOL)組成，平均顆粒直徑在大約0.05到0.5μm之間，含有2’，3’-二脫氧胞苷(ddC)作為抗病毒藥物。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體組合物由摩爾比為10∶3的DPPC∶二棕櫚?；字８视?DPPG)組成，平均顆粒直徑在大約0.05到0.5μm之間，含有膦甲酸作為抗病毒藥物。
附圖概述

圖1a和1b表明游離ddI和脂質(zhì)體ddI(20μM ddI)在U937細(xì)胞(圖1a)和RAW264.7細(xì)胞(圖1b)中的聚集量關(guān)于時(shí)間的函數(shù)。圖1c和1d表明游離ddC和脂質(zhì)體ddC(25μM ddC)在U937細(xì)胞(圖1c)和RAW264.7細(xì)胞(圖1d)中的聚集量關(guān)于時(shí)間的函數(shù)。圖1e和1f分別表明游離的和脂質(zhì)體包裹的ddC和膦甲酸在RAW264.7細(xì)胞中的藥物濃度的函數(shù)。
圖2a、2b和2d分別表示游離的和脂質(zhì)體ddI(40μM ddI)、ddC(0.01μM ddC)和膦甲酸(1μM膦甲酸)在HIV-1IIIB感染的U937細(xì)胞中的抗病毒活性。圖2c和2e分別表示游離的和脂質(zhì)體ddC(0.01μM ddC)和膦甲酸(1μM膦甲酸)在HIV-1IIIB感染的Molt-4克隆8細(xì)胞中的抗病毒活性。圖2f表示游離的和脂質(zhì)體膦甲酸(1μM)在HIV-IIIIB感染的Supt-1細(xì)胞中的抗病毒活性。圖2g表示游離的和脂質(zhì)體膦甲酸(分別為PFA和L-PFA)對(duì)人肺纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞系)中CMV p72蛋白表達(dá)的抑制作用。
圖3a、3b和3c表示將游離ddI或包裹于由摩爾比為10∶3的DSPC∶DSPG組成、平均顆粒直徑為0.175μm的脂質(zhì)體中的ddI對(duì)大鼠給藥后，游離ddI(圖3a)、脂質(zhì)體ddI(圖3b)和脂質(zhì)體類脂(圖3c)在血漿和組織中的分布。圖3d和3e表示將包裹于由摩爾比為10∶3∶1.45的DSPC∶DSPG∶DSPE-PEG組成、平均顆粒直徑為0.150μm的脂質(zhì)體中的ddI對(duì)大鼠給藥后，脂質(zhì)體ddI(圖3d)和脂質(zhì)體類脂(圖3e)在血漿和組織中的分布。圖3f、3g、3h和3i表示將游離ddC或包裹于由摩爾比為4∶1∶5的DPPC∶DS∶CHOL組成、平均顆粒直徑為0.300μm的脂質(zhì)體中的ddC對(duì)大鼠靜脈內(nèi)(圖3f和3g)或腹膜內(nèi)(圖3h和3i)給藥后1小時(shí)(圖3f和3h)和3小時(shí)(圖3g和3i)，游離的和脂質(zhì)體ddC(ddC和L-ddC)在血漿和組織中的分布。圖3i、3k和3l表示將游離膦甲酸或包裹于由摩爾比為10∶3的DPPC∶DPPG組成、平均顆粒直徑為0.165μm的脂質(zhì)體中的膦甲酸對(duì)大鼠給藥后，脂質(zhì)體膦甲酸(圖3j)、游離膦甲酸(圖3k)和脂質(zhì)體類脂(3l)在血漿和組織中的分布。在圖3a至3l中，數(shù)值表示從每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組4至6只動(dòng)物得到的平均值(±SEM)。
發(fā)明詳述類脂成分在以脂質(zhì)體為主的產(chǎn)品中，有必要利用脂質(zhì)體雙層特性，其可使藥物包囊高效性以及包埋藥物降低的滲漏利用脂質(zhì)體將高量抗病毒藥物釋放到感染細(xì)胞中。在本發(fā)明范圍藥物中，通過(guò)使用以下組成的脂質(zhì)體即可達(dá)到這些要求i)二?；字Ｄ憠A和二酰基磷脂酰甘油混合物(摩爾比在10∶1和1∶1之間)，其中?；湠轱柡突虿伙柡偷?4至18碳鏈，或者ii)摩爾比為4∶1∶5的二酰基磷脂酰膽堿∶磷酸三十二烷酯∶膽固醇，其中二?；字Ｄ憠A的?；湠轱柡突虿伙柡偷?4至18碳鏈。
本發(fā)明的脂質(zhì)體包括立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體，本文所定義的為由上述類脂組分組成的脂質(zhì)體，其可通過(guò)混合聚合物(例如poloxamers和poloxamines)或混合由聚合物(如DSPE-PEG或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE-PEG))衍生出的兩親類脂而改良。DSPE-PEG的合成細(xì)節(jié)如實(shí)施例1所示。本發(fā)明的脂質(zhì)體包括免疫脂質(zhì)體，本文所定義的為由上述類脂組成的脂質(zhì)體或立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體，其可通過(guò)偶聯(lián)可增強(qiáng)定位特定細(xì)胞的抗體分子而改良。
并不是所有測(cè)試的脂質(zhì)體組合物都顯示出有效的藥物包囊和藥物潴留。例如，ddI在由摩爾比為55∶45的蛋磷脂酰膽堿∶膽固醇組成的脂質(zhì)體中的包埋表現(xiàn)出有效的藥物包囊，其比觀察到的由摩爾比為10∶3的DSPC∶DSPG組成的脂質(zhì)體低約30倍。另外，在人血清中僅培養(yǎng)1小時(shí)后，從由摩爾比35∶45∶10的蛋PC∶膽固醇∶心脂質(zhì)組成的多層囊中即釋放出多于90％的ddI。相反，在類似條件下于人血清中培養(yǎng)5小時(shí)后，從由摩爾比10∶3的DSPC∶DSPG組成的多層囊中僅釋放出10％的ddI。
盡管以下實(shí)施例描述了特定的脂質(zhì)體組合物，但是顯然易于從其得到許多脂質(zhì)體組合物而不影響其有用的特性。因此，這些化合物包括已在實(shí)踐中檢測(cè)的磷脂組合物的其它?；湣Ｖ|(zhì)體的制備在過(guò)去的幾年中已發(fā)展了大量的脂質(zhì)體制備技術(shù)以適應(yīng)不斷增長(zhǎng)的用作藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體系的脂質(zhì)體特殊應(yīng)用。本發(fā)明脂質(zhì)體的制備可通過(guò)許多技術(shù)完成，例如參考文獻(xiàn)中描述的(Szoka and Papahadjopoulos，1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467-508；Nasssander等，1990，liposomes inBiodegradable polymers as drug delivery systems.p.261-338)。其中，薄類脂薄膜水合技術(shù)可迅速并簡(jiǎn)單地制備脂質(zhì)體。由這種技術(shù)制備的脂質(zhì)體多為多層囊，通常為0.2至10微米。薄類脂薄膜水合技術(shù)詳細(xì)描述在實(shí)施例2中。制備脂質(zhì)體的另外一種常用技術(shù)是由Szoka等在美國(guó)專利4235871中描述的反相蒸發(fā)技術(shù)。由這種技術(shù)制備的脂質(zhì)體是單層或復(fù)層的，通常為0.2至5微米。反相蒸發(fā)技術(shù)詳細(xì)描述在實(shí)施例3中。抗病毒藥物本發(fā)明包括任何病毒DNA和/或RNA合成抑制劑和/或HIV蛋白酶抑制劑。這類物質(zhì)包括抗病毒藥物，例如3’-疊氮-3’-脫氧胸苷(AZT)、ddI、ddC、膦甲酸、三氮唑核苷、更昔洛韋和saqiunavir。通過(guò)文獻(xiàn)中描述的一種或多種主動(dòng)和/或被動(dòng)裝填方法(Mayer等，1986，Chem.Phys.Lipids 40333-345)可將這些藥物摻入脂質(zhì)體。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物包括任何粒度的普通顆粒，優(yōu)選直徑在約0.05和0.5微米之間。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物也包括用任何藥物/類脂摩爾比制備的脂質(zhì)體。如前所述，被MPS細(xì)胞攝取的脂質(zhì)體應(yīng)使包埋的抗病毒藥物集中在易受HIV或其它病毒感染的細(xì)胞中，從而提高其抗病毒效果并降低其毒性。因此，下述實(shí)施例意欲說(shuō)明抗病毒藥物(其可非常有效地治療HIV和CMV感染)的特定脂質(zhì)體組合物的制備而不是以任何方式限定本發(fā)明范圍。此外，盡管脂質(zhì)體組合物的效果特定在兩種病毒種類(HIV和CMV)上，但是本發(fā)明包括任何對(duì)病毒DNA和/或RNA合成抑制劑和/或HIV蛋白酶抑制劑效果敏感的病毒。
實(shí)施例1DSPE-PEG的合成如前所述制備二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)(Gabizon and Papahadjopoulos，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA856949-6953；Klibanov等，1990，F(xiàn)EBS Letters 268235-237)。簡(jiǎn)而言之，將含有0.01uCi[14C]-二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE([14C]-DOPE)/μmol類脂的摩爾比為3∶1；3.5的甲氧基聚乙二醇琥珀酰琥珀酸琥珀酰酯(PEG-OSu；MW5000)、DSPE和三乙胺在氯仿中于室溫培養(yǎng)過(guò)夜。然后在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)溶劑，所得干混合物用二次蒸餾水水合。用含有Bio-Gel A-1.5M(50-100目)的柱(32×2cm)過(guò)濾膠束溶液以除去未結(jié)合的PEG-OSu。通過(guò)液閃計(jì)數(shù)(計(jì)數(shù)[14C]-DOPE-PEG)和225nm的吸收(游離PEG-OSu)測(cè)定含有DSPE-PEG的峰級(jí)分。合并含有DSPE-PEG的級(jí)分并用滲析膜(截至分子量(MWCO)為300,000(Spectra-Por，SpectrumMedical，Los Angeles，CA))在水中滲析24小時(shí)，然后凍干。市場(chǎng)上也可買到各種分子量的DSPE-PEG。
實(shí)施例2用薄類脂薄膜水合將2’-3’-雙去氧肌苷(ddI)包囊到由摩爾比10∶3的DSPC∶DSPG和摩爾比為10∶3∶1.45的DSPC∶DSPG∶DSPG-PEG組成的脂質(zhì)體中。按照實(shí)施例1可合成DSPE-PEG，或者市售得到。簡(jiǎn)而言之，在少量[14C]-DPPC(＜0.002％mol/mol)存在下將類脂混合物溶于氯仿∶甲醇(2∶1v/v)，然后在圓底燒瓶中蒸發(fā)溶劑，于燒瓶壁上形成薄類脂薄膜。然后用加入少量放射性標(biāo)記的[3H]ddI且藥物/類脂的摩爾比為2的ddI磷酸鹽緩沖液(PBS，145mM，pH7.4)水合類脂薄膜。室溫放置約30分鐘后，在高于類脂混合物的凝膠至液相轉(zhuǎn)移的溫度機(jī)械攪拌脂質(zhì)體組合物而形成多層囊(MLVs)。用不銹鋼擠壓裝置(Lipex Biomembrane，Vancouver，BC)從0.2微米的聚碳酸酯膜(Nuclepore，Cambridge，MA)擠出MLV。通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)用亞微粒分析儀(Model N2SDCoulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)評(píng)價(jià)囊的粒度分布和均勻度。擠出的DSPC∶DSPG和DSPC∶DSPG∶DSPE-PEG制劑的脂質(zhì)體平均直徑分別為0.175±0.035微米和0.15±0.01微米。將脂質(zhì)體組合物(1毫升)通過(guò)10毫升粗Sephadex G-50柱(Pharmacia LKB，Montreal，QC)離心(4℃，于300克離心15分鐘)、超離心(4℃，于160000g離心90分鐘)或通過(guò)在預(yù)定PBS中滲析而除去未包囊的藥物。藥物包埋的效率用液閃計(jì)數(shù)儀(model LS 6000TA，Beckman Instruments Canada Inc.m Mississauga，ON)測(cè)定。
實(shí)施例3用反相蒸發(fā)法(Szoka and Papahadjopoulos，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198)將2’-3’-雙去氧胞苷(ddC)包囊到由摩爾比為4∶1∶5的DPPC∶DP∶CHOL組成的脂質(zhì)體中。簡(jiǎn)而言之，在少量[1-14C]油酸膽甾醇酯存在下將類脂混合物溶于氯仿∶甲醇(2∶1v/v)，然后在圓底燒瓶中蒸發(fā)溶劑，于燒瓶壁上形成薄類脂薄膜。然后將類脂包埋再溶于異丙醚∶甲醇(3∶0.8v/v)。在該有機(jī)相中加入含有少量放射性標(biāo)記的[3H]-ddC且藥物/類脂的摩爾比為3.6的ddC磷酸鹽緩沖液(PBS，145mM，pH7.4)。然后將兩相混合物于室溫的超聲浴中超聲5分鐘而得均勻溶液。50℃通過(guò)反相蒸發(fā)在控制條件于真空下除去有機(jī)溶劑。然后將脂質(zhì)體懸浮液通過(guò)0.4微米的聚碳酸酯膜擠出。通過(guò)QELS評(píng)價(jià)囊粒度分別和均勻度。擠出的脂質(zhì)體平均直徑為0.300±0.08微米。如上除去未包囊藥物，ddC包囊效率通過(guò)放射性計(jì)數(shù)測(cè)定。
實(shí)施例4
用如上所述的ddC脂質(zhì)體組合物反相蒸發(fā)技術(shù)(實(shí)施例3)將膦甲酸包囊到脂質(zhì)體中，只是類脂組分是摩爾比為10∶3的DPPC∶DPPG。本實(shí)施例中，藥物/類脂的摩爾比是5，[3H]-DPPC和[14C]-膦甲酸分別用作類脂和藥物標(biāo)記物。通過(guò)0.2微米的聚碳酸酯膜擠出脂質(zhì)體懸浮液而得平均直徑為0.165±0.030微米的脂質(zhì)體。如上除去未包囊藥物，膦甲酸包囊效率通過(guò)放射性計(jì)數(shù)測(cè)定。
脂質(zhì)體藥物和游離藥物的比較實(shí)施例細(xì)胞攝取發(fā)明人在體外實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)了游離及脂質(zhì)體包囊的抗HIV藥物在鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞RAW264.7中及人幼單核細(xì)胞U937中的累積。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將融合細(xì)胞在含有不同濃度的游離和脂質(zhì)體包囊抗HIV藥物的培養(yǎng)基(其中加有少量放射性標(biāo)記的藥物和類脂)中培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)時(shí)間移去培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞并用Triton X-100溶液處理。用液閃計(jì)數(shù)儀通過(guò)測(cè)量放射性水平計(jì)算藥物和類脂的攝取。用Pierce二辛可寧酸蛋白分析(Rockford，IL)在微滴定板中測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果表明結(jié)合有ddC的脂質(zhì)體可在RAW264.7和U937細(xì)胞中大大增加藥物的攝取(圖1c、1d和1e)。類似地，脂質(zhì)體膦甲酸在RAW264.7細(xì)胞中的累積大大高于游離藥物(圖1f)。相反，盡管脂質(zhì)體ddI在這些細(xì)胞中的攝取水平與ddC或膦甲酸脂質(zhì)體組合物類似，但是，在兩種細(xì)胞系中觀察到游離ddI更多的累積(圖1a和1b)，這表明與其它抗HIV藥物相比，這些細(xì)胞系對(duì)ddI具有更大的膜滲透性。
體外抗病毒效應(yīng)抗病毒藥物的脂質(zhì)體組合物的抗病毒效應(yīng)也已在不同細(xì)胞系中評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)而言之，用不同株的HIV經(jīng)1(病毒/靶細(xì)胞)的重復(fù)感染感染細(xì)胞并用不同濃度的游離及脂質(zhì)體包囊藥物處理。在不同時(shí)間間隔通過(guò)測(cè)定不含細(xì)胞的上清液中逆轉(zhuǎn)錄酶的活性或者通過(guò)用酶分析測(cè)量病毒p24蛋白來(lái)監(jiān)測(cè)病毒的復(fù)制。通過(guò)聚合物酶鏈反應(yīng)(PCR)分析用HIV引物對(duì)(M661/M667)處理后24小時(shí)監(jiān)測(cè)病毒轉(zhuǎn)錄。PCR評(píng)價(jià)與人細(xì)胞β-珠蛋白基因的含量相適應(yīng)。用四唑比色(MTT)分析法評(píng)價(jià)細(xì)胞活性。結(jié)果表明，在脂質(zhì)體中混合ddC得到與游離藥物對(duì)抗HIV-1IIIB在U937和Molt-4clone-8細(xì)胞中復(fù)制相比較的甚或更好的抗HIV效應(yīng)(圖2b和2c)。類似地，脂質(zhì)體膦甲酸表明了與未包囊藥物對(duì)抗HIV-1IIIB在U937、Molt-4clone-8和Supt-1細(xì)胞中復(fù)制相比較的甚或更好的抗病毒效應(yīng)(圖2d、2e和2f)。盡管ddI脂質(zhì)體組合物的抗病毒效應(yīng)比游離藥物對(duì)抗HIV-1IIIB在U937細(xì)胞中復(fù)制低(圖2a)，但是觀察到脂質(zhì)體ddI對(duì)HIV-1Ada-M在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中的更大抗-HIV效應(yīng)(表1)。應(yīng)理解，由于脂質(zhì)體優(yōu)先被MPS細(xì)胞攝取，在體內(nèi)環(huán)境下更容易觀察到脂質(zhì)體藥物比游離藥物更高的抗-HIV效應(yīng)。
表1游離和脂質(zhì)體ddI在被HIV-1Ada-Ma感染的初期單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中的抗病毒效應(yīng)處理 濃度 p24(ng/ml) 感染后天數(shù)(μM) 713 17未處理 0 161 1,263 7,700脂質(zhì)體ddI0.1 00 01 00 01000 0游離ddI 0.1 00 2801 00 01000 0a將外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞懸浮在48孔板的接種培養(yǎng)基中，濃度為3×106細(xì)胞/毫升。開(kāi)始培養(yǎng)5天后，用PBS漂洗培養(yǎng)基四次以除去未附著細(xì)胞。將附著細(xì)胞在用10,000cpm/孔的HIV-1Ada-M單核細(xì)胞株接種前，首先在有含有藥物的培養(yǎng)基或沒(méi)有含有藥物的培養(yǎng)基存在下預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后，每4至5天更換培養(yǎng)基，并用補(bǔ)充有或沒(méi)有ddI的培養(yǎng)基代替。通過(guò)用酶分析測(cè)定p24的水平了監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制。
游離和脂質(zhì)體包囊的膦甲酸的抗-CMV活性也在胚胎肺成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞系)中評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)而言之，用人CMV AD169株感染細(xì)胞，用系列稀釋的游離和脂質(zhì)體膦甲酸處理。培養(yǎng)96小時(shí)后，將細(xì)胞固定，用單克隆抗體(抗72-kDa早期CMV蛋白)進(jìn)行免疫過(guò)氧化酶染色。計(jì)數(shù)標(biāo)記的血小板，結(jié)果用未處理的感染對(duì)照細(xì)胞與膦甲酸濃度的百分比表示。結(jié)果表明，游離和脂質(zhì)體膦甲酸具有可比的對(duì)CMV p72在MRC-5細(xì)胞系中表達(dá)的抑制活性(圖2g)。
體內(nèi)研究在大鼠中研究了游離和脂質(zhì)體包囊的抗-HIV藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性和組織分布。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)插入動(dòng)物頸靜脈的插管將游離和脂質(zhì)體包囊的藥物以單一靜脈內(nèi)藥團(tuán)劑量注射給雌性Sprague-Dawley大鼠。在特定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，將血樣收集到肝素化試管中，離心分離。在相同的時(shí)間，除去選擇后的組織，洗滌，稱重并勻化。然后根據(jù)商用組織增溶方法處理組織和血漿。用放射性示蹤劑監(jiān)測(cè)所有樣品中的藥物和類脂水平。
結(jié)果清楚地表明，將抗病毒藥物包囊到脂質(zhì)體中與未包囊藥物相比，可在富含巨噬細(xì)胞組織中得到更高的藥物累積(圖3a至3l)。在這些易受HIV感染的組織中較大量抗病毒藥物的釋放以及藥物在潛在毒性位點(diǎn)的降低的釋放可得到具有增加效應(yīng)且降低毒性的抗-HIV藥物。特別地，發(fā)明人表明，脂質(zhì)體膦甲酸在淋巴結(jié)中的累積比游離藥物高8倍(表2；圖3j、3k和3l為相同制劑10mg膦甲酸/kg)。
表2對(duì)大鼠進(jìn)行單一靜脈內(nèi)劑量(10mg膦甲酸/kg)給藥后，在不同組織中游離的和脂質(zhì)體包裹的膦甲酸的曲線下面積。a組織 脂質(zhì)體包裹的膦游離膦甲酸L-膦甲酸/甲酸膦甲酸的比例淋巴結(jié)163.5 20.3 8.1大腦 40.8 3.1 13.2眼睛 86.9 22.9 3.8脾1151.40.8 1495.3肝62.5 1.2 52.1肺59.7 1.5 39.8a數(shù)值用梯形(trapezoidal)規(guī)則從組織分布曲線的平均值計(jì)算得到，以nmol膦甲酸/g組織/h表示。
當(dāng)用脂質(zhì)體膦甲酸代替游離藥物對(duì)動(dòng)物注射時(shí)，在動(dòng)物大腦中也觀察到了藥物聚集量的增加。由于HIV病理學(xué)涉及嚴(yán)重的中央神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所以該特征非常重要。另外，由于我們的數(shù)據(jù)表明在用脂質(zhì)體膦甲酸代替游離藥物進(jìn)行注射后，眼內(nèi)的藥物聚集增加，所以給予脂質(zhì)體膦甲酸可以在HIV感染的患者中改善藥物對(duì)CMV的效力并可用于治療CMV視網(wǎng)膜炎。將抗病毒藥物包裹于脂質(zhì)體中時(shí)，還觀察到了藥代動(dòng)力學(xué)的改善(表3和4；與圖3a至3e和3j至3l中的制劑相同)。發(fā)現(xiàn)包裹藥物的系統(tǒng)清除率比游離藥物低得多，導(dǎo)致脂質(zhì)體藥物的清除半衰期大大增加。將抗病毒藥物包裹于脂質(zhì)體中所引起的藥理學(xué)的改善有望降低常規(guī)治療中所用的抗病毒藥物的劑量以及抗HIV藥物的給藥頻率，從而改善AIDS或其它病毒性疾病患者的生活質(zhì)量。表3對(duì)大鼠進(jìn)行單一靜脈內(nèi)劑量(3mg ddI/kg)給藥后，游離的和脂質(zhì)體ddI的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。a參數(shù)t空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體常規(guī)脂質(zhì)體游離ddIDSPC∶DSPG∶PEG DSPC∶DSPG
(10∶3∶1.45) (10∶3) [3H]ddI[3H]ddI[3H]ddI[14C]DPPC [14C]DPPCt1/2(h) 3.53 14.50 2.64 3.92 0.14AUC0-∞950.3 17420649.9 4971 5.31(nmol/ml/h)Kel(h-1) 0.20 0.048 0.26 0.18 4.97Vdss(1/kg) 0.071 0.077 0.0740.0700.48Cl(1/h/kg) 0.013 0.004 0.0200.0132.39MRT(h) 5.31 21.04 3.79 5.51 0.20a參數(shù)用零室模型從血漿濃度-時(shí)間曲線計(jì)算得到。t縮寫(xiě)t1/2，清除半衰期；AUC0-∞，血漿濃度-時(shí)間曲線下從零到無(wú)窮的曲線下面積；Kel，清除速率常數(shù)；Vdss，穩(wěn)態(tài)分布體積；Cl，系統(tǒng)清除率；MRT，平均保留時(shí)間。表4對(duì)大鼠進(jìn)行單一靜脈內(nèi)劑量(10mg/kg)給藥后，游離的和脂質(zhì)體PFA的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。a藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)t游離膦甲酸 脂質(zhì)體包裹的膦甲酸 脂質(zhì)體類脂[14C]-PFA [14C]-PFA [3H]-DPPCt1/2(h) 0.71±0.04 3.06±0.34 5.44±0.79AUC0-＞∞48.0±9.6 3687.5±374.2 24277.8±2962.8(nmol/ml/h)Kel(h-1)0.96±0.06 0.24±0.03 0.12±0.02Vdss(1/kg) 0.80±0.14 0.040±0.0040.050±0.003Cl(1/h/kg) 0.77±0.15 0.010±0.0010.006±0.001MRT(h) 1.04±0.07 4.52±0.42 7.93±1.12a數(shù)值表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從每組6只動(dòng)物得到的平均值±SD。t縮寫(xiě)t1/2，清除半衰期；AUC0-∞，血漿濃度-時(shí)間曲線下從零到無(wú)窮的曲線下面積；Kel，清除速率常數(shù)；Vdss，穩(wěn)態(tài)分布體積；Cl，系統(tǒng)清除率；MRT，平均保留時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種用于治療病毒性疾病的脂質(zhì)體組合物，含有i)含有摩爾比在10∶1和1∶1之間的二酰基磷脂酰膽堿和二?；字８视偷幕旌衔锏念愔煞郑渲械孽；溈梢允秋柡突虿伙柡偷?，并且鏈長(zhǎng)在14和18個(gè)碳原子之間，和ii)治療量的對(duì)所述病毒性疾病有效的包封藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的脂質(zhì)體組合物，其中所述類脂成分另外含有二?；字Ｒ掖及返木垡叶佳苌?。
3.一種用于治療病毒性疾病的脂質(zhì)體組合物，所述制劑含有i)含有摩爾比為4∶1∶5的二?；字Ｄ憠A∶磷酸三十二烷酯∶膽甾醇的混合物的類脂成分，其中的?；溈梢允秋柡突虿伙柡偷?，并且鏈長(zhǎng)在14和18個(gè)碳原子之間，和ii)治療量的對(duì)所述病毒性疾病有效的包封藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的脂質(zhì)體組合物，其中所述類脂成分另外含有二?；字Ｒ掖及返木垡叶佳苌?。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的脂質(zhì)體組合物，其中的包封藥物選自3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)、ddI、ddC、膦甲酸、三氮唑核苷、更昔洛韋和saquinavir。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為10∶3的二酰基磷脂酰膽堿∶二?；字８视?。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的脂質(zhì)體組合物，其中的包封藥物選自3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)、ddI、ddC、膦甲酸、三氮唑核苷、更昔洛韋和saquinavir。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為10∶3∶1.45的二?；字Ｄ憠A∶二酰基磷脂酰甘油∶二?；字Ｒ掖及?聚乙二醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的脂質(zhì)體組合物，其中的包封藥物選自3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)、ddI、ddC、膦甲酸、三氮唑核苷、更昔洛韋和saquinavir。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的脂質(zhì)體組合物，其中的包封藥物選自3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)、ddI、ddC、膦甲酸、三氮唑核苷、更昔洛韋和saquinavir。
11.根據(jù)權(quán)利要求2、4、8和10中的任意一項(xiàng)的脂質(zhì)體組合物，其中聚乙二醇的分子量為大約500和大約5000道爾頓之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為10∶3的二?；字Ｄ憠A∶二酰基磷脂酰甘油，而包封藥物是2’，3’-二脫氧肌苷。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為10∶3∶1.45的二?；字Ｄ憠A∶二?；字８视汀枚；字Ｒ掖及?聚乙二醇，而包封藥物是2’，3’-二脫氧肌苷。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為10∶3的二?；字Ｄ憠A∶二?；字８视?，而包封藥物是膦甲酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的脂質(zhì)體組合物，其中的類脂成分是摩爾比為4∶1∶5的二棕櫚?；字Ｄ憠A∶磷酸三十二烷酯∶膽甾醇，而包封藥物是2’，3’-二脫氧胞苷。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至10和12至15中的任意一項(xiàng)的脂質(zhì)體組合物，其平均顆粒直徑在大約0.05和0.5μm之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的脂質(zhì)體組合物，其平均顆粒直徑在大約0.05和0.5μm之間。
18.對(duì)病毒性疾病患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者給予權(quán)利要求1至10、12至15、和17中任意一項(xiàng)的脂質(zhì)體組合物。
19.對(duì)病毒性疾病患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者給予權(quán)利要求11的脂質(zhì)體組合物。
20.對(duì)病毒性疾病患者進(jìn)行治療的方法，包括向所述患者給予權(quán)利要求16的脂質(zhì)體組合物。
全文摘要
公開(kāi)了一種治療病毒性疾病的方法，包括給予脂質(zhì)體包裹的抗病毒藥物。還提供了由于治療病毒性疾病、尤其是治療由病毒如人免疫缺損病毒(HIV)和細(xì)胞肥大病毒(CMV)引起的感染的脂質(zhì)體組合物。該脂質(zhì)體組合物由特定種類的類脂成分組成，并含有包封的、可有效抵抗病毒性疾病的藥物。該抗病毒藥物脂質(zhì)體組合物可以在不同的細(xì)胞系中具有高的細(xì)胞穿透能力，在體外對(duì)HIV和CMV復(fù)制具有良好的抗病毒活性，在體內(nèi)對(duì)HIV貯主具有有效的靶向能力，并且對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)具有顯著的改善。
文檔編號(hào)A61K31/70GK1165480SQ95196052
公開(kāi)日1997年11月19日 申請(qǐng)日期1995年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月3日
發(fā)明者M·G·伯杰龍, A·德索梅奧克斯 申請(qǐng)人:M·G·伯杰龍, A·德索梅奧克斯