專利名稱：：一種鑒定用于在動(dòng)物細(xì)胞中激活氯傳導(dǎo)的結(jié)合cftr的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種方法，該方法可以鑒定用于治療尖端(apical)氯傳導(dǎo)降低的細(xì)胞(如囊狀纖維變性細(xì)胞)的結(jié)合CFTR的化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療此類細(xì)胞的化合物及其組合物。
背景技術(shù)：
：健康的動(dòng)物細(xì)胞除需要其它條件和物質(zhì)之外，還需要維持各種無機(jī)離子的跨細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)，使正常的離子平衡提供必要的跨細(xì)胞膜電位和促進(jìn)生命活動(dòng)的胞內(nèi)離子強(qiáng)度。例如，動(dòng)物中Na+、Cl+、K+和Ca++的跨膜運(yùn)動(dòng)使得K+和Ca++在不同細(xì)胞的不同發(fā)育階段在胞內(nèi)進(jìn)行程度不同的聚積，而Na+大部分排斥于胞外。這些離子的跨膜運(yùn)動(dòng)由位于適當(dāng)?shù)碾x子通道位點(diǎn)的，與膜相連的依賴Na+/K+和依賴Ca++的ATP酶介導(dǎo)。據(jù)認(rèn)為，氯離子以被動(dòng)方式透過動(dòng)物細(xì)胞，使胞外液與胞內(nèi)液之間達(dá)到濃度平衡，從而由于整體的負(fù)胞內(nèi)變化而導(dǎo)致胞內(nèi)Cl-濃度偏低(underrepresentation)。但也有文獻(xiàn)表明氯傳導(dǎo)也被Cl-通道主動(dòng)介導(dǎo)(見Edwards，神經(jīng)科學(xué)(Neuroscience)，7，1335-1366(1982))。針對(duì)囊狀纖維變性(“CF”)病理的研究結(jié)果為細(xì)胞水平離子傳導(dǎo)缺損對(duì)人的健康的不同水平的致病作用提供了資料。CF有遺傳基礎(chǔ)，因?yàn)槠湓诎追N美國人中的發(fā)病率(在1/1600至1/2000活嬰之間)與在黑種美國人中的發(fā)病率(約1/17,000活嬰)不同。實(shí)際上，過去十年的研究表明一種可遺傳的特定基因突變與CF的臨床癥狀相關(guān)，所述癥狀包括外分泌腺和肺功能失常。更具體地說，CF是由囊狀纖維變性跨膜調(diào)節(jié)物(CFTR)基因突變?cè)斐傻?，最普通的突變?08位的苯丙氨酸殘基(Phe508，圖1為CFTR蛋白的物理圖譜)缺失。該突變的CFTR蛋白被稱為ΔF508，其位點(diǎn)位于第一個(gè)核苷酸結(jié)合折疊(NBF-1)中。Schoumacher等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)87，4012-4016(1990)；Riordan等，科學(xué)(Science)245，1066-1073(1979)。更具體地說，該突變位于一段較長的NBF-1內(nèi)部片段中，N末端側(cè)連著WalkerA序列(458-471位氨基酸；又稱“CFTR[458-471]”)，C末端側(cè)連著相鄰的C結(jié)構(gòu)域(548-560位氨基酸；又稱“CFTR[548-560]”)和WalkerB結(jié)構(gòu)域(561-573位氨基酸；又稱“CFTR[561-573]”)。位于CFTR[471]和CFTR[561]之間的中間序列的生理作用尚不清楚，該中間序列包括Iα、Iβ和Io多肽序列(見圖1)。CFTR基因的某些突變，例如造成ΔF508的突變，導(dǎo)致跨CF上皮的電勢(shì)差異常。該異常是由于細(xì)胞尖端氯(Cl-)傳導(dǎo)降低。因而，例如CF患者的跨上皮細(xì)胞膜的氯和鈉的運(yùn)輸均異常。還已知攜帶ΔF508突變的細(xì)胞有比正常水平高的結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(此后被稱為“ER”)的CFTR蛋白質(zhì)，雖然野生型細(xì)胞在其ER中也保留并降解相當(dāng)量的CFTR蛋白，但比ΔF508突變體的少得多。Ward等，遺傳生理學(xué)雜志(J.Gen.Physiol.)，104，33a(1994)。該CFTR突變很明顯是造成呼吸系統(tǒng)病理生理變化的原因之一。該病的幾乎所有患者都患有慢性進(jìn)行性呼吸系統(tǒng)疾病。大多數(shù)情況下出現(xiàn)胰功能失調(diào)，肝膽和生殖泌尿系統(tǒng)疾病也較頻繁。雖然近年來囊狀纖維變性患者的存活率有改善，但即使開發(fā)并廣泛應(yīng)用了支持及預(yù)防措施后平均存活年齡仍僅有28歲。目前治療該病的努力集中于能夠激活突變體CFTR基因產(chǎn)物或用其它方法造成患病細(xì)胞Cl-分泌增加的藥物上?；虔煼ㄊ橇硪换钴S的研究領(lǐng)域，可通過引入重組野生型CFTR基因，即沒有導(dǎo)致功能異常的突變的CFTR基因，來修復(fù)陰離子傳導(dǎo)缺損。近來有報(bào)道，用含氨氯吡咪(Knowles等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.)，322，1189-1194(1990))或ATP和UTP的混合物(Knowles等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，325，533-538(1991))的氣溶膠來減緩氣管上皮中Cl-的聚集，臨床結(jié)果令人鼓舞。其它可用于治療CF的藥物亦見于報(bào)道。例如美國專利4,866,072號(hào)描述用9-乙基-6，9-二氫-4，6-二氧-10-丙基-4H-吡喃(3，2-g)喹啉-2，8-二羧酸或其藥用衍生物來治療CF。美國專利4,548,818號(hào)描述用3-烷基黃嘌呤治療慢性阻塞性肺病(COPD)。美國專利5,032,593描述用1，3-烷基取代的8-苯基黃嘌呤或其藥用鹽治療支氣管縮小。美國專利5,096,916描述咪唑啉α-腎上腺素能阻遏劑和血管舒張劑如芐唑啉治療COPD，包括囊狀纖維變性，慢性支氣管炎和氣腫，或與氣喘有關(guān)的COPD。過去曾用茶堿對(duì)哮喘和CF患者給藥來增強(qiáng)肺功能。這種肺功能增強(qiáng)主要由支氣管擴(kuò)張?jiān)斐桑@是由于茶堿對(duì)平滑肌及炎癥的作用。茶堿不僅抑制磷酸二酯酶，還拮抗腺苷受體。相應(yīng)地，由于茶堿作用于多個(gè)位點(diǎn)，它明顯地缺乏特異性，因而降低了治療CF的效用?？紤]到是對(duì)A1腺苷受體的拮抗而非對(duì)磷酸二酯酶的抑制刺激了CF細(xì)胞的氯外流，這種特異性的缺乏會(huì)導(dǎo)致不利的副作用，如對(duì)心臟、腎和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織有害。另外，必須施用大劑量茶堿才能取得良好效果，因而增加了該化合物的高毒性副作用的危險(xiǎn)。已檢測了其它基本結(jié)構(gòu)與茶堿類似的化合物，但未發(fā)現(xiàn)能激發(fā)CF細(xì)胞的氯外流，因而用于治療囊狀纖維變性的潛力不大。例如3-異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)的結(jié)構(gòu)與茶堿相似，其活性無特異性，毒性高，因而不能用于治療CF?；衔?-硫代-8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(2-硫代-CPX)，1，3-二丙基-8-新金剛烷基黃嘌呤(KW-3902)和1，3-二甲基-8-環(huán)戊基黃嘌呤(CPT)(見美國專利5,366,977號(hào))也不能有效刺激氯外流。類似地，用單碳基團(tuán)取代CPX(1，3-二丙基-8-環(huán)戊基黃嘌呤)的1或3位的丙基得到的化合物不能有效地刺激CF細(xì)胞的氯外流。很明顯，微小的結(jié)構(gòu)差別對(duì)一給定化合物能否有效地用于治療CF的影響即使不是根本性的也是很顯著的。相應(yīng)地，若有一種方法能對(duì)化合物促進(jìn)患病細(xì)胞氯離子傳導(dǎo)的能力進(jìn)行篩選，選出用于治療囊狀纖維變性患者的藥劑候選物，這將會(huì)特別有用。上面引用的′977號(hào)專利和Eidelman等，美國國家科學(xué)院院刊，89，5562-5566(1992)公開了CPX是強(qiáng)力A1腺苷拮抗物，能促進(jìn)一種人類上皮細(xì)胞系(CFPAC-1)的氯外流。CFPAC-1細(xì)胞系表達(dá)上述CFTRΔF508突變，可視為CF活性化合物的第一代篩選材料，進(jìn)一步描述見實(shí)施例6。雖然′977號(hào)專利公開的CPX及其相關(guān)的黃嘌呤氨基同類物相對(duì)無毒，因而可用于CF治療，但這些化合物對(duì)A1腺苷受體的拮抗作用表明這種治療可能對(duì)動(dòng)物有與CF疾患無關(guān)的附加影響。因而優(yōu)選地避免應(yīng)用這些化合物，或是任何有多重活性靶的化合物，因?yàn)閼?yīng)用這些化合物至少可能有害。強(qiáng)力、低毒、對(duì)腺苷受體特異性很少或沒有的藥物將是很理想的藥劑，用于治療尖端Cl-傳導(dǎo)降低的細(xì)胞，如囊狀纖維變性細(xì)胞。這樣一種藥物不僅用于治療囊狀纖維變性本身，還可用于治療一般的COPD。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定能激活受損的氯傳導(dǎo)通道的化合物的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種修正氯傳導(dǎo)受損的細(xì)胞中氯傳導(dǎo)降低的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種治療囊狀纖維變性細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種方法，用于治療在囊狀纖維變性跨膜調(diào)節(jié)物的508位氨基酸苯丙氨酸缺失的囊狀纖維變性細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供用于這些方法的化合物，特別是新的黃嘌呤衍生物，它對(duì)腺苷受體的親合性很小或沒有，但仍能通過激發(fā)Cl-外流改善CF細(xì)胞的Cl-不平衡。本發(fā)明的這些及其它目的和優(yōu)點(diǎn)，以及其它發(fā)明特征，在本文提供的發(fā)明描述中是顯而易見的。發(fā)明簡述本發(fā)明提供某些CFTR多肽，如Iα[SEQIDNO1]，它們能特異性地結(jié)合那些在ΔF508突變體細(xì)胞中激活與CFTR相關(guān)聯(lián)的氯離子外流的化合物，但不結(jié)合那些不能激活與CFTR相關(guān)聯(lián)的氯離子外流的化合物。此外，本發(fā)明提供一種方法，用于鑒定其它能激活與CFTR相關(guān)聯(lián)的氯離子外流的化合物。該方法包括應(yīng)用前述CFTR多肽作離子外流激活化合物的選擇性結(jié)合劑。作為對(duì)該鑒定方法的進(jìn)一步改進(jìn)，還公開了具有與Iα位置相鄰或重疊區(qū)域的氨基酸序列的其它CFTR多肽，如Iβ[SEQIDNO3]或Io[SEQIDNO4]，雖然它們與Iα位置相近或有重疊，但其對(duì)激活離子外流的化合物有不確定的或負(fù)的親和性。前述鑒定法可用于鑒定能在離子外流缺陷的細(xì)胞如CF細(xì)胞，特別是帶有ΔF508突變的細(xì)胞中激活離子外流的化合物。而且這些化合物在本發(fā)明的范圍中進(jìn)一步被篩選，得到對(duì)A1腺苷細(xì)胞受體或A2腺苷受體很少有或沒有親和性的化合物。這些化合物可相應(yīng)地用于治療尖端Cl-傳導(dǎo)降低的細(xì)胞，如CF細(xì)胞。具體地說，本發(fā)明方法涉及將尖端Cl-傳導(dǎo)降低的細(xì)胞與治療有效量的對(duì)A1、A2或A3腺苷細(xì)胞受體很少有或沒有親和性的化合物相接觸。本發(fā)明的化合物與CF細(xì)胞的接觸導(dǎo)致這些細(xì)胞中Cl-外流。具體地說，本發(fā)明的方法涉及將細(xì)胞接觸下式化合物其中R1和R3相同，是C1-C6烷基或C1-R6鏈烯基，R7是C1-C6烷基或氫，R8是C4-C8環(huán)烷基。這種化合物可進(jìn)一步選自1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)戊基黃嘌呤、1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)己基黃嘌呤、環(huán)己基咖啡因、1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤及其藥用衍生物。用于本發(fā)明方法的化合物在基本結(jié)構(gòu)上類似于茶堿，但在R1、R3和R8位的取代基差別很大。由于類似茶堿的化合物的微小結(jié)構(gòu)差別使化合物在CF治療上無效或因其它原因失去效用，發(fā)現(xiàn)上述化合物可以有效激活CF細(xì)胞的氯外流是令人驚奇的。由于本發(fā)明的化合物的表觀作用模式不涉及任何一種腺苷受體，因而這一發(fā)現(xiàn)特別出乎意料。附圖簡述圖1是CFTR蛋白質(zhì)的物理圖譜，顯示下列序列的位置WalkerA(氨基酸458-471)；Iα(氨基酸477至508)；Iβ(氨基酸509至539)；Io(氨基酸550至530)；C(氨基酸548至560)；WalkerB(氨基酸561-573)。圖2描繪某些濃度為20μg/ml(5.2μM)，pH6.0的CFTR多肽和1mMCa++造成的嗜鉻顆粒聚集。x軸單位為分鐘，y軸單位為濁度變化(Δ540nM)。圖3A描繪不同濃度Iα多肽存在時(shí)嗜鉻顆粒的聚集。x軸單位是Iα多肽濃度(μg/ml)，y軸單位是濁度變化(Δ540nM)。進(jìn)行反應(yīng)以獲取圖2的數(shù)據(jù)，計(jì)算每種濃度Iα的初始速率。圖3B是圖3A中顯示的數(shù)據(jù)的Hill圖。Vmaxapp由數(shù)據(jù)的Lineweaver-Burk圖(log(Vi/Vm-Vi)對(duì)log[Iα])的線性外推估算，并計(jì)算各條件的速率比。斜率(2.6)是Hill系數(shù)(nH)。圖4A描繪不同pH值(x軸)下Iα造成的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集(y軸是ΔA350/分鐘)。Iα濃度是2μg/ml(0.6mM)。圖4B描繪隨時(shí)間(x軸，單位為分鐘)測量的低濃度Iα多肽造成的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集(y軸是ΔA350/分鐘)。圖5描繪CPX(x軸，單位為nM)對(duì)Iα多肽驅(qū)動(dòng)的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集(y軸是ΔA350/20分鐘)的影響。嵌入圖描繪在20分鐘時(shí)CPX活化的濃度依賴性，其中y軸是ΔA350/20分鐘，x軸是CPX濃度，單位為nM。圖6描繪咖啡因(x軸為濃度，單位為nM)對(duì)Iα多肽驅(qū)動(dòng)的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集(在y軸上測量，單位是ΔA350/20分鐘)的影響。嵌入圖描繪在20分鐘時(shí)CPX活化的濃度依賴性，其中y軸是ΔA350/20分鐘，x軸是咖啡因濃度，單位為nM。圖7描繪DAX濃度(x軸，單位為nM)對(duì)Iα多肽驅(qū)動(dòng)的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集(y軸，ΔA350/20分鐘)的影響。嵌入圖描繪在20分鐘時(shí)DAX活化的濃度依賴性，其中x軸是DAX濃度，單位為nM，y軸單位為ΔA350/20分鐘。圖8描繪Iα多肽驅(qū)動(dòng)的磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體聚集的CPX與DAX活化的對(duì)比。x軸上CPX或DAX的濃度單位為nM，y軸單位為ΔA350/20分鐘。圖9描繪CFPAC細(xì)胞接觸化合物1(茶堿)的[36Cl]-外流的研究結(jié)果。x軸代表化合物1的nM濃度，y軸代表氯外流速率，它是對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。圖10描繪CFPAC細(xì)胞接觸化合物5(CPX)的[36Cl]-外流的研究結(jié)果。x軸代表化合物5的nM濃度，y軸代表氯外流速率，它是對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。圖11描繪CFPAC細(xì)胞接觸化合物22(8-環(huán)己基甲基咖啡因)的[36Cl]-外流的研究結(jié)果。x軸代表化合物22的nM濃度，y軸代表氯外流速率，它是對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。圖12描繪CFPAC細(xì)胞接觸化合物17(1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤)的[36Cl]-外流的研究結(jié)果。x軸代表化合物17的nM濃度，y軸代表氯外流速率，它是對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。圖13描繪在檢測茶堿衍生物不同大小的8-環(huán)烷基取代基(x軸)對(duì)Ki值的影響(μM，y軸)時(shí)，對(duì)氯外流的研究結(jié)果。給出了大鼠皮層A1-腺苷受體(·)和大鼠紋狀(striated)A2a-腺苷受體(Δ)上8-環(huán)烷基茶堿衍生物的親和性。圖14描繪在檢測咖啡因衍生物不同大小的8-環(huán)烷基取代基(x軸)對(duì)Ki值的影響(μM，y軸)時(shí)，對(duì)氯外流的研究結(jié)果。給出了大鼠皮層A1-腺苷受體(·)和大鼠紋狀A(yù)2a-腺苷受體(Δ)上8-環(huán)烷基咖啡因衍生物的親和性。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供對(duì)激活CFTR突變細(xì)胞中氯離子外流的化合物有正親和性的多肽。本發(fā)明的多肽是CFTR蛋白的一部分，即圖1中標(biāo)志為Iα的片段，或是其功能差別不大的衍生物，如下所述。Iα被定義為跨477位至508位氨基酸的多肽，具有下列序列NH2-PSEGKIKHSGRISFCSQFSWIMPGTIKENEEF-COOH[SEQIDNO1]其中NH2和COOH基團(tuán)之間的大寫字母是各氨基酸的通用單字母符號(hào)，這種關(guān)于蛋白質(zhì)的術(shù)語也用于下述SEQIDNO3和SEQIDNO4中。多肽Iα[SEQIDNO1]的制備可通過(1)用本領(lǐng)域熟知的方法作分析性或制備性多肽合成(見例如Atherton等，《固相多肽合成實(shí)用方法》(牛津大學(xué)出版社，1989))，(2)用本領(lǐng)域熟知的遺傳工程方法通過適當(dāng)?shù)販赜泻线m的DNA或RNA序列的微生物來表達(dá)Iα多肽(見例如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第2版，1989))，或(3)其它合適的方法。在本發(fā)明范圍內(nèi)還考慮到保守氨基酸變化，如本領(lǐng)域已知，這些變化不會(huì)造成多肽的電荷或構(gòu)型變化，這構(gòu)成本發(fā)明的其它實(shí)施方案。例如，據(jù)認(rèn)為將異亮氨酸換成亮氨酸對(duì)Iα多肽的功能影響很小或沒有。還考慮到Iα片段可能也有功能，因此這些片段限定了本發(fā)明的其它實(shí)施方案。用于構(gòu)建克隆以合成Iα的合適DNA和/或RNA序列可利用遺傳密碼通過Iα氨基酸序列[SEQIDNO1]的逆向翻譯和轉(zhuǎn)錄推得。DNA的“有義”和“反義”鏈中的一條或兩條可用于遺傳工程構(gòu)建質(zhì)粒以合成Iα。相似地，RNA序列也可構(gòu)成“有義”或“反義”鏈。相應(yīng)地，本發(fā)明也可以被認(rèn)為是通過本文提到的RNA或DNA序列來實(shí)施的?？捎萌魏魏线m的方法生成具有任一下列序列的RNA分子CCNUCNGARGGNAARAUHAARCAYUCNGGNCGNAUHUCNUUYUGYUCNCARUUYUCNUGGAUHAUGCCNGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUY[SEQIDNO2]其中A是腺嘌呤，G是鳥嘌呤，U是尿嘧啶，C是胞嘧啶，W是A或U，Y是C或U，R是A或G，H是A、C或U，N是G、A、C或U，各符號(hào)排成三聯(lián)體以反映在生物體中翻譯的密碼子。這種與RNA相關(guān)的術(shù)語也被用于下面的SEQIDNO5和SEQIDNO6。本文也考慮那些通過翻譯得到相同的多肽序列或其功能等價(jià)物的其它RNA序列。例如三聯(lián)體UCN可被三聯(lián)體AGY取代并且三聯(lián)體CGN可被三聯(lián)體AGR取代，得到的多肽序列沒有改變。除了在RNA水平鑒定到的中性序列差異，上述使得到的氨基酸序列發(fā)生保守變化的核苷酸改變也在考慮之列，因此例如編碼異亮氨酸的三聯(lián)體AUH可被編碼同分異構(gòu)體亮氨酸的三聯(lián)體CUN替換，而對(duì)所述的多肽的功能無明顯影響。任一這種序列可連接入合適的核酸載體，用本領(lǐng)域熟知的方法在合適的細(xì)胞或病毒宿主中增殖表達(dá)。上述RNA分子的遺傳互補(bǔ)物，即反義RNA，以及有義和反義RNA分子的DNA對(duì)應(yīng)物也考慮作為本發(fā)明的實(shí)施方案。生成上述序列，其互補(bǔ)物或其DNA對(duì)應(yīng)物以及下述序列的合適方法包括人工或自動(dòng)的體外多聚核苷酸合成。這樣的序列一旦被構(gòu)建出來，可以將其連接到其它確定轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)的核苷酸序列上，或其它可用作在細(xì)菌、病毒或動(dòng)物細(xì)胞中增殖和/或表達(dá)的載體的核苷酸序列上。制備這樣的核酸結(jié)構(gòu)的方法在本領(lǐng)域已知。見Sambrook等，同上。多肽或其適當(dāng)部分可單獨(dú)使用或同另一化合物結(jié)合，該化合物可以是能共價(jià)連成另一多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸、蛋白多糖、蛋白脂質(zhì)、碳水化合物或其它合適的大分子。本發(fā)明的多肽與另一大分子的結(jié)合可通過共價(jià)鍵、氫鍵、吸附、吸收、金屬鍵、范德華力、離子鍵或其它適當(dāng)?shù)姆肿娱g和分子內(nèi)鍵或力或其任意組合來穩(wěn)定。本發(fā)明的多肽的優(yōu)選形式包括將多肽共價(jià)連接到適當(dāng)?shù)挠H和層析基質(zhì)(如纖維素)上，包括間氨基苯甲氧甲基纖維素、溴乙基纖維素、羧甲基纖維酰肼和纖維素環(huán)碳酸酯；6-氨基己酸；sepharose，包括sepharose4B、sepharose6MB、sepharose6B和巰基-sepharose4B；含有親水丙烯酸、聚丙烯酰胺和瓊脂糖的小珠；以及線性聚丙烯酰胺。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)基元如酰肼、碳酸酯等和適當(dāng)?shù)募せ钗锶玟寤?、羰基二咪唑、氯甲酸酯等，可以用本領(lǐng)域已知的方法和材料，如Sigma化學(xué)品公司1993年目錄1612-1618頁或其它來源提供的材料，應(yīng)用到上述親和層析基質(zhì)上。Iα多肽的性質(zhì)包括(1)當(dāng)約1mMCaCl2存在時(shí)起始或造成牛嗜鉻顆粒聚集，表觀k1/2為22.2μg/ml或6.3μM(見圖3A和3B)；(2)在約5.5至約7.5的pH范圍內(nèi)有活性，其中當(dāng)pH約6.75時(shí)有50％活性(見圖4A)；(3)與激活有ΔF508突變的細(xì)胞中氯離子外流的化合物合用時(shí)在起始或造成脂質(zhì)體聚集上有協(xié)同效應(yīng)，所述化合物包括CPX、咖啡因和N，N-二烯丙基環(huán)己基黃嘌呤(DAX)(分別見圖5，6和7)；(4)與不激活有ΔF508突變的細(xì)胞中氯離子外流的化合物合用時(shí)不起始或造成脂質(zhì)體的聚集，所述化合物包括2-硫代-CPX和異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)等；(5)與腺苷有雙相反應(yīng)，其中在70至100mM的低腺苷濃度時(shí)，上述Iα多肽驅(qū)動(dòng)的脂質(zhì)體聚集有少量增加，腺苷濃度再高時(shí)未見這種活性增加，大于等于1μM時(shí)聚集活性受抑制；(6)對(duì)CPX表觀KD為69±27nM，CPX是激活ΔF508細(xì)胞的氯離子外流的黃嘌呤衍生物。本發(fā)明還提供某些CFTR多肽，它們與Iα多肽相鄰，但其特征明顯不同。Iβ多肽是包含于CFTR509位至539位的一個(gè)氨基酸序列，它具有下列序列NH2-GVSYDEYRYRSVIKACQLEEDISKFAEKDNI-COOH[SEQIDNO3]Io多肽是包含于CFTR蛋白500位至530位的另一個(gè)氨基酸序列，它具有下列序列NH2-GTIKENEEFGVSYDEYRYRSVIKACQLEEDIS-COOH[SEQIDNO4]這些多肽與Iα多肽相鄰或與之部分重疊，但均不驅(qū)動(dòng)嗜鉻顆?；蚝铣尚灾|(zhì)體的聚集，對(duì)本文公開的Iα多肽或激活氯離子外流的黃嘌呤衍生物的活性也沒有影響。與上述關(guān)于Iα的保守氨基酸變化的討論類似，也考慮將含有這種保守變化的多肽作為本發(fā)明的其它實(shí)施方案。如上述對(duì)Iα多肽的討論，Iβ和Io多肽可作為游離多肽，其片段，或與其它大分子相結(jié)合的多肽來制備并使用。Iβ和Io可用于親合層析，并用作Iα多肽的陰性對(duì)照。如同上面對(duì)Iα多肽的討論，對(duì)應(yīng)Iβ和Io的適當(dāng)RNA和/或DNA序列可利用遺傳密碼，通過相應(yīng)多肽蛋白質(zhì)序列的逆向翻譯/轉(zhuǎn)錄來鑒定。相應(yīng)地可用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄉ珊邢铝行蛄械腞NA分子IβGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCNAARUUYGCNGARAARGAYAAYAUH[SEQIDNO5]IoGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUYGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCN[SEQIDNO6]與Iα序列類似，編碼與SEQIDNO5和SEQIDNO6相同或功能上等價(jià)的序列的其它序列也在考慮之列。例如三聯(lián)體UCN、GCN和UUR可分別由AGY、AGR和CUN替換，而不造成任何氨基酸序列上的不同。另外如上面對(duì)Iα序列討論的，造成不確定氨基酸變化的核苷酸序列也被考慮作為本發(fā)明的其它實(shí)施方案。而且如Iα序列一樣，SEQIDNO5和SEQIDNO6的RNA互補(bǔ)物以及由此預(yù)測的DNA對(duì)應(yīng)物序列，也包括在本發(fā)明的實(shí)施方案中，并可由普通技術(shù)人員根據(jù)通用遺傳密碼來確定。上述Iα、Iβ和Io多肽或其功能等價(jià)物可用于一種方法，鑒定結(jié)合CFTR的化合物。該方法包括使假定的結(jié)合CFTR的化合物與Iα多肽在足以使二者結(jié)合的條件下相互接觸，用適當(dāng)方法確定這種結(jié)合是否發(fā)生，如發(fā)生則表明該假定的結(jié)合CFTR的化合物確實(shí)是結(jié)合CFTR的化合物。對(duì)于結(jié)合CFTR的化合物，希望用本方法鑒定的這些化合物與細(xì)胞的CFTR相互作用，優(yōu)選的是突變的CFTR如ΔF508，來使CFTR介導(dǎo)的氯離子外流增大，或有可能恢復(fù)正常。結(jié)合CFTR的化合物與CFTR蛋白的這種相互作用可由離子鍵、疏水作用和范德華力的任一適宜組合提供，并且是CFTR氨基酸序列和結(jié)合CFTR的化合物的物化特性的函數(shù)。為了鑒定這些結(jié)合CFTR的化合物，優(yōu)選地是檢驗(yàn)用作針對(duì)CF的藥劑的候選物，檢驗(yàn)其與Iα多肽親和性的正效應(yīng)，以及與Iβ和/或Io不結(jié)合的不確定或負(fù)效應(yīng)是有用的。用于鑒定結(jié)合CFTR的化合物的親和性檢測的條件可用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)最優(yōu)化。該方法可能鑒定任一選擇性結(jié)合(例如)Iα或不結(jié)合(例如)Iβ的適當(dāng)化合物，該化合物是碳?xì)浠衔铮ǖ幌抻诘鞍踪|(zhì)、脂、核酸或其任一組合。結(jié)合CFTR的化合物的作用中令人感興趣的有(1)加入合成的多糖脂質(zhì)體制備物中(即包括該脂質(zhì)體的組合物)起始或造成脂質(zhì)體的聚集(描述見實(shí)施例1)；(2)加入嗜鉻顆粒的制劑(即包括該嗜鉻顆粒的組合物)中起始或造成該嗜鉻顆粒的聚集(描述見實(shí)施例1)；(3)當(dāng)ΔF508細(xì)胞氯離子外流的激活劑加入上述脂質(zhì)體中時(shí)起始或造成其聚集的速率變大(見圖5-7)。本發(fā)明范圍內(nèi)有用的氯離子外流激活劑包括CPX、咖啡因、N，N-二烯丙基環(huán)己基黃嘌呤，以及其它合適的化合物。氯離子外流激活物與Iα結(jié)合在一起檢測時(shí)與Iα單獨(dú)使用時(shí)的效應(yīng)相比，促進(jìn)脂質(zhì)體聚集的速率全都增大。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種方法，用于治療尖端Cl-傳導(dǎo)降低的細(xì)胞，如囊性纖維變性細(xì)胞，并提供用于本發(fā)明方法范圍內(nèi)的新的化合物及其藥物組合物。具體地說，治療方法涉及將尖端Cl-傳導(dǎo)降低的細(xì)胞接觸治療有效量的一種化合物，該化合物對(duì)腺苷細(xì)胞受體，尤其是A1-腺苷細(xì)胞受體或A2-腺苷細(xì)胞受體親和力很小或沒有，但仍激活Cl-外流。特別地，本方法涉及將細(xì)胞接觸下式化合物其中R1與R3相同，為C1-C6烷基或C1-R6鏈烯基，R7是C1-C6烷基或氫，R8是C4-C8環(huán)烷基或其藥用衍生物。這些化合物可依據(jù)其分別對(duì)一種腺苷受體(如A1或A2腺苷受體)的親和力來表征。特別地，這些化合物的親和性可以以Ki值表示，例如Ki值大于等于0.01。優(yōu)選化合物的Ki值小于0.05。這種優(yōu)選化合物包括R1和R3是甲基、丙基或烯丙基，R7是甲基或氫，R8是環(huán)戊基或環(huán)己基，具體地說是1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)己基黃嘌呤，1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)戊基黃嘌呤，1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤和8-環(huán)己基咖啡因之一。本發(fā)明的方法對(duì)治療囊狀纖維變性細(xì)胞特別有用。該方法特別優(yōu)選治療囊狀纖維變性跨膜調(diào)節(jié)物508位苯丙氨酸缺失的囊狀纖維細(xì)胞的治療，尤其是發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物如人類患者中的囊狀纖維變性細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的化合物優(yōu)選地不具有磷酸二酯酶活性。優(yōu)選治療有效量的該化合物無毒。最優(yōu)選化合物本身無毒，即使有毒也利大于弊。更優(yōu)選本發(fā)明的化合物對(duì)任何腺苷受體(如上面提到并由下面舉例說明的A1或A2-腺苷受體)的親和性水平低(例如Ki大于等于0.01mM)。對(duì)于A3-腺苷受體，本發(fā)明的化合物不可能與之有足夠大的親和性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)黃嘌呤不能置于A3-腺苷受體結(jié)合位點(diǎn)中。vanGalen等，醫(yī)學(xué)研究綜述(MedicinalRes.Rev.)，12，423-471(1992)。特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法的化合物是1，3-二丙基-7-甲基環(huán)戊基黃嘌呤(DP-CPX)，1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤(DCHX)和環(huán)己基咖啡因(CHC)；最優(yōu)選的化合物是DCHX。以前未曾公開的這些化合物和含有這些化合物的藥物組合物本身即本發(fā)明的實(shí)施方案。具體地說，本發(fā)明首次公開的化合物具有下式其中(a)R1和R3相同，是甲基或烯丙基，R7是乙基，環(huán)丙基甲基或氫，R8是環(huán)己基，條件是當(dāng)R7是氫時(shí)R1是烯丙基，當(dāng)R7是乙基或環(huán)丙基甲基時(shí)R1是甲基，或(b)R1和R3均為甲基，R7是氫或甲基，R8是環(huán)己基甲基或環(huán)庚基。根據(jù)上述結(jié)構(gòu)的優(yōu)選化合物是化合物17，即1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤(DCHX)。可選地，或另外，例如DP-CPX、CHC或DCHX的藥用衍生物或其組合物作為進(jìn)一步的實(shí)施例，可用于本發(fā)明方法，該方法為本發(fā)明提供另一個(gè)實(shí)施方案。最好這樣的衍生物在本發(fā)明的治療方法中有等價(jià)的治療效用。用于本發(fā)明方法的化合物可通過任何合適的方式給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物對(duì)動(dòng)物(尤其是人)給藥時(shí)有許多合適的方法，雖然某種具體藥物的給藥途徑不止一種，但某一具體給藥途徑比其它途徑反應(yīng)更直接更有效。化合物優(yōu)選地直接施用至患者肺部。優(yōu)選地，化合物作為藥用水溶液施用。更優(yōu)選地，所施用化合物的水溶液含約0.001至約0.01％重量比的化合物，藥用氣溶膠是另一優(yōu)選給藥方式。氣溶膠優(yōu)選地含約0.001至約0.01％重量比的化合物?；衔镆嗫煽诜?。這種情況下化合物給藥量通常是每天約0.1至1mg/kg體重。用于口服的本發(fā)明化合物優(yōu)選量是每天約0.1mg/kg體重，也可采用其它給藥途徑，如靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)給藥。施用化合物應(yīng)使治療有效濃度的化合物與體內(nèi)患病細(xì)胞接觸。本發(fā)明對(duì)動(dòng)物，尤其是人的給藥劑量應(yīng)足以在一段合理的時(shí)間范圍內(nèi)于動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生療效。藥量應(yīng)根據(jù)選定化合物的強(qiáng)度、動(dòng)物的情況及受治療的動(dòng)物的體重來確定。藥劑大小也應(yīng)根據(jù)對(duì)特定患者伴隨特定的化合物給藥及特定給藥途徑可能存在的毒副作用是否存在及其習(xí)性和范圍來確定。通常本發(fā)明的化合物在低劑量時(shí)可以有效治療。有效劑量范圍是血液中約30nM至約100nM。相應(yīng)地，化合物通常以相對(duì)低的劑量給藥?；衔锟梢栽谒幱幂d體中給藥。本發(fā)明包括含有本發(fā)明化合物和藥用載體的藥物組合物。藥用載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知?？刹糠值赜商囟ɑ衔镆约敖o藥的特定方法選擇載體。相應(yīng)地，本發(fā)明的藥物組合物有許多適當(dāng)?shù)闹苿＿m于口服的制劑包括(a)溶液，例如有效量的化合物溶于稀釋劑如水或鹽水中，(b)膠囊，香粉劑或片劑，各含預(yù)定量的活性成分如固體或顆粒，(c)于適當(dāng)液體中的懸液，(d)適當(dāng)?shù)娜閯?。片劑形式可包括下列的一種或多種乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、纖維素微晶、阿拉伯樹膠、明膠、膠體二氧化硅、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸和其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、增濕劑、防腐劑、香味劑和醫(yī)藥相容載體。錠劑形式可包含香味劑中的活性成分，通常香味劑為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠；錠劑可含有惰性基質(zhì)中的活性成分，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠乳劑，凝膠；其他給藥形式除含活性成分外，還含本領(lǐng)域已知的此種載體。適于吸入給藥的制劑包括氣溶膠制劑，它被置于加壓的可接受推進(jìn)劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾取；钚詣┛捎眠m當(dāng)賦形劑氣溶膠化。適于靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)給藥的制劑例如包括水相或非水相的等滲無菌注射液，可含抗氧劑、緩沖液、細(xì)菌抑制劑、以及使制劑與接受者血液等滲的溶劑，或是含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水相或非水相無菌懸濁液。制劑可包裝于單劑量或多劑量密封容器，如安瓿和小瓶中并存于冷凍干燥條件下，使用前僅需加入無菌液相載體(如水)用于注射。對(duì)上述無菌粉末、顆粒和片劑可臨時(shí)配制注射溶液和懸濁液。誘導(dǎo)細(xì)胞Cl-外流的最適程度依賴于受治療的具體疾病或狀態(tài)，以及病人的穩(wěn)定性與可能的副作用。使用適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯没衔锓椒ǎ景l(fā)明提供對(duì)氯離子外流速率廣泛范圍的活化，例如從活化很小到基本上完全活化。本發(fā)明估計(jì)能有效治療所有的其特征在于細(xì)胞尖端Cl-傳導(dǎo)降低的病癥，包括各種疾病。具體地說，預(yù)計(jì)本發(fā)明能治療慢性阻塞性肺病，尤其是囊狀纖維變性。下列實(shí)施例被用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例描述用于評(píng)價(jià)某些CFTR多肽針對(duì)膜的活性的方法及其結(jié)果。脂質(zhì)體聚集試驗(yàn)(assay)將磷脂酰絲氨酸(“PS”，得自Avanti)溶于氯仿，用已知的擠迫法(extrusionprocess)制備小的單層膜脂質(zhì)體。用Lipex儀器在含10mMNa-HEPES，pH7.2和1mMEDTA的緩沖液中擠迫PS。脂質(zhì)體稀釋至終光密度于540nm為0.01，并與不同濃度的不同多肽和/或氯離子外流激活化合物溫育。嗜鉻顆粒聚集試驗(yàn)從當(dāng)?shù)赝涝讏鲑彽媚I上腺，在宰殺后二小時(shí)內(nèi)置于冰上運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。如Brocklehurst等在《(多肽激素實(shí)用方法》(牛津大學(xué)出版社，K.Siddle和J.Hutton編，1990)237-255頁的描述處理組織。在階段梯度的甲泛影酰胺中用標(biāo)準(zhǔn)方法純化嗜鉻顆粒。重懸浮后根據(jù)描述(Brocklehurst等，同上)進(jìn)行顆粒聚集試驗(yàn)。并從540nm光密度的初始增加估計(jì)會(huì)聯(lián)蛋白(synexin)活性。簡而言之，反應(yīng)于室溫進(jìn)行，1ml石英杯中含有嗜鉻顆粒，懸浮于0.3mol/l蔗糖的顆粒，40mmol/l組氨酸緩沖液pH6.0，會(huì)聯(lián)蛋白和可變量的氯化鈣。制備CFTR多肽在耶魯大學(xué)分子生物學(xué)和生物物理系用標(biāo)準(zhǔn)固相法合成多肽。用反相HPLC純化多肽，用本領(lǐng)域的熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法直接化學(xué)測序，用氨基酸分析和質(zhì)譜確證序列。具體的多肽是Iα[SEQIDNO1]，Iβ[SEQIDNO3]和Io[SEQIDNO4]。Iα[SEQIDNO1]驅(qū)動(dòng)的嗜鉻顆粒和脂質(zhì)體聚集如圖2所示，發(fā)現(xiàn)Iα多肽在1mMCaCl2存在時(shí)驅(qū)動(dòng)牛嗜鉻顆粒聚集。相反，相鄰的Iβ多肽[SEQIDNO3]在嗜鉻顆粒聚集試驗(yàn)中基本無效。相似地，重疊的Io多肽[SEQIDNO4]也無效。因此這些數(shù)據(jù)似乎表明Iα的活性為Iα序列特異性的。圖3A給出的Iα活性滴定曲線顯示k1/2，app是22.2μg/ml或6.3μM。這些數(shù)據(jù)的Hill圖(見圖3B)顯示Hill系數(shù)(nH)是2.6。用磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體作聚集靶觀察到相似的數(shù)據(jù)，pH5.5至7.5范圍的詳細(xì)滴定曲線顯示50％活性時(shí)的pH為約6.75(見圖4A)。低濃度Iα驅(qū)動(dòng)PS脂質(zhì)體聚集如圖2所示高多肽濃度下聚集反應(yīng)被迅速起始，并遵循表觀一級(jí)過程，5-10分鐘內(nèi)有效地到達(dá)平臺(tái)。Iα驅(qū)動(dòng)的聚集反應(yīng)的協(xié)同性可由Hill系數(shù)定量看出(見圖3A)，該圖顯示在低多肽濃度，聚集的起始速率很快變小。不過在更長的時(shí)間段里可看到仍發(fā)生相當(dāng)多的聚集，雖然其動(dòng)力學(xué)復(fù)雜。如圖4B所示，動(dòng)力學(xué)涉及初始停滯期約8-10分鐘，然后是上升期與平臺(tái)。Iα多肽小于2μM時(shí)由表觀一級(jí)過程轉(zhuǎn)化成更復(fù)雜的過程，在0.4和2μM之間該復(fù)雜過程明顯顯示劑量依賴性。相應(yīng)地，Iα驅(qū)動(dòng)上述膜聚集現(xiàn)象，而相鄰的(Iβ)或部分重疊的(Io)多肽序列對(duì)于CFTR不驅(qū)動(dòng)這種聚集。有效的內(nèi)部負(fù)調(diào)控明確顯示CFTR在Iα位點(diǎn)存在特殊的功能特性，該特性明顯涉及膜。實(shí)施例2本實(shí)施例描述某些氯離子外流激活化合物與Iα的特異性結(jié)合以及某些不激活氯離子外流的化合物不能結(jié)合Iα。CPX用作能激活ΔF508突變體細(xì)胞氯離子外流的代表性化合物。在DMSO中制備mM濃度范圍的CPX貯液。Iα多肽(100nM終多肽濃度)溶于100μl的含50mMTris(pH7.0)，300mM蔗糖和10mM谷胱甘肽的緩沖液。37℃溫育1小時(shí)后，加入1-100nM3H-CPX(ICN，比活＝109Ci/mol)，進(jìn)一步溫育15分鐘。作為置換研究，將未標(biāo)記的CPX或其它黃嘌呤拮抗劑和核苷酸加入溫育混合液中，再加放射性探針?；旌弦河脴?biāo)準(zhǔn)點(diǎn)印跡儀濾過硝酸纖維素膜(NC)(Schleicher&amp;Schuell)。用0.3％聚乙烯亞胺(PEI)封閉濾膜可降低3[H]-CPX對(duì)NC濾膜的非特異性結(jié)合。然后用200μlTris緩沖液-NaCl溶液(50mMTrispH＝7.0，150mMNaCl)洗點(diǎn)印跡5次，切掉放射位點(diǎn)，用液體閃爍計(jì)數(shù)確定總的放射性。用10μM未標(biāo)記的CPX預(yù)雜交作非特異性結(jié)合，從總的結(jié)合中減去非特異性結(jié)合得到3H-CPX對(duì)Iα的特異性結(jié)合。3H-CPX對(duì)Iα的結(jié)合是CPX濃度的可飽和函數(shù)。將數(shù)據(jù)擬合成Scatchard圖，顯示KD，app為69±27nM(n＝4)。由Scatchard圖截距估計(jì)的Bmax值表明結(jié)合的Iα多肽的摩爾比小于1/2000。CPX、咖啡因、DAX和所有已知的氯離子外流激活物均能置換結(jié)合，但不激活氯離子外流的IBMX或2-硫代-CPX不置換結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明氯離子外流激活物特異性結(jié)合Id，CPX激活帶有ΔF508突變的細(xì)胞的機(jī)制是通過與CFTR分子本身相互作用。而且由于氯離子外流激活物結(jié)合Iα而非氯離子外流激活物不結(jié)合Iα這種特異性，這種方法可用于鑒定其它的CFTR結(jié)合蛋白，這些蛋白可能對(duì)CF細(xì)胞有療效。實(shí)施例3本實(shí)施例描述CPX對(duì)Iα驅(qū)動(dòng)的PS脂質(zhì)體聚集的影響。研究CPX對(duì)Iα驅(qū)動(dòng)的PS脂質(zhì)體聚集的影響。研究的CPX濃度介于1和30nM(觀察到對(duì)含ΔF508細(xì)胞的激活)，介于30和100nM(觀察到對(duì)上述細(xì)胞的最大激活)，直到1000nM(觀察到對(duì)上述細(xì)胞激活的抑制)。如圖5所示，僅有0.5μg/ml(0.18μM)Iα驅(qū)動(dòng)的脂質(zhì)體聚集很弱。但隨著CPX濃度的增大，在停滯約5分鐘后聚集反應(yīng)被持續(xù)地激活。在100nMCPX時(shí)觀察到最大激活速率和程度，此后隨CPX濃度增大到300nM，激活又下降。圖5的嵌入圖顯示每隔20分鐘的反應(yīng)程度。相應(yīng)地，這些數(shù)據(jù)顯示CPX對(duì)(1)含ΔF508細(xì)胞與(2)Iα聚集的作用的濃度依賴性相平行。實(shí)施例4本實(shí)施例描述其它黃嘌呤對(duì)Iα驅(qū)動(dòng)的PS脂質(zhì)體聚集的影響。本研究包括某些能激活ΔF508中氯離子外流的黃嘌呤衍生物(如咖啡因和N，N-二烯丙基環(huán)己基黃嘌呤(DAX)或不激活這種氯離子外流的黃嘌呤衍生物(例如2-硫代-CPX和異丁基甲基黃嘌呤(IBMX))。圖6給出PS脂質(zhì)體聚集試驗(yàn)的結(jié)果。從圖可看出，咖啡因激活I(lǐng)α聚集的能力較低，似乎在高濃度不激活I(lǐng)α聚集。圖6的嵌入圖顯示每隔20分鐘的反應(yīng)程度，在檢測的咖啡因濃度范圍內(nèi)，聚集根本不趨于水平。對(duì)于DAX，其強(qiáng)度與CPX范圍相同，但濃度高達(dá)300nM亦未見失活(見圖7)。圖7的嵌入圖顯示每隔20分鐘的反應(yīng)程度。從這個(gè)角度，我們可以在同一圖上(圖8)比較CPX和DAX，可見DAX比CPX強(qiáng)度低至少半個(gè)數(shù)量級(jí)。不過對(duì)于氯離子外流，DAX和CPX的效力幾乎相同。由于溶解度限制，DAX濃度不能很高。脂質(zhì)體聚集試驗(yàn)包括了不能激活攜帶ΔF508突變的細(xì)胞的氯離子外流的化合物2-氯-CPX和IBMX，可見這些化合物在分別高至1和15μM的濃度范圍內(nèi)完全不能促進(jìn)Iα驅(qū)動(dòng)的脂質(zhì)體聚集。相應(yīng)地，Iα驅(qū)動(dòng)的PS脂質(zhì)體聚集試驗(yàn)給出的結(jié)果與能夠以及不能激活氯離子外流的黃嘌呤衍生物的結(jié)果平行。實(shí)施例5本實(shí)施例描述腺苷對(duì)Iα驅(qū)動(dòng)的PS脂質(zhì)體聚集的影響。在PS脂質(zhì)體聚集試驗(yàn)中包括有腺苷。腺苷對(duì)Iα驅(qū)動(dòng)的脂質(zhì)體聚集反應(yīng)有小而明顯的雙相作用。在70-100nM的低濃度時(shí)，腺苷溫和地激活聚集反應(yīng)。不過在高濃度就失去了激活作用。腺苷濃度大于等于1μM時(shí)，聚集反應(yīng)已被抑制得低于已經(jīng)很低的對(duì)照水平。這些數(shù)據(jù)因此顯示黃嘌呤、CPX和DAX明顯與Iα多肽上親和腺苷的位點(diǎn)相互作用。實(shí)施例6本實(shí)施例描述本發(fā)明以及以前公開的新的黃嘌呤衍生物的合成與化學(xué)分析。由黃嘌呤衍生物的N-7位置的烷基化得到化合物13、17、21和23，實(shí)驗(yàn)方法描述見Jacobson等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)，36，2639-2644(1993)和Daly等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，29，1305-1308(1986)。關(guān)于化合物8-12、14、18、19、20和25合成的描述見Jacobson等(生化醫(yī)藥學(xué)(Biochem.Pharmacol.)37，3653-3661(1988))；Shimada等(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，35，924-930(1992))；和Shamim等(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，32，1231-1237(1989))；化合物7、14、18和19由Müllet等(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，36，3341-3349(1993))和Shamin等(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，35，924-930(1989))公開。化合物1-5和26，以及2-氯腺苷購自ResearchBiochemicalsInternational(Natick，麻省)?；衔?7由Thompson等(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，34，2877-2882(1991))公開。表1最大濃度％對(duì)照閾值％對(duì)照化合物R1，R3＝R7＝R8＝Ki，μM(A1)Ki，μM(A2)(nM)百分比(nM)百分比8-未取代1aMeHH8.525100150±301130±202MeMeH294810170±201120±303bMe，iBucHH716＞＞104---------8-環(huán)戊基4dMeH環(huán)戊基0.0111.4＞＞104---------5ePrH環(huán)戊基0.000460.3430200±101130±106PrMe環(huán)戊基2.311.4±1.41000180±4030125±307Pr，HfH環(huán)戊基0.0140.5830160±401130±208gPrH環(huán)戊基0.000660.31＞＞104---------9PrH3-氟環(huán)戊基0.042---＞＞300---------10PrH3-碘環(huán)戊基0.058---＞＞300---------11PrH環(huán)戊-3-基0.0450.640±0.061＞＞300---------12PrH新金剛烷基0.00130.3810170±201120±58-環(huán)己基13MeH環(huán)己基0.030±0.0151.04±0.203160±200.1130±2014MeMe環(huán)己基2817.13150±303150±3015MeEt環(huán)己基6.66±0.993.23±0.36＞＞104---------表1最大濃度％對(duì)照閾值％對(duì)照化合物R1，R3＝R7＝R8＝Ki，μM(A1)Ki，μM(A2)(nM)百分比(nM)百分比16Me環(huán)丙基甲基環(huán)己基8.23±1.624.53±1.37＞＞104---------17allylH環(huán)己基0.0656±0.01894.94±0.68103260±7030170±4018PrH環(huán)己基0.00150.423±0.055＞＞104---------19PrMe環(huán)己基2.79.24±0.375170±505170±5020PrH環(huán)己-3-烯基0.0100.905±0.128104150±30104150±3021MeH環(huán)己基甲基0.610±0.0765.47±0.86＞＞104---------22MeMe環(huán)己基甲基3.71±0.365.46±0.47＞＞104---------8-環(huán)庚基23MeH環(huán)庚基0.0659±0.01451.05±0.19＞＞104---------24MeMe環(huán)庚基19.5±2.53.27±0.98＞＞104---------8-stryryl或8-芳基25iMeMe3-氯280.05430160±3030160±3026jPrHp--OCH2CONH(CH2)2NH20.00120.08＞＞104---------非黃嘌呤拮抗劑279-乙基-6-環(huán)戊基腺嘌冷0.4417＞＞104---------a，茶堿；b，IBMX；c，1-甲基-3-異丁基；d，CPT；e，CPX；f，1-丙基-3-H-類似物(Müller等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，36，3341-3349(1992))；g，2-硫代而非氧化；h，KW-3902；i，CSC；j，XAC烷基或環(huán)烷基羧酸與5，6-二氨基-1，3-二甲基尿嘧啶反應(yīng)得到相應(yīng)胺，包括5-(環(huán)庚?；被?-6-氨基-1，3-甲基尿嘧啶和5-(環(huán)己基甲基羰基)-6-氨基-1，3-甲基尿嘧啶，方法如下將酸(1當(dāng)量)溶于含1，3-二烷基-5，6-二氨基尿嘧啶(1.5當(dāng)量)的最小體積的N，N-二甲基甲胺(DMF)中。加入1-(3-二甲基氨基-丙基)-3-乙基羰二亞胺HCl(1當(dāng)量)，再加入催化量的(0.05當(dāng)量)4-(N，N-二甲基氨基)吡啶和0.05當(dāng)量的咪唑。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入飽和的氯化鈉溶液(對(duì)1，3-二丙基衍生物，需要加水)形成沉淀或不定形不溶部分。濾出不溶性殘留物，溶于含足量甲醇的4N氫氧化鈉溶液，得到澄清溶液。將混合物在60℃下加熱2小時(shí)或加熱到起始物質(zhì)完全看不見為止，用TLC(硅板，CHCl3；CH3OH；HOAc；85∶10∶5v/v)來判斷?；旌衔锢鋮s后用6N鹽酸水溶液調(diào)酸至pH1。沉淀用水清洗，干燥，用制備型硅板(85-95％CHCl3；5-15％甲醇；1-5％HOAc)進(jìn)一步純化。用VarianGEMINI-300FT-NMR儀300MHz質(zhì)子核磁共振質(zhì)譜確定新的化合物(并指認(rèn)共振峰)。除非另有聲明，化學(xué)位移被表示成四甲基硅烷低場的ppm。用VG7070F質(zhì)譜儀EL模式或用質(zhì)譜儀作化學(xué)電離質(zhì)譜(NH3)確定新化合物。化合物15，16，22和24的代表性譜數(shù)據(jù)是1HNMRCDCl3δ3.42(S，3HN3CH3)；3.63(S，3HN5CH3)；3.89(S，6HOCH3)；5.06(S，2H，OCH2)；6.8(S，2H)；6.78(d，1H，J＝16Hz)；7.3-7.5(m，5H)；7.7(D，1H，J＝16Hz)；MS(Cl)m/e463(MH+基線)，375，357。由AflanticMicrolabs(Norcross，佐治亞州)進(jìn)行碳?xì)浜偷治?，?.4％容許誤差。應(yīng)用上述技術(shù)的定性研究的總結(jié)見表2，給出了化合物15-17和21-24的分子式和元素分析。</tables>在生物實(shí)驗(yàn)前所有的黃嘌呤衍生物用薄層層析均判定為純品。實(shí)施例7本實(shí)施例描述在將CFPAC細(xì)胞接觸本發(fā)明的黃嘌呤衍生物時(shí)對(duì)這些細(xì)胞氯外流的測量，包括培養(yǎng)細(xì)胞和對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的方法。CFPAC細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞，對(duì)最普通的CFTR突變，即Phe508缺失(Schoumacher等，美國國家科學(xué)院院刊，87，4012-4016(1990))是純合的。CFPAC細(xì)胞和CFTR轉(zhuǎn)染的CFPAC細(xì)胞(CFPAC-47CFTR)得自R.Frizzell，阿拉巴馬大學(xué)。破碎細(xì)胞以低密度接種于24孔COSTAR板上，培養(yǎng)基含有Iscove培養(yǎng)基，并添加了10％(v/v)熱失活的胎牛血清，100單位/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，0.25mg/ml兩性霉素和1％(wt/vol)谷氨酰胺，滲透壓調(diào)至310mOsm。所有培養(yǎng)用物質(zhì)均購自Biofluids(Rockville，馬里蘭州)。5小時(shí)后移走培養(yǎng)基，粘壁細(xì)胞于37℃在5％CO2/95％空氣的氣氛中生長48-72小時(shí)至匯合。每次實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞如下載入[36Cl-]。用實(shí)施例6給出的培養(yǎng)基洗匯合的細(xì)胞4次。然后在最后一次清洗液蒸發(fā)凈后，每孔加入含約1.4×108cpm[36Cl]-(Amersham)的500μl培養(yǎng)基。細(xì)胞板在5％CO2/95％空氣的氣氛下37℃溫育過夜，使[36Cl]-同位素達(dá)到平衡。起始外流實(shí)驗(yàn)時(shí)，將CPX和/或其它黃嘌呤衍生物的濃度加到細(xì)胞中，19℃溫育15分鐘。溫育后，細(xì)胞用含150mM葡糖酸鈉，1.5mM葡糖酸鉀和10mMNa-Hepes(pH7.4)的冰冷的清洗培養(yǎng)基等分試樣連續(xù)洗4次。然后于19℃加入500μl無碳酸氫鹽的流動(dòng)培養(yǎng)基，每孔在0、1、2、3、5、7和10分鐘時(shí)各取出50μl等分試樣開始取樣。流動(dòng)培養(yǎng)基含150mM葡糖酸鈉，1.5mM葡糖酸鉀，10mMNa-Hepes(pH7.4)，100μM丁苯氧酸以抑制協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白造成的外流，不同濃度的CPX和其它藥物，如A1-腺苷拮抗物和cAMP合成的激活物，后面的實(shí)施例描述為何需要這些藥物。滲透壓是310mOsm。每次流動(dòng)實(shí)驗(yàn)后，加入20μl50％三氯乙酸至終濃度為5％，測量殘留放射性。樣品與1.5ml細(xì)胞閃爍流體混合，于BeckmanLS9000閃爍計(jì)數(shù)儀，窗口置于最大波長，檢測2分鐘。用滲透壓計(jì)凝固點(diǎn)降低法測滲透壓，見Eidelman等，同上，1992。用本發(fā)明的黃嘌呤衍生物重復(fù)氯外流實(shí)驗(yàn)至少4次，得到的數(shù)據(jù)總結(jié)于表1。另外每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)由4個(gè)獨(dú)立細(xì)胞的外流測量平均值計(jì)算得到。標(biāo)有“最大波長(nM)”的列表示黃嘌呤衍生物對(duì)氯外流影響最大時(shí)的濃度，其右列代表氯外流受最大影響時(shí)相對(duì)對(duì)照的百分比。標(biāo)有“閾值(nM)”的列代表能檢測到黃嘌呤衍生物對(duì)氯外流影響時(shí)衍生物濃度，其右列代表最小檢測時(shí)氯外流相對(duì)于對(duì)照的氯外流。由表1可見，最大激發(fā)范圍是從約3nM(例如對(duì)化合物14)到超過104nM(例如對(duì)化合物3)。最大激發(fā)濃度時(shí)相對(duì)對(duì)照的百分比增加從約10％(即無效化合物如化合物2和12)到約260％+/-70％(化合物17)。氯外流閾值激發(fā)的黃嘌呤衍生物濃度約104nM(例如化合物20)。閾值激發(fā)濃度時(shí)相對(duì)于對(duì)照的百分比從約120％(化合物12)至約170％(例如化合物17)。由這些數(shù)據(jù)，并且由于對(duì)任何藥物傾向用較低濃度來達(dá)到所需結(jié)果以使不需要的副作用降到最小，可見化合物6、7、13、14、17、19和25由于其在μM級(jí)或更低濃度激發(fā)氯外流的能力明顯而成為優(yōu)選化合物。圖9-12形象地給出流動(dòng)研究數(shù)據(jù)，化合物1即茶堿(圖9)；化合物5即CPX(圖10)；化合物22即8-環(huán)己基甲基咖啡因(圖11)和化合物17即1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤(圖12)。圖9-12垂直軸代表放射性標(biāo)記氯的[36Cl]-外流(FA)作為受試化合物濃度(水平軸)的函數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)方法log(FA)作時(shí)間的函數(shù)，線性回歸計(jì)算得這些數(shù)據(jù)，并作為相對(duì)同一板上對(duì)照孔的恒定速率的百分比給出。用Quatro-Pro4.0程序處理數(shù)據(jù)。誤差條代表4個(gè)實(shí)驗(yàn)的S.E.M.值(即n＝4)。觀察圖9-12可明顯看出化合物1、5和22具有與對(duì)照相比能誘導(dǎo)出200％的外流速率的特性?；衔?7也表現(xiàn)出比對(duì)照大于100％的外流能力，但與其它3種化合物比要小。圖示給出結(jié)果的這四種化合物中，化合物1和22對(duì)兩種受試的腺苷受體親和性均小，化合物17對(duì)A1受體的親和性較小(Ki≌0.07)，化合物5對(duì)A1受體的親和性極大(Ki≌0.005)。盡管化合物17比例如化合物5對(duì)A1受體的親和性小得多，但由表1可見，其絕對(duì)的氯外流能力要有效得多(化合物17最大值為對(duì)照的260％，而化合物5為200％)。實(shí)施例8本實(shí)施例描述檢測腺苷受體結(jié)合的試驗(yàn)和這些試驗(yàn)的結(jié)果，這些試驗(yàn)用來確定本發(fā)明的新型黃嘌呤衍生物的部分性質(zhì)。根據(jù)Hide等，分子藥物學(xué)(Mol.Pharmacol.)41，352-359(1992)的方法制備大鼠腦片層膜和紋狀膜，于37℃腺苷脫氨酶(2U/ml)處理30分鐘后，-70℃貯存。腺苷衍生物的固體樣品溶于二甲亞砜(DMSO)，用常規(guī)方法貯于-20℃。貯液用DMSO稀釋至濃度≤0.1mM，然后加入液體培養(yǎng)基中。DMSO在檢測培養(yǎng)基中的終濃度通常為2％。根據(jù)Schwabe等，Naunyn-Schmiedeberg醫(yī)藥叢刊(Naunyn-Schmiedeberg′sArch.Pharmacol.)，313，179-187(1980)和Jacobson等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志36，1333-1342(1993a)的描述測量大鼠腦片層膜中1nM[3H]N6-苯基異丙基腺苷(DupontNEN，Boston，麻省)與A1受體結(jié)合的抑制。37℃在總體積為0.5ml的50mMTris鹽酸，pH7.4溫育膜(～100μg蛋白每管)1.5小時(shí)。受試藥品溶于DMSO，加入10μl等份試樣中，得到DMSO終濃度2％。加入3ml含50mMTris鹽酸pH7.4的緩沖液于5℃分開結(jié)合的和游離的放射性配體，然后用BrandelCellHarvester(Brandel，Gaithersburg，馬里蘭州)和WhatmanGF/B玻璃纖維濾膜真空過濾，再加共9ml緩沖液洗滌。用10μM2-氯腺苷確定非特異性結(jié)合。根據(jù)Jarvis等，藥物實(shí)驗(yàn)療法雜志(J.Pharmacol.Exp.Therap.)251，888-893(1989)的報(bào)道做5nM[3H]CGS21680(2-[4-[(2-羧乙基)-苯基]乙基氨基]-5′-N-乙基羧氨基腺苷)(DupontNEN，Boston，麻省)與A2a受體結(jié)合的抑制。25℃在總體積為0.5ml的含50mMTris鹽酸pH7.4和10mMMgCl2的緩沖液溫育膜(～80μg蛋白每管)1小時(shí)。受試藥品溶于DMSO，加入10μl小份中，得到DMSO終濃度2％。用20μM2-氯腺苷確定非特異性結(jié)合。用上述BrandelCellHarvester過濾，用上述Tris·HCl/MgCl2緩沖液作洗滌緩沖液。根據(jù)每種化合物的IC50適當(dāng)調(diào)整，用至少跨越3個(gè)數(shù)量級(jí)的6種不同濃度。IC50值用GraphPAD程序(InstituteforScientificInformation，科學(xué)信息研究所)非線性回歸法計(jì)算機(jī)生成，用Cheng等的方法(生化醫(yī)藥學(xué)(Biochem.Pharmacol.)，22，3099-3108(1973)和KD值(Jacobson等，同上，1993a；Ukena等，F(xiàn)EBS快報(bào)，209，122-128(1986))對(duì)[3H]PIA和[3H]CGS21680結(jié)合分別轉(zhuǎn)換成Ki值1.0和14nM。對(duì)所有黃嘌呤衍生物在表1的“Ki，μM(A1)”和“Ki，μM(A2)”列給出腺苷受體結(jié)合研究的結(jié)果。對(duì)某個(gè)特定受體親和性高的受體拮抗物特征在于Ki值非常低，這可用上述對(duì)A1和A2受體的試驗(yàn)來確定。相應(yīng)地，可見化合物與對(duì)A1受體親和性高，而化合物6對(duì)受試的兩種受體親和性都低。圖13-14也描述了上述受體研究得到的數(shù)據(jù)，重點(diǎn)在于確證改變8-環(huán)烷基取代物環(huán)大小對(duì)結(jié)合腺苷受體的影響。圖中給出大鼠皮層A1-受體(實(shí)心圓，·)和大鼠紋狀A(yù)2a-受體(空心三角，Δ)的數(shù)據(jù)。給出δ-環(huán)烷基茶堿衍生物(圖16)和δ-環(huán)烷基咖啡因衍生物(圖17)對(duì)A1-和A2-受體的親和性。給出的數(shù)值是三次重復(fù)中二次或三次重復(fù)的平均值(+/-S.E.M.)。δ-環(huán)丁基衍生物的數(shù)據(jù)來自Jacobson等，醫(yī)藥化學(xué)雜志，36，2639-2644(1993b)。圖13和14顯示在茶堿(1，3-二甲基黃嘌呤)衍生物中，環(huán)戊基類似物化合物4對(duì)A1親和性最高?？Х纫?1，3，7-三甲基黃嘌呤)衍生物中，環(huán)庚基類似物化合物24對(duì)A2a有些親和性(6倍)，而小環(huán)(4-6)親和性小或沒有(Jacobson等，同上，1993b)。這些結(jié)構(gòu)活性關(guān)系與同親這些化合物激發(fā)Cl-外流的觀察結(jié)果相差很大。整體考慮上述結(jié)果得出，化合物6、14、17和19在低濃度范圍有足夠的外流活性且對(duì)腺苷受體無活性。這些實(shí)施例的結(jié)果顯示有可能(1)用體外脂質(zhì)體和/或CFTR結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定激活細(xì)胞氯離子外流的化合物；(2)用對(duì)A1或A2腺苷受體親和性很小或沒有的化合物，如化合物6、14、17或19激活CF細(xì)胞的氯外流。檢驗(yàn)到最有效的化合物是化合物17。若一種藥物能特異性激活CF細(xì)胞的氯外流，對(duì)腺苷受體的影響不大或沒有，并且該藥的作用不因其對(duì)其它組織的副作用而受損害，則該藥具有大的醫(yī)療優(yōu)點(diǎn)。所有本文引用的文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)和出版物，均完整地在此引入作為參考。盡管本發(fā)明著重針對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案來描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)明顯看出可以采用優(yōu)選方法、化合物和組合物的變化形式，并且本發(fā)明可與本文具體描述的不同地實(shí)施。相應(yīng)地，本發(fā)明包括在本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)與范圍內(nèi)由下面的權(quán)利要求限定的所有改進(jìn)方案。序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人THEUNITEDSTATESOFAMERICA，REPRESENTEDBYTHESECRETARY，DEPARTMENTOFHEALTHANDHUMANSERVICES(ii)發(fā)明題目一種鑒定用于在動(dòng)物細(xì)胞中激活氯傳導(dǎo)的結(jié)合CFTR的化合物的方法。(iii)序列數(shù)6(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(v)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朩O(B)提交日期1995年11月6日(C)分類(vi)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S343714(B)提交日期1994年11月22日(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQIDNO1ProSerGluGlyLysIleLysHisSerGlyArgIleSerPheCysSer151015GlnPheSerTrpIleMetProGlyThrIleLysGluAsnGluGluPhe202530(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長度96個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型mRNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO2CCNUCNGARGGNAARAUHAARCAYUCNGGNCGNAUHUCNUUYUGYUCNCARUUYUCNUGG60AUHAUGCCNGGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUY96(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQIDNO3GlyValSerTyrAspGluTyrArgTyrArgSerValIleLysAlaCys151015GlnLeuGluGluAspIleSerLysPheAlaGluLysAspAsnIle202530(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQIDNO4GlyThrIleLysGluAsnGluGluPheGlyValSerTyrAspGluTyr151015ArgTyrArgSerValIleLysAlaCysGlnLeuGluGluAspIleSer202530(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特征(A)長度93個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型mRNA(xi)序列描述SEQIDNO5GGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCNGUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGAR60GAYAUHUCNAARUUYGCNGARAARGAYAAYAUH93(2)SEQIDNO6的資料(i)序列特征(A)長度96個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型mRNA(xi)序列描述SEQIDNO6GGNACNAUHAARGARAAYGARGARUUYGGNGUNUCNUAYGAYGARUAYCGNUAYCGNUCN60GUNAUHAARGCNUGYCARUURGARGARGAYAUHUCN9權(quán)利要求1.一種多肽，它選自Iα多肽[SEQIDNO1]、Iβ多肽[SEQIDNO3]和Io多肽[SEQIDNO4]。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽與親和層析基質(zhì)共價(jià)連接。3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述親和層析基質(zhì)是sepharose、瓊脂糖、聚丙烯酰胺或纖維素。4.一種鑒定結(jié)合CFTR的化合物的方法，其包括將假定的結(jié)合CFTR的化合物與Iα多肽[SEQIDNO1]在足以使該假定的結(jié)合CFTR的化合物與Iα多肽結(jié)合的條件下相接觸，確定結(jié)合是否發(fā)生，若有結(jié)合跡象則說明該假定的結(jié)合CFTR的化合物是結(jié)合CFTR的化合物。5.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合CFTR的化合物對(duì)Iβ多肽[SEQIDNO3]或Io多肽[SEQIDNO4]有不確定的或負(fù)的親和性。6.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合CFTR的化合物在加入到含脂質(zhì)體的組合物中時(shí)會(huì)造成脂質(zhì)體聚集。7.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合CFTR的化合物在加入到含嗜鉻顆粒的組合物中時(shí)會(huì)造成嗜鉻顆粒聚集。8.權(quán)利要求7的方法，其中該組合物基本上由溶于1mMCaCl2的嗜鉻顆粒組成。9.一種治療需接受治療的哺乳動(dòng)物的囊狀纖維變性的方法，其包括施用治療有效量的下式化合物其中R1和R3相同，為C1-C6烷基或C1-R6鏈烯基，R7是C1-C6烷基或氫，R8是C4-C8環(huán)烷基，其中該化合物與腺苷受體的Ki值至少為0.01。10.權(quán)利要求9的方法，其中R1和R3是甲基、丙基或烯丙基，R7是甲基或氫，R8是環(huán)戊基或環(huán)己基。11.權(quán)利要求9的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。12.權(quán)利要求11的方法，其中化合物選自1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)戊基黃嘌呤，1，3-二丙基-7-甲基-8-環(huán)己基黃嘌呤，1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤和8-環(huán)己基咖啡因。13.權(quán)利要求12的方法，其中化合物是1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤。14.權(quán)利要求9的方法，其中化合物被施用到人的肺部。15.權(quán)利要求14的方法，其中化合物以含有約0.001至約0.01％w/w該化合物的含水藥物組合物的形式施用。16.權(quán)利要求9的方法，其中Ki至少為0.05。17.一種下式化合物其中(a)R1和R3相同，為甲基或烯丙基，R7是乙基，環(huán)丙基甲基或氫，R8是環(huán)己基，條件是當(dāng)R7是氫時(shí)R1是烯丙基，當(dāng)R7是乙基或環(huán)丙基甲基時(shí)R1是甲基，或(b)R1和R3均為甲基，R7是氫或甲基，R8是環(huán)己基甲基或環(huán)庚基。18.權(quán)利要求17的化合物，其中化合物為1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤。19.一種藥物組合物，它含有藥用載體和下式化合物其中(a)R1和R3相同，為甲基或烯丙基，R7是乙基，環(huán)丙基甲基或氫，R8是環(huán)己基，條件是當(dāng)R7是氫時(shí)R1是烯丙基，當(dāng)R7是乙基或環(huán)丙基甲基時(shí)R1是甲基，或(b)R1和R3均為甲基，R7是氫或甲基，R8是環(huán)己基甲基或環(huán)庚基。20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中化合物是1，3-二烯丙基-8-環(huán)己基黃嘌呤。21.一種多聚核苷酸，它選自Iα多聚核苷酸[SEQIDNO2]，Iβ多聚核苷酸[SEQIDNO5]和Io多聚核苷酸[SEQIDNO6]。全文摘要本發(fā)明提供一種方法,該方法可以鑒定用于治療尖端氯傳導(dǎo)降低的細(xì)胞(例如囊狀纖維變性細(xì)胞)的結(jié)合CFTR的化合物。本鑒定方法用到CFTR蛋白的組成部分－Ⅰα多肽。本發(fā)明還提供一種治療囊狀纖維變性細(xì)胞的方法,該方法是通過將尖端氯傳導(dǎo)降低的細(xì)胞與醫(yī)療有效量的用本發(fā)明的鑒定方法篩選到的化合物相接觸而完成的。用于這種治療的優(yōu)選化合物對(duì)腺苷細(xì)胞受體親和性很小或無親合性。本發(fā)明提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的新型化合物,以及含有這些化合物的藥物組合物。文檔編號(hào)A61K38/17GK1176648SQ95197439公開日1998年3月18日申請(qǐng)日期1995年11月6日優(yōu)先權(quán)日1994年11月22日發(fā)明者H·B·波蘭德,K·A·雅各布森申請(qǐng)人:美國政府衛(wèi)生與公眾服務(wù)部