国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      疫苗佐劑的制作方法

      文檔序號(hào):837006閱讀:460來源:國(guó)知局

      專利名稱::疫苗佐劑的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及新穎的疫苗佐劑??乖欢x為某一生物體的外來物質(zhì),使用時(shí)如非胃腸道給藥時(shí),會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng),例如形成抗體??贵w是包含于血液和其它體液以及組織中的物質(zhì),它與抗原結(jié)合而使之無害??贵w構(gòu)成了身體的天然屏障之一。它們具有很高的特異性,并可殺死、結(jié)合或使引發(fā)抗體形成的抗原無害??乖c免疫系統(tǒng)接觸時(shí)會(huì)激活一系列復(fù)雜的細(xì)胞的相互反應(yīng)以消除抗原和/或再建立以前的平衡??乖卣髦械膬蓚€(gè)特征是它們的免疫原性,即它們能在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)(包括形成特異性的抗體)和它們的抗原性,即它們能被起源為抗原的抗體選擇性地識(shí)別。已知如何通過使用疫苗來給予特定的抗原,從而故意刺激免疫反應(yīng)。該程序可獲得生物體內(nèi)的一種免疫應(yīng)答狀態(tài),該狀態(tài)使生物體以后與抗原接觸時(shí)可產(chǎn)生更為迅速和有效的應(yīng)答。但是,有些抗原只有微弱的免疫原性,它們引發(fā)不充足的免疫反應(yīng)以獲得對(duì)生物體的有效保護(hù)??赏ㄟ^與稱為佐劑的物質(zhì)的混合使用,來增加抗原的免疫原性,佐劑或者通過直接對(duì)免疫學(xué)系統(tǒng)的作用或者通過修飾抗原的藥物動(dòng)力學(xué)特性來增加對(duì)抗原的應(yīng)答,這樣增加了抗原與免疫系統(tǒng)相互作用的時(shí)間。目前,大量獸用疫苗所使用的疫苗仍含有標(biāo)準(zhǔn)的礦物油乳劑,如礦物油包水型(W/O)或水包油型(O/W)佐劑。若干年以來,已開始調(diào)查研究以尋找低毒的、有類似效力的替代物。注射基于礦物油的標(biāo)準(zhǔn)佐劑常伴有局部反應(yīng),其嚴(yán)重程度在很大程度上取決于乳劑的類型以及所用的油的性質(zhì)。因此,基于礦物油的佐劑僅限于用于家畜(豬、雞、反芻動(dòng)物等)和試驗(yàn)動(dòng)物。早些時(shí)候,已表明多聚蔗糖和表氯醇(epichloridrin)的合成共聚物-菲可(Ficoll)-具有硫酸根基和脂基(SL-菲可),當(dāng)摻入水包角鯊?fù)?S)(S/W)型乳劑中時(shí),在不同動(dòng)物(包括豬)中對(duì)不同類型的抗原具有高佐劑效應(yīng),其中包括一些重要的病毒抗原(疫苗,Vol.12,pp653-660(1994)和疫苗,Vol.12,pp.661-665(1994),EPO0,549,074)。這些基于菲可的佐劑制劑足以有效地替換在不同的豬疫苗中所用的標(biāo)準(zhǔn)水包礦物油型制劑。然而,局部毒性即這些基于菲可的制劑在豬和小鼠中的反應(yīng)原性(reactogenicity)并不弱于標(biāo)準(zhǔn)的O/W型礦物油制劑。此外,對(duì)于基于菲可的制劑,溫度對(duì)乳劑的穩(wěn)定性有明顯的影響。某些乳劑在4℃可穩(wěn)定存在數(shù)年,但在37℃時(shí)水相和油相會(huì)在數(shù)天內(nèi)分離,而在60℃約10分鐘便分離了。本發(fā)明的目的是提供一種有效的疫苗佐劑,它在高溫下有更高的穩(wěn)定性而且局部毒性更低。該目的是通過這樣的一種疫苗佐劑實(shí)現(xiàn)的,該佐劑含有硫脂多糖和界面形成成分(如油/水型(O/W)乳劑)。本發(fā)明佐劑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是,與基于菲可的佐劑相比,它在高溫下更穩(wěn)定。該目的是通過含有硫脂多糖和界面形成成分的疫苗佐劑而實(shí)現(xiàn)的。術(shù)語“多糖”指具有至少3個(gè)相互共價(jià)連接的重復(fù)糖單元的化合物。術(shù)語“硫脂多糖”指這樣的化合物,它具有至少3個(gè)相互共價(jià)連接的重復(fù)糖單元、至少一個(gè)硫酸根基(sulfategroup)和至少一個(gè)脂基。較佳地,硫脂多糖是疏水性多糖。術(shù)語“疏水多糖”指多糖在水相中的溶解性低于在非極性有機(jī)相中的溶解性。根據(jù)第一個(gè)有利的例子,硫脂多糖選自下組環(huán)糊精、麥芽糖糊精、菊糖、菲可和支鏈淀粉(Pullulan)。較佳地,硫脂多糖選自環(huán)糊精、麥芽糖糊精和菊糖。優(yōu)選的硫脂多糖是環(huán)糊精。平均地,硫脂多糖含有至少0.01個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,硫脂多糖平均含有至少0.12個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。平均地,硫脂多糖含有至多1.0個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,硫脂多糖平均含有至多0.23個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是麥芽糖糊精時(shí),它平均含有約0.23個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是環(huán)糊精時(shí),它平均含有約0.20個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菊糖時(shí),它平均含有約0.19個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是支鏈淀粉時(shí),它平均含有約0.16個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菲可時(shí),它平均含有約0.12個(gè)硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。平均地,硫脂多糖含有至少0.01個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,硫脂多糖平均含有至少1.05個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。平均地,硫脂多糖含有至多2.0個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,硫脂多糖平均含有至多1.29個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是麥芽糖糊精時(shí),它平均含有約1.29個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是環(huán)糊精時(shí),它平均含有約1.05個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菊糖時(shí),它平均含有約1.24個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是支鏈淀粉時(shí),它平均含有約1.24個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菲可時(shí),它平均含有約1.22個(gè)脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。脂基較佳地含有4-22個(gè)碳原子。硫酸根基對(duì)脂基的比例較佳地為0.01-2個(gè)硫酸根基/脂基。更佳地,硫酸根基對(duì)脂基的比例為0.10-0.19個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持化合物的疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是麥芽糖糊精時(shí),硫酸根基對(duì)脂基的比例約為0.18個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是環(huán)糊精時(shí),硫酸根基對(duì)脂基的比例約為0.19個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菊糖時(shí),硫酸根基對(duì)脂基的比例約為0.15個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是支鏈淀粉時(shí),硫酸根基對(duì)脂基的比例約為0.13個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。較佳地,當(dāng)硫脂多糖是菲可時(shí),硫酸根基對(duì)脂基的比例約為0.10個(gè)硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。術(shù)語“界面形成成分(interface-formingconstituent,IFC)”指這樣的物質(zhì),它在水介質(zhì)中會(huì)在物質(zhì)和水相之間形成物理界面。界面形成成分選自水不混溶性液體(如角鯊?fù)?、豆油、礦物油、十六烷)或在水相中不溶的固體。本發(fā)明的在水相中不溶的固體包括不溶性鹽類(如Al(OH)3、AlPO4、明礬、草酸鈣),微顆粒,納顆粒(nanoparticles),一種或多種聚合物、共聚物(如聚丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚交酯、聚乙交酯(polyglycolide))的微球或納球(nanosphere),脂雙層或親脂劑(如磷脂)或表面活性劑的微團(tuán)。較佳地,“IFC”是水不混溶性液體。有利的,界面形成成分選自豆油、角鯊?fù)楹褪?。穩(wěn)定的疫苗佐劑是那些含有(疏水的)硫脂多糖衍生物、界面形成成分和乳化劑的佐劑。此外,本發(fā)明佐劑的效力與標(biāo)準(zhǔn)佐劑的效力相當(dāng),甚至更好。局部毒性即本發(fā)明佐劑的反應(yīng)原性一般小于標(biāo)準(zhǔn)佐劑而且也小于基于菲可的佐劑。似乎分子量較低的硫脂多糖的局部毒性更低。根據(jù)本發(fā)明的另一方面,提出用硫脂多糖作為疫苗中的佐劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面,提出了一種制備乳劑中疫苗的方法,它的特征是將抗原水溶液在硫脂多糖、乳化劑和界面形成成分存在下進(jìn)行乳化。根據(jù)本發(fā)明的另一特征,提出了一種疫苗,它含有致免疫量的抗原(免疫原)和本發(fā)明的佐劑。較佳地,佐劑的濃度是0.1-100mg/ml,更佳地為2-20mg/ml。除了佐劑、抗原,疫苗還可含有例如滅活的病毒、活病毒、細(xì)菌、亞基、蛋白質(zhì)、肽和滅活的流感病毒株MRC-11、卵白蛋白(OVA)、滅活的流感病毒株A/Swine和/或滅活的假性狂犬病毒(iPRV)。測(cè)得的抗體效價(jià)高于使用那些在商業(yè)產(chǎn)品中所用的水包礦物油型乳劑時(shí)所獲得的效價(jià)。已表明,在SL-菲可和乳劑之間有強(qiáng)烈的增效活性,這在豬中比在小鼠中更明顯(Hilgers等人,疫苗,Vol.12,pp.661-664,1994)。在小鼠中的抗體應(yīng)答大大增加(Hilgers等人,疫苗,Vol.12,pp.653-660,1994)。結(jié)論是,反應(yīng)原性取決于制劑中所含的多糖和油的類型,而且多糖的分子量是重要因素之一。環(huán)糊精及其衍生物是眾所周知的,它們能夠形成包含復(fù)合體,其中在它們環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成的空穴中包裹其他物質(zhì)如藥物。這些包含復(fù)合體提供的好處有改善了溶解性,改善了生物有效性(bioavailbility)和/或化學(xué)穩(wěn)定性,提高了半衰期長(zhǎng)度,減少了副作用,以及提供了生產(chǎn)過程中的某些好處,如更易獲得干粉末以用作液體制劑的起點(diǎn)。除了用作佐劑之外,基于環(huán)糊精的硫脂多糖(SLP)還有令人感興趣的用途,這如下所述。事實(shí)上,SL-環(huán)糊精是表面活性劑,因?yàn)樵谶@些分子中同時(shí)存在陰離子基團(tuán)(硫酸根基)和疏水基團(tuán)(脂族鏈)。該特性導(dǎo)致在水相中會(huì)形成微團(tuán),或者在其他表面活性劑存在下會(huì)形成混合微團(tuán),以及形成水不混溶性液體的乳劑,不溶性顆粒在水相中懸浮,或在水相和液態(tài)或固態(tài)的不溶性物質(zhì)之間形成界面。因此,SL-環(huán)糊精提供了能夠形成包含復(fù)合體和能夠作為表面活性劑的雙重優(yōu)勢(shì)。因此可以認(rèn)為它們構(gòu)成了一族具有新特性的產(chǎn)品,這些特性使其在藥物領(lǐng)域中有開創(chuàng)性的用途。已獲得了各種不同的SL-環(huán)糊精;因環(huán)糊精的類型(如α、β、γ)、硫酸根基的含量以及脂基的性質(zhì),造成它們的生理化學(xué)特性有所不同,實(shí)施例1測(cè)試不同的多糖,以確定它們?cè)谟糜诤铣傻挠袡C(jī)溶劑中的溶解性,那些溶解性不夠的多糖被放棄。將4.5克麥芽糖糊精(麥芽糖糊精15;Amylum,Belgium)、4.5克β-環(huán)糊精(ACROS)、4.5克菊糖(DahliaTubers;Sigma,USA)和4.5克支鏈淀粉(HayashibaraCo.Ltd.,Japan)分別溶解于100毫升的無水二甲基甲酰胺和無水吡啶(體積比1∶1)的混合物中。在短時(shí)間內(nèi)(48小時(shí)),這些多糖的溶液通過分子篩(規(guī)格2埃)(Merch,Darmstadt,Germany)而加以干燥。加入6.6克月桂酰氯(Merck,Germany),然后混合物在60℃下保溫6小時(shí),并在室溫(約15-22℃)下保溫18小時(shí)。然后,加入處于(10毫升)無水二甲基甲酰胺和無水吡啶的混合物中0.6克氯磺酸(Merck,Germany),重復(fù)在室溫的保溫程序。在60℃通過減壓(200mb)蒸發(fā)1-2小時(shí)而去除溶劑,然后在截?cái)嚅撝禐?0,000D的再生纖維素膜上,用等滲的磷酸鹽緩沖液(該磷酸鹽溶液在每升水中含有8克氯化鈉、0.2克氯化鉀和1.15克磷酸氫二鈉,pH7.3)、并隨后用超純水進(jìn)行透析,直到在濾液中不再檢測(cè)到微量的溶劑。透析溶液(PBS鹽溶液或超純水)與透析過程中所用的殘留物的體積比維持在10∶1(體積/體積)之上。透析進(jìn)行至少10天,而且透析溶液至少每天更換一次。這樣獲得的硫脂多糖(SLP)在室溫下凍干,其中內(nèi)壓低于0.1mb,而冷阱溫度低于-25℃。用如上所述的方法(疫苗,Vol.12,pp.653-660),通過分析多糖、結(jié)合的硫酸根基、總脂含量和結(jié)合的脂類含量,確定SLP的組成。通過先將SLP溶解在最小體積(20毫升)的甲基叔丁基醚(Merck)中,然后對(duì)每克SLP加入2毫升Tween80(Merck),在高溫(±60℃)和減壓(50mb)下蒸發(fā)甲基叔丁基醚直至獲得Tween80中的SLP粘溶液。這樣制得SLP在磷酸鹽溶液(PBS)中1重量%/體積(wt/vol)的溶液(含2%體積/體積(v/v)Tween80)。對(duì)每克SLP緩慢加入10毫升水,然后加入適當(dāng)體積的PBS和油。用微液化器(microfluidizer)(MicrofluidicsCorp.,Newton,USA)使混合物乳化,直到在顯微鏡下(放大1000倍)看不到大于2或3微米的油滴。乳劑在使用前在4℃下儲(chǔ)存。通過混合一份體積的抗原和一份體積的佐劑而制備疫苗??乖缟戏ㄟM(jìn)行制備(疫苗,Vol.12,pp653-660(1994)和疫苗,Vol.12,pp.661-665(1994))。使用兩種不同抗原的溶液溶液II在每毫升中含有10微克滅活的流感病毒株MRC-11(SOLVAYDUPHAR)+1000微克OVA(SIGMA);而溶液I在每毫升中含有4.4微克/毫升滅活的流感病毒株A/Swine(SOLVAYDUPHAR)、4.0微克滅活的流感病毒株MRC-11(SOLVAYDUPHAR)、2.0微克滅活的流感病毒株X-79(SOLVAYDUPHAR)和108TCID50滅活的假性狂犬病毒(iPRV)(SOLVAYDUPHAR)。通過在爪中注射0.025毫升的疫苗而使8-10周大小(約20克)的雌性NMRI小鼠(CharlesRiver,Germany)免疫,在3周后測(cè)定抗體效價(jià)??贵w效價(jià)用幾何平均值(2log+SEM)表示。用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試方法進(jìn)行抗體效價(jià)的分析,判斷有效的標(biāo)準(zhǔn)是早先描述過的(疫苗,Vol.12,pp653-660(1994))。進(jìn)行Student氏t-測(cè)驗(yàn),以分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性,p<0.05被認(rèn)為是顯著的。在2個(gè)獨(dú)立的小鼠試驗(yàn)中,測(cè)試佐劑制劑。表I.某些基于油包硫脂多糖(SLP)和水包硫脂多糖的乳劑在小鼠中的佐劑效應(yīng)<p>n=動(dòng)物數(shù)目SEM=離平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差W=水S=角鯊?fù)樗械腟LP/油/水乳劑都增加了對(duì)流感病毒株MRC-11和OVA的體液的應(yīng)答。已表明,就涉及到的不同制劑的佐劑效應(yīng)而言,它們之間存在差異,而且某些引起的活性相當(dāng)于SL-菲可/S/W的活性。沒有觀察到SLP類型造成的明顯效應(yīng)。至于所用的油類型,含有角鯊?fù)?S)的乳劑產(chǎn)生的應(yīng)答大大高于含十六烷的乳劑,而豆油造成的應(yīng)答最低。實(shí)施例2測(cè)試8-10周大小的豬,以檢測(cè)是否存在抗欲測(cè)病毒抗原的抗體。具有可檢測(cè)的抗體效價(jià)的動(dòng)物被排除在外。用實(shí)施例1中所述的方法制備SLP在水包角鯊?fù)槿閯┲械闹苿?,以及以品名SUVAXYNO/WEMULSION(SOLVAYDUPHAR)出售的水包礦物油型乳劑。用實(shí)施例1中所述的方法制備疫苗,它含有佐劑制劑。測(cè)試SLP/角鯊?fù)?水制劑,以確定它們對(duì)用iPRV和滅活的流感病毒--株MRC-11和A/Swine作為抗原免疫的豬所產(chǎn)生的佐劑效果(表II)。動(dòng)物被免疫兩次(0周和3周時(shí)),在第二次注射后3周測(cè)定抗體效價(jià)。用SL-菲可/角鯊?fù)?水、SL-麥芽糖糊精15/角鯊?fù)?水、SL-菊糖/角鯊?fù)?水和SL-環(huán)糊精/角鯊?fù)?水乳劑都增加了針對(duì)PRV(抗-PRV)的抗體效價(jià)。測(cè)得了抗體效價(jià)與用市售產(chǎn)品中水包礦物油型乳劑所獲得的結(jié)果相當(dāng)或更好。不同的SLP/角鯊?fù)?水制劑還增加了對(duì)A/Swine的抗體應(yīng)答,但是某些應(yīng)答與用標(biāo)準(zhǔn)的油/水乳劑所獲得的結(jié)果一樣高。不同的制劑增加了對(duì)MRC-11的抗體效價(jià),而且某些SLP/角鯊?fù)?水乳劑產(chǎn)生的效價(jià)與那些用礦物油/水乳劑所獲得的結(jié)果相當(dāng)或更高。這些分析結(jié)果列于表II。表II.不同的硫脂多糖與數(shù)種水包油型乳劑對(duì)抗-iPRV/A/Swine/MRC-11抗體應(yīng)答的影響,在豬中測(cè)定SEM=離平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差S=角鯊?fù)閃=水從上述同時(shí)在兩種動(dòng)物上測(cè)試佐劑效果的試驗(yàn)中可以看出,在SL-菲可和乳劑間有強(qiáng)烈的協(xié)同活性,而且在豬中的協(xié)同活性比在小鼠中更明顯(疫苗,Vol.12,pp653-660(1994)和疫苗,Vol.12,pp.661-664(1994))。在小鼠中抗體應(yīng)答被大大增加,而且已表明,所用的油類型有明顯的影響,而多糖類型沒有明顯影響。在小鼠中,與沒有接受抗原的動(dòng)物相比所增加的因子僅限于1或2個(gè)2log單位。在豬中,佐劑效果更明顯,主要是因?yàn)獒槍?duì)沒有佐劑的抗原的應(yīng)答非常低???iPRV和抗-A/Swine和抗-MRC-11的抗體效價(jià)增加了6個(gè)2log單位以上?;诘V物油的佐劑大大增加抗體應(yīng)答,但是不同的新佐劑制劑甚至造成更高的效價(jià),上述的FL-菲可/S/W佐劑(疫苗,Vol.12,pp653-660(1994)和疫苗,Vol.12,pp.661-665(1994))表明比礦物油更有效,而某些新SLP可產(chǎn)生與SL-菲可相當(dāng)或更高的活性。實(shí)施例3除了佐劑效果之外,其他特性在評(píng)估疫苗中也是重要的。它們包括局部反應(yīng),這是一個(gè)重要方面,盡管在注射部位有一定程度的反應(yīng)一般為某些動(dòng)物品種所接受。在注射疫苗之后,通過在體內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠爪的腫脹而測(cè)試局部毒性。已表明該方法非常靈敏。用實(shí)施例1所述的方法,制備SLP在角鯊?fù)?水型、豆油/水型、礦物油和十六烷/水型乳劑中的制劑,以及不含佐劑的對(duì)照制劑。用實(shí)施例1中所述的方法制備疫苗,它含有佐劑制劑。將每組6只小鼠,通過在后左腳的腳掌中皮下注射25微升疫苗而進(jìn)行處理。疫苗含有抗原溶液,該溶液含有10微克MRC-11和1毫克卵白蛋白(OVA)/毫升PBS和1體積佐劑。在注射前一天以及在注射后若干次,用半電子式設(shè)備(尤其是荷蘭的StateUniversityofUtrecht開發(fā)的用于該目的的設(shè)備)測(cè)量爪的厚度。該設(shè)備的精度約為0.02毫米。從處理后的爪厚度中減去處理前的爪厚度而計(jì)算出腫脹,它用0.01毫米進(jìn)行表示。這些試驗(yàn)的結(jié)果列于表III。表III.不同的佐劑在小鼠中的反應(yīng)原性試驗(yàn)I</tables>S=角鯊?fù)閃=水試驗(yàn)IIS=角鯊?fù)閃=水制劑引起注射部位不同程度的腫脹,而且在某些情況下在第一天腫脹非常厲害,腫脹會(huì)慢慢消退(表III)。含有十六烷的乳劑一般會(huì)比含有豆油的乳劑造成更強(qiáng)烈的反應(yīng)。至于SLP,含有SL-菲可的角鯊?fù)槿閯┰斐筛鼜?qiáng)的腫脹,它維持了3周以上。含有SL-麥芽糖糊精15、SL-菊糖或SL-支鏈淀粉的乳劑造成了相當(dāng)?shù)哪[脹反應(yīng),然而該腫脹比那些由SL-菲可造成的腫脹消退快得多,它們僅持續(xù)了1-2周。包含在不同油中的SL-環(huán)糊精的反應(yīng)原性是非常弱的,或者甚至沒有。含有在角鯊?fù)榛蚴橹械腟L-環(huán)糊精的乳劑造成了注射后1-2天的某些腫脹,而在豆油中的SL-環(huán)糊精不造成肉眼可見的反應(yīng)。在小鼠上測(cè)試的反應(yīng)原性,即局部毒性,有明顯效果,該效果是油類型和多糖類型的作用。一般,SL-菲可比其他測(cè)試的SLP造成更強(qiáng)的反應(yīng)。SL-菲可與角鯊?fù)榛虻V物油混合時(shí),造成非常強(qiáng)且持續(xù)的局部反應(yīng),而與十六烷和豆油混合的SL-菲可僅分別產(chǎn)生中等或弱反應(yīng)(表II)。至于角鯊?fù)榈娜閯┍饶切┖惺榈娜閯┰斐蓮?qiáng)得多的反應(yīng)。豆油僅造成非常弱的反應(yīng)。這些油的疏水性有差別。角鯊?fù)椤⒌V物油和十六烷是非常疏水的烴,而豆油(它是不同物質(zhì)的混合物)疏水性較低。不同油的疏水性,可用為了在獲得水中的穩(wěn)定乳劑而需要的清潔劑的HLB值來表示。SL-支鏈淀粉比其他3種SLP造成更強(qiáng)的局部毒性。SL-菊糖和SL-麥芽糖糊精15造成相當(dāng)?shù)木植磕[脹,而SL-環(huán)糊精僅在1或2天內(nèi)造成明顯的反應(yīng)。在其他性質(zhì)中,SLP的分子量有差別,它以SL-菲可=SL-支鏈淀粉>SL-菊糖>SL-麥芽糖糊精15>SL-環(huán)糊精的次序遞減??捎^察到反應(yīng)原性和分子量之間的平行關(guān)系,但是需要進(jìn)一步研究以建立直接關(guān)系。從上述內(nèi)容可以得出結(jié)論,反應(yīng)原性取決于制劑中所包含的多糖和油的類型,而且多糖的分子量是一個(gè)重要因素。實(shí)施例4合成麥芽糖糊精15、菊糖、環(huán)糊精和支鏈淀粉的硫脂衍生物,將它們摻入基于角鯊?fù)?、礦物油、十六烷和豆油的水包油型乳劑中,然后在體外研究穩(wěn)定性。用實(shí)施例1所述的方法合成本發(fā)明的SLP,然后混合在角鯊?fù)椤⑹楹投褂偷乃托腿閯┲?,在體外研究這些乳劑的穩(wěn)定性。用實(shí)施例1所述的方法制備SLP在水包角鯊?fù)椤⑺褂秃退槿閯┲械闹苿?。通過將制劑暴露于高溫一段時(shí)間而測(cè)試乳劑的穩(wěn)定性。一般,乳劑在高溫下更不穩(wěn)定,因而可認(rèn)為在高溫下進(jìn)行的測(cè)試可表示在較低溫度下的長(zhǎng)期行為。在37℃研究乳劑的穩(wěn)定性。將各份5毫升的滅菌乳劑在37℃保溫,每天用肉眼觀察乳劑,以證實(shí)形成油滴、出現(xiàn)油相和其他變化。將S/L比值約為0.1/1.0的SLP摻入到基于角鯊?fù)?、十六烷和豆油的水包油型乳劑中。將含?.01%(w/v)乙基汞硫代水楊酸鈉(SIGMA)的滅菌試樣在37℃下保溫,按不同的時(shí)間間隔通過肉眼觀察而確定乳劑的狀態(tài)。這些試驗(yàn)的結(jié)果列于表IV。表IV.不同油的不同乳劑的穩(wěn)定性,其中SLP在PBS中的終濃度為1%(w/v)SLP、2%(v/v)Tween80、10%(v/v)油佐劑[mgSLP和μl油]/ml37℃下穩(wěn)定性(天)12710142128354653115SL-麥芽糖糊精15/S/W[10/100]++++±+++++±/+SL-環(huán)糊精/S/W[10/100]++++++++++±/+SL-菊糖/S/W[10/100]++++++±±+++SL-支鏈淀粉/S/W[10/100]++++++++±---SL-麥芽糖糊精15/豆油/W[10/100]+++++++++++SL-環(huán)糊精/豆油/W[10/100]+++++++++++SL-菊糖/豆油/W[10/100]+++++++++++SL-支鏈淀粉/豆油/W[10/100]++++++++++-SL-麥芽糖糊精15/十六烷/W[10/100]+++++++++++SL-環(huán)糊精/十六烷/W[10/100]++++++++++±SL-菊糖/十六烷/W[10/100]++++++++++±SL-支鏈淀粉/十六烷/W[10/100]++++++++++-</table></tables>S=角鯊?fù)閃=水--=兩相;油相和透明水相-=兩相;油相和白色水相±=在水相中有小油滴,肉眼可見+=白色均勻的乳劑,沒有肉眼可見的油滴±/+=在“±”和“+”之間摻入在這些角鯊?fù)橛?、十六烷或豆油的乳劑中的新SLP(SL-支鏈淀粉、SL-菊糖、SL-麥芽糖糊精15和SL-環(huán)糊精)有顯著的穩(wěn)定性。SL-菊糖、SL-環(huán)糊精和SL-麥芽糖糊精15在角鯊?fù)橹械娜閯┰?7℃可穩(wěn)定存在超過53天。與SL-菲可/角鯊?fù)?水型乳劑相比,這是重大進(jìn)步。盡管在37℃的穩(wěn)定性測(cè)試的預(yù)見性價(jià)值有限,但是它表明對(duì)導(dǎo)致不穩(wěn)定因素的抵抗性提高了。所有的乳劑,除了SL-支鏈淀粉/角鯊?fù)?水之外,都可在37℃下維持穩(wěn)定至少53天。在115天之后,含有SL-麥芽糖糊精15、SL-環(huán)糊精和SL-菊糖的大多數(shù)乳劑維持穩(wěn)定,盡管含角鯊?fù)楹褪榈娜閯╋@示在乳劑上有一些小油滴。權(quán)利要求1.一種疫苗佐劑,其特征在于,含有硫脂多糖和界面形成成分。2.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是疏水的多糖。3.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖選自下組環(huán)糊精、麥芽糖糊精、菊糖、菲可和支鏈淀粉。4.如權(quán)利要求3所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是環(huán)糊精。5.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至少0.01硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。6.如權(quán)利要求5所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至少0.12硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。7.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至多1.0硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。8.如權(quán)利要求7所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至多0.23硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。9.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是麥芽糖糊精,而且它平均含有約0.23硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。10.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是環(huán)糊精,而且它平均含有約0.20硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。11.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菊糖,而且它平均含有約0.19硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。12.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是支鏈淀粉,而且它平均含有約0.16硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。13.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菲可,而且它平均含有約0.12硫酸根基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。14.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至少0.01脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。15.如權(quán)利要求14所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至少1.05脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。16.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至多2.0脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。17.如權(quán)利要求16所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖平均含有至多1.29脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。18.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是麥芽糖糊精,而且它平均含有約1.29脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。19.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是環(huán)糊精,而且它平均含有約1.05脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。20.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菊糖,而且它平均含有約1.24脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。21.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是支鏈淀粉,而且它平均含有約1.24脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。22.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菲可,而且它平均含有約1.22脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。23.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,脂基含有4-22個(gè)碳原子。24.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,硫酸根基與脂基之比為0.01-2硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。25.如權(quán)利要求24所述的佐劑,其特征在于,硫酸根基與脂基之比為0.10-0.19硫酸根基/脂基,同時(shí)維持其疏水特性。26.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是麥芽糖糊精,其硫酸根基與脂基之比約為0.18脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。27.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是環(huán)糊精,其硫酸根基與脂基之比約為0.19脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。28.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菊糖,其硫酸根基與脂基之比約為0.15脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。29.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是支鏈淀粉,其硫酸根基與脂基之比約為0.13脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。30.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,該硫脂多糖是菲可,其硫酸根基與脂基之比約為0.10脂基/單糖,同時(shí)維持其疏水特性。31.如權(quán)利要求1所述的佐劑,其特征在于,界面形成成分選自水不混溶性液體或在水相中不溶的固體。32.如權(quán)利要求31所述的佐劑,其特征在于,水不混溶性液體選自角鯊?fù)?、豆油、礦物油和十六烷。33.如權(quán)利要求1-30中任一權(quán)利要求所述的硫脂多糖作為疫苗佐劑的用途。34.制備乳劑中疫苗制劑的方法,其特征在于,乳化抗原水溶液、如權(quán)利要求1-30中任一權(quán)利要求所述的硫脂多糖、界面形成成分和乳化劑。35.一種疫苗,其特征在于,它含有致免疫量的抗原和佐劑,該佐劑含有如權(quán)利要求1-30中任一權(quán)利要求所述的硫脂多糖和界面形成成分。全文摘要一種含有硫脂多糖和界面形成成分的疫苗佐劑。本發(fā)明還提供了一種制備疫苗的方法,它是通過乳化抗原水溶液和硫脂多糖。該佐劑在高溫下是穩(wěn)定的,而且至少與常規(guī)佐劑一樣有效。它們的局部毒性劑反應(yīng)原性一般低于常規(guī)佐劑。文檔編號(hào)A61K47/36GK1171052SQ95197099公開日1998年1月21日申請(qǐng)日期1995年12月21日優(yōu)先權(quán)日1994年12月27日發(fā)明者L·希爾格斯申請(qǐng)人:迪米那科股份有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1