專(zhuān)利名稱(chēng)：遺傳多發(fā)性外生骨疣家族的新多核苷酸和多肽基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分涉及新鑒定的多核苷酸和多肽；所述多核苷酸和多肽的變異體和衍生物；制備上述多核苷酸和多肽其變異體和衍生物的方法；所述多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑；所述多核苷酸，多肽，變異體，衍生物，激動(dòng)劑和拮抗劑的用途。更具體地從這些和其他方面說(shuō)，本發(fā)明涉及遺傳多發(fā)性外生骨疣家族的新多核苷酸和多肽，下文稱(chēng)為EXT2。
遺傳多發(fā)性外生骨疣(HME或EXT)是一種常染色體顯性病，多發(fā)性外生骨疣的特征在于大部分是從長(zhǎng)骨的近骨后區(qū)產(chǎn)生的?？赡苌婕暗钠渌前ㄐ睾凸桥鑾В吖?，而較少發(fā)生在椎骨，胸骨，頭顱和腕骨和跗骨。另外，還有一個(gè)特征是不正常模型，特別是長(zhǎng)骨的不正常模型。這會(huì)引起有關(guān)骨的彎曲，縮短，皮層不規(guī)則和干骺端增寬，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致前臂變形和身材短不成比例。外生骨疣會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥如相鄰神經(jīng)，血管和腱的壓迫和刺激以及泌尿和腸梗塞。最嚴(yán)重的并發(fā)癥是肉瘤變性，這在受影響的個(gè)體中有0.5-2％的發(fā)生率(Hennekam，R.C.M.Hereditary Multiple Exostoses，J.Med.Genet.28262-266，(1991))。Hecht等人(Hecht，J.T.；Hogue，D.；Strong，L.C.；Hansen，M.F.；Blanton，S.H.；Wagner，M，Hereditary Multiple Exostosis andChondrosarcomaLinkage to Chromosome 11 and Loss of Heterozygosityfor EXT-Linked Markers on Chromosomes 11 and 8.，Am.J.Hum.Genet.561125-1131(1995))報(bào)告了多發(fā)性外生骨疣中2-5％的軟骨肉瘤發(fā)生率，與此相比，所有骨癌的隨年齡的發(fā)生率為1/100,000。多發(fā)性外生骨疣是Langer-Giedion綜合癥(150230)的部分，這種綜合癥可能是因8q24區(qū)的缺失而引起的鄰近基因綜合癥。
遺傳連鎖研究確定了多發(fā)性外生骨疣基因的三個(gè)座位。分別將其定位在染色體8，11和19。
Cook等人(Cook，A.；Raskind，W.；Blanton，S.H.；Pauli，，R.M.；Gregg，R.G.，F(xiàn)rancomano，C.A.；Puffenberger，E.；Conrad，E.U.；Schmale，G.；Schellenberg，G.；Wijsman，E.；Hecht，J.T.；Wells，D.；Wagner，M.J.，Genetic Heterogeneity in Families With Hereditary MultipleExostoses.，Am.J.Hum.Genet.5371-79(1993))得出結(jié)論約70％的多發(fā)性外生骨疣家族與8q24.11-q24.13區(qū)中的標(biāo)記有連鎖。研究2個(gè)大外生骨疣譜系排除了與8q24標(biāo)記的連鎖，Wu等人(Wu，Y.-Q.；Heutink，P.；de Vries，B.B.A.；Sandkuijl，L.a.；van den Ouweland，A.M.W.；Niermeijer，M.F；Galjaard.H.；Reyniers，E.；Willems，P.J；Halley，D.J.J.，assignment of a SecondLocus for Multiple Esostoses to the Pericentromeric Region ofChromosome 11，Hum.Molec.Genet.3167-171(1994))發(fā)現(xiàn)了與11號(hào)染色體近短和長(zhǎng)臂的微衛(wèi)星標(biāo)記的連鎖。2點(diǎn)分析的最高優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)是D11S554，在theta＝0.03時(shí)，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)是7.148。
Hecht等人(1995)和Raskind等人(Raskind，W.H.，Conrad，E.u.；Chansky，H.，Matsushita，M.Loss of Heterozygosity inChondrosarcomas for Markers Linded to Hereditary MultipleExostooses Loci on Chromosomes 8 and 11，AmJ.Hum.Genet.561132-1139(1995))提出證據(jù)說(shuō)明在染色體8上的EXF1基因和在染色體11上的EXT2基因有腫瘤抑制功能。他們發(fā)現(xiàn)在源于多發(fā)性外生骨疣之個(gè)體的軟骨肉瘤和在散發(fā)的軟骨肉瘤中，與這兩個(gè)基因相連的標(biāo)記丟失了雜合性。
在美國(guó)確定3EXT型頻率的大型研究中，Hecht等人(1995)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)患有多發(fā)性外生骨疣的大的多代家族，其中一個(gè)成員有軟骨肉瘤。該家族說(shuō)明了所述疾病與染色體11標(biāo)記的連鎖。用來(lái)自染色體8，11和19的短串聯(lián)重復(fù)(STR)標(biāo)記比較受影響家族成員的構(gòu)成型和腫瘤DNA。在腫瘤中觀(guān)察到染色體8和11標(biāo)記的雜合性丟失(LOH)，但染色體19標(biāo)記是完整的。Hecht等人(1995)在來(lái)自所有受影響個(gè)體的構(gòu)成型的DNA和腫瘤樣品中，觀(guān)察到明顯的D11S903缺失。這些結(jié)果表明EXT2基因在含D11S903的區(qū)內(nèi)，兩側(cè)為D11S1355和D11S1361。作者相似地分析了來(lái)自6個(gè)不相關(guān)個(gè)體的其他構(gòu)成型和軟骨肉瘤DNA，其中2個(gè)有EXT。有EXT之個(gè)體的一個(gè)腫瘤有染色體8標(biāo)記的LOH，發(fā)現(xiàn)有散發(fā)軟骨肉瘤的人有腫瘤特異性L(fǎng)OH和染色體11標(biāo)記的純和缺失。這些發(fā)現(xiàn)向Hecht等人(1995)表明EXT基因可能是腫瘤抑制基因，而且腫瘤發(fā)育的引發(fā)可能是在多步驟模式之后。Raskind等人(1995)發(fā)現(xiàn)在與多發(fā)性外生骨疣有關(guān)之基因相連的多形座位上，構(gòu)成型雜合性的丟失。他們檢測(cè)了在患多發(fā)性外生骨疣的人的軟骨肉瘤中，與染色體8上的EXT1相連之標(biāo)記的LOH。他們還發(fā)現(xiàn)在17個(gè)散發(fā)軟骨肉瘤中的4個(gè)中，有與EXT1相連之標(biāo)記的LOH，而7個(gè)有與EXT2相連之標(biāo)記的LOH?？傊?，Raskind等人(1995)在18個(gè)腫瘤中的44％上觀(guān)察到與EXT1或EXT2相連之標(biāo)記的LOH，而在與EXT3相連的19p上的標(biāo)記保留了雜合性。這些發(fā)現(xiàn)也表明了EXT基因的腫瘤抑制作用。
研究7個(gè)擴(kuò)展的多發(fā)性外生骨疣家族，它們都與EXT2座位相連，Wuyts等人(Wuyts，W.；Ramlakhan，S.；Van Hul，W.；Hecht，J.T.；van den Ouweland A.M.W.；Raskind，W.H.；Hofstede，F(xiàn).C.Reyniers，E.；Wells，D.E.；de Vries，B.；Conrad，E.U.；Hill，A.；Zalatayev，D.；Weissenbach，J.；Wagner，M.J.；Bakker，E.；Halley，D.J.J.；Willems，P.J.，Refinement of the MultipleExostoses Locus(EXT2)to a 3-cM Interval on Chromosome 11，Am.J.Hum.Genet.57382-387(1995))將EXT2基因的位置確定在兩側(cè)為D11S1355和D11S1361/D11S554的3-cM區(qū)。這一發(fā)現(xiàn)表明EXT2基因位于11p12-p11。確定的位置排除了許多推測(cè)的候選基因，這些基因位于染色體11的著絲粒周?chē)膮^(qū)域。
McGaughran等人(McGaughran，J.M.；Ward，H.B.；Evans，D.G.R.，WAGRSyndrome and Multiple Exostoses in a Patient With Del(11)(p11.2p14.2)，J.Med.Genet.32823-824(1995))也提供了支持EXT2基因定位的報(bào)道，該報(bào)道描述了患有多發(fā)性外生骨疣和WAGR綜合癥(Wilms腫瘤，無(wú)虹膜，先天畸形和精神發(fā)育不全；194070)組合的患者，一種與很多資料相符的因11p13缺失而導(dǎo)致的鄰接基因綜合癥。其患者表現(xiàn)為del(11)(p14.2p11.2)。
正如由Potocki等人(Potocki，L.；Greenberg，f.；Shaffer，L.G.，Interstitial Deletion of 11(p12p11.2)A Rare Chromosomal SyndromeWith Mental Regardation，Parietal Foramina，and Multiple exostoses.(abstract)，Am.J.Hum.Genet.57A123(1995))指出的，對(duì)因11p的間隙缺失，del(11)(p12p11.2)而導(dǎo)致的鄰接基因綜合癥的描述，包括以多發(fā)性外生骨疣為特征，使得可以確定EXT2的圖譜。所述鄰接基因綜合癥的其他特征是精神發(fā)育不全和parietal foramina，稱(chēng)為Catlin標(biāo)記。Potocki和Shaffer(Potocki，L.；Shaffer，L.G.，Interstitial Deletion of 11(p11.2p12)aNewly Described Contiguous Gene Deletion Syndrome Involving theGene for Hereditary Multiple Exostoses(EXT2)，Am.J.Med.Genet.62319-325(1996))報(bào)告了在另一有11(p1.2p11.2)缺失的患者中的臨床和分子發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)分析表明了一個(gè)已知與EXT2緊緊相連的標(biāo)記的新的父本衍生的缺失。所述患者有不正常的面容(兩側(cè)內(nèi)眥愚型，上瞼下垂，短人中和向下的嘴唇)精神發(fā)育不全，多發(fā)性外生骨疣，短頭畸形和兩側(cè)parietalforamina。
Ahn等人(Ahn J.et al.，Cloning of the Putative Tumor SuppressorGene for Hereditary Multiple Exostoses，Nature Genet.，11，137-143(1995))克隆并表征了以前在2名多發(fā)性外生骨疣患者中鑒定的跨染色體斷裂點(diǎn)的cDNA。此外，在2個(gè)EXT1家族受影響的成員中，基因含有碼移突變。cDNA含有2238 bp的編碼區(qū)，與其他已知的基因序列沒(méi)有明顯的同源性。
Stickens等人(Stickens D.；Clines，G.；burbee，D.；Ramos，p.；Thonas，s.；Hogue，D.；Hecht，J.T.；Lovett，M.；Evans，G.A.，The EXT2 MultipleExostoses Gene Defines a Family of Putative Tumour suppressor Genes，Nature Genet.1425-32(1996))報(bào)告了對(duì)染色體11上EXT2基因的鑒定和表征。EXT2基因含有7個(gè)外顯子，編碼718個(gè)氨基酸的多肽。通過(guò)Northern分析，他們?cè)趲缀跛薪M織中均檢測(cè)到一3.5kb的轉(zhuǎn)錄本。另一種剪接在一些組織中產(chǎn)生了一小的3.7kb轉(zhuǎn)錄本。該基因與染色體8上的EXT1基因有顯著的序列相似性。由Hecht等人(1995)描述的有染色體11連鎖的多發(fā)性外生骨疣的多代家族中，其中的一個(gè)家族成員發(fā)展成了惡性軟骨肉瘤。在該家族中，在所有受影響的成員中均觀(guān)察到包括多形標(biāo)記D11S903之區(qū)域的顯著缺失。在從軟骨肉瘤患者衍生的腫瘤組織中，Stickens等人(1996)觀(guān)察到缺失了多形標(biāo)記D11S903，而且有其他染色體11標(biāo)記的LOH。在用于突變的EXT2候選基因的最初研究中，他們用來(lái)自3個(gè)不相關(guān)家族之受影響成員的DNA完成了SSCP分析。在1個(gè)患者的2個(gè)等位基因中的1個(gè)鑒定了核苷酸784-787的缺失，導(dǎo)致了EXT2基因產(chǎn)物的移碼和成熟前終止。
用通過(guò)顯微解剖從11p11-12構(gòu)建的基因組DNA文庫(kù)，從人胎盤(pán)cDNA文庫(kù)中分離了數(shù)個(gè)cDNA克隆。其中一個(gè)克隆與EXT1 cDNA在某些部分享有59％的同源性。通過(guò)熒光用原位雜交將該基因定位在染色體11p11，這是EXT2基因所處的精確的區(qū)域。通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選和5′RACE技術(shù)，克隆了全長(zhǎng)cDNA序列。預(yù)測(cè)該cDNA編碼728個(gè)氨基酸。cDNA和氨基酸序列均與EXT1有顯著的相似性。因此，該基因引起染色體11連鎖的多發(fā)性外生骨疣。
通過(guò)將本發(fā)明的cDNA序列與報(bào)告的EXT2基因序列相比較，它們?cè)诰幋a區(qū)中部有90bp的不同，這導(dǎo)致與Stickens(Stickens，1996)報(bào)告的有30個(gè)氨基酸的不同。
Stickens等人從腦cDNA文庫(kù)中分離了該cDNA，而本發(fā)明的cDNA是從胎盤(pán)cDNA文庫(kù)中分離的。我們的DNA序列與他們的DNA序列之間的差異表明至少有兩種EXT2編碼的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
這表明EXT2基因作為治療靶是有用的。顯然還需要鑒定并表征在預(yù)防，改善或改正機(jī)能障礙或疾病，包括但不限于遺傳性多發(fā)性外生骨疣和癌如軟骨肉瘤等中起作用的其他基因。
在這樣或那樣的目的中，本發(fā)明的一個(gè)特別的目的是提供了多肽，所述多肽已經(jīng)通過(guò)

圖1中所列的氨基酸序列與其他蛋白質(zhì)如EXT1之已知氨基酸序列的同源性而被鑒定為新EXT2。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼EXT2的多核苷酸，特別是編碼由本文SEQID NO2所表示之多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸含有編碼圖1所列序列中之EXT2的區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明的所述方面，提供了分離的編碼EXT2的核酸分子，包括mRNAs，cDNAs，基因組DNAs和片段，在本發(fā)明所述方面的其他實(shí)施方案中，提供了生物學(xué)，診斷學(xué)，臨床或治療有用的其變異體，類(lèi)似物或衍生物，包括所述變異體，類(lèi)似物和衍生物的片段。
在本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案中是天然產(chǎn)生的EXT2的等位基因變異體。
本發(fā)明的另一方面是特別提供EXT2多肽，可以將其用于治療目的，例如治療遺傳多發(fā)外生骨疣和癌，如軟骨肉瘤等。
根據(jù)本發(fā)明的該方面，提供了新的人源多肽，稱(chēng)為EXT2，以及其生物學(xué)，診斷學(xué)或治療有用的片段，變異體和衍生物，所述片段的變異體和衍生物以及前述的類(lèi)似物。
本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案是由天然產(chǎn)生的EXT2基因的等位基因編碼的EXT2的變異體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了篩選化合物的方法，所述化合物結(jié)合并激活本發(fā)明多肽或抑制本發(fā)明多肽之激活。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)前述多肽，多肽片段，變異體和衍生物，所述變異體和衍生物的片段以及前述類(lèi)似物的方法。在本發(fā)明該方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了生產(chǎn)前述EXT2多肽的方法，包括在宿主中表達(dá)EXT2的條件下，培養(yǎng)含有編碼外源衍生之EXT2的多核苷酸可表達(dá)地?fù)饺肫渲械乃拗骷?xì)胞，在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)EXT2，然后從宿主細(xì)胞中回收表達(dá)的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了產(chǎn)物，組合物，工藝和除此之外，還提供了利用上述多肽和和多核苷酸進(jìn)行研究，生物學(xué)，臨床和治療等目的的方法。
根據(jù)本發(fā)明該方面某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了產(chǎn)物，組合物和方法等以用于下列方面通過(guò)確定EXT2多肽或EXT2編碼的mRNA而評(píng)價(jià)細(xì)胞EXT2表達(dá)以便通過(guò)體外，間接體內(nèi)或體內(nèi)將細(xì)胞暴露于本文公開(kāi)的EXT2多肽或多核苷酸而治療遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌如軟骨肉瘤等；檢測(cè)在EXT2基因中的遺傳變異和畸變?nèi)缛毕?；給生物體施用EXT2多肽或多核苷酸以促進(jìn)EXT2功能或治療EXT2機(jī)能障礙。
根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方案，提供了用所述激活化合物刺激本發(fā)明的多肽以治療與EXT2的表達(dá)不足相關(guān)的疾病的方法。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了用所述抑制化合物治療與EXT2過(guò)度表達(dá)相關(guān)之疾病的方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了非天然產(chǎn)生的合成的，分離的和/或重組EXT2多肽片段，在本發(fā)明EXT2至少一個(gè)區(qū)有保守氨基酸取代的共有序列片段和/或序列，上述多肽能夠從質(zhì)量和數(shù)量上調(diào)整EXT2與其受體或配體的結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了合成或重組EXT2多肽，其保守取代和衍生物，其抗體，抗個(gè)體基因型抗體，可用作EXT2功能調(diào)節(jié)劑的組合物和方法，由于用其預(yù)期的生物學(xué)特性通過(guò)與所述多肽結(jié)合或調(diào)節(jié)多肽結(jié)合而可用在診斷，治療和/或研究應(yīng)用中。
本發(fā)明的另一方面提供被設(shè)計(jì)用來(lái)抑制或模擬各種EXT2或其片段的合成的，分離的或重組多肽。
根據(jù)本發(fā)明這一方面和其他方面特定的優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了與EXT2序列雜交的探針。
在本發(fā)明該方面其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了抗EXT2多肽的抗體。從這點(diǎn)考慮，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體對(duì)于EXT2來(lái)說(shuō)是有高度選擇性的。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了EXT2激動(dòng)劑。這些優(yōu)選的激動(dòng)劑是模擬EXT2多肽并與EXT2結(jié)合分子或受體結(jié)合，引發(fā)或促進(jìn)EXT2誘導(dǎo)的反應(yīng)的分子。這些優(yōu)選的激動(dòng)劑還是與EXT2或EXT2多肽或與其他EXT2活性調(diào)節(jié)劑相互作用，由此促進(jìn)EXT2的一種作用或EXT2的一種以上之作用的分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了EXT2拮抗劑。優(yōu)選的拮抗劑是模擬EXT2多肽以便與EXT2受體或結(jié)合分子結(jié)合但不引發(fā)一種EXT2誘導(dǎo)的反應(yīng)或一種以上EXT2誘導(dǎo)之反應(yīng)的那些。優(yōu)選的拮抗劑還是與EXT2結(jié)合或相互作用以便抑制EXT2的一種作用或一種以上EXT2作用或防治EXT2表達(dá)的分子。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有EXT2多核苷酸或EXT2多肽的組合物，以便體外，間接體內(nèi)或體內(nèi)施用給細(xì)胞或施用給多細(xì)胞生物體。在本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物含有EXT2多核苷酸以便在宿主生物體中表達(dá)EXT2多肽從而治療疾病。從這點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選的是在遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌如軟骨肉瘤患者中表達(dá)以便治療與畸變的EXT2內(nèi)生活性相關(guān)的機(jī)能障礙。
從下列描述中，本發(fā)明的其他目的，特征，優(yōu)點(diǎn)和方面對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。但是應(yīng)當(dāng)理解，盡管說(shuō)明了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但下列描述和具體的實(shí)施例只是說(shuō)明性的。從下列描述的閱讀和從本發(fā)明公開(kāi)的其他部分的閱讀中，在本發(fā)明公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖描述了本發(fā)明特定的實(shí)施方案。他們只是說(shuō)明性的，而不是為了限制本文公開(kāi)的本發(fā)明。
圖1表示EXT2的核苷酸序列和由此推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)。術(shù)語(yǔ)提供下列說(shuō)明性的解釋是為了有利于理解本文經(jīng)常使用，特別是在實(shí)施例中使用的特定術(shù)語(yǔ)。提供解釋是為了方便而不是為了限制本發(fā)明。
DNA的“消化”指用酶，例如但不限于僅作用于DNA中特定序列的限制酶催化裂解DNA。本文所提及的各種限制酶是市售的，而且它們的反應(yīng)條件，輔助因子和使用的其他要求對(duì)于專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是已知的而且是常規(guī)的。
一般為了分析目的，用在約20微升反應(yīng)緩沖液中約2單位的酶消化1微克的質(zhì)粒或DNA片段。為了分離DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，一般在成比例的較大的體積中，用20-250單位的酶消化5-50微克的DNA。
在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(如下文提到的)中描述了對(duì)于特定限制酶所適宜的緩沖液和底物的量，而且供應(yīng)商作了說(shuō)明。
通常使用在37℃約1小時(shí)的保溫時(shí)間，但條件可以隨標(biāo)準(zhǔn)方法，供應(yīng)商的說(shuō)明和反應(yīng)的細(xì)節(jié)而變化。在消化后，用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，可以分析反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)電泳純化片段。
“遺傳元件”主要指含有編碼多肽的區(qū)域或調(diào)節(jié)復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯或其他過(guò)程之區(qū)域的多核苷酸，所述其他區(qū)域?qū)τ谠谒拗骷?xì)胞中表達(dá)所述多肽是重要的，或者含有編碼多肽的區(qū)域以及與其可操作相連之可調(diào)節(jié)表達(dá)區(qū)的的區(qū)域的多核苷酸。
遺傳元件可以包含在可作為附加體復(fù)制的載體內(nèi)；即作為生理上獨(dú)立于宿主細(xì)胞基因組的分子?？梢詫⑺鼈兒谛∪旧w內(nèi)，如在真核細(xì)胞中通過(guò)氨甲蝶呤選擇，在轉(zhuǎn)染的DNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的那些。也可以在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)包含遺傳元件，不是以其自然狀態(tài)，而是在例如分離，克隆操作后，以純化的DNA形式或在載體中等導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。
“分離的”指“通過(guò)人手”從其自然狀態(tài)改變的；即如果它是天然產(chǎn)生的，則已經(jīng)將其從其來(lái)源環(huán)境中改變或除去，或兩種情況兼而有之。例如在活動(dòng)物中以其自然狀態(tài)存在的天然產(chǎn)生的多核苷酸或天然存在的多肽就不是“分離的”，但從其天然狀態(tài)共存的物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或多肽就是“分離的”，本文所用的就是這一術(shù)語(yǔ)。例如，就多核苷酸而言，術(shù)語(yǔ)分離的指將其從染色體或它天然存在的細(xì)胞中分離出來(lái)。
作為分離的部分或分離后，可將所述多核苷酸與其他多核苷酸如DNA連接進(jìn)行誘變以形成融合蛋白質(zhì)并用于例如在宿主中增殖或表達(dá)?？梢詫⒎蛛x的多核苷酸(單獨(dú)的或與其他多核苷酸，如載體相連的)導(dǎo)入到在培養(yǎng)的或在全生物體中的宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入到培養(yǎng)或全生物體的宿主細(xì)胞中后，所述DNA仍是可以被分離的，(正如本文所用的術(shù)語(yǔ))，因?yàn)樗鼈儾皇且云涮烊簧a(chǎn)的形式或在其天然環(huán)境中。相似的，多核苷酸和多肽可以在用于導(dǎo)入多核苷酸或多肽例如至細(xì)胞中的組合物，如培養(yǎng)基，制劑，溶液中組合物或溶液以用于化學(xué)或酶反應(yīng)，例如可以不是天然產(chǎn)生的組合物，其中保留了在本文所用術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)的分離的多核苷酸或多肽。
“連接”指在兩個(gè)或更多的多核苷酸，最經(jīng)常的是雙鏈DNA之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。用于連接的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，而且在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)和文獻(xiàn)，如Sambrook等人(MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2ndEd.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor)(下文稱(chēng)為Sambrook等人)中描述了用于連接的方法。
“寡核苷酸”指相對(duì)短的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)常常指單鏈脫氧核糖核苷酸，但它也指單鏈或雙鏈核糖核苷酸，RNADNA雜交體以及雙鏈DNA等。
通常用化學(xué)方法合成寡核苷酸，如單鏈DNA探針寡核苷酸，如用自動(dòng)寡核苷酸合成儀合成的那些。但是，也可以用各種其他方法，包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)以及在細(xì)胞和生物體中表達(dá)DNA來(lái)制備寡核苷酸。
首先，得到化學(xué)合成的沒(méi)有5′磷酸的DNA。所述寡核苷酸的5′末端不是通過(guò)通常使用DNA連接酶形成重組DNA分子之連接反應(yīng)形成磷酸二酯鍵的底物。若需要連接所述寡核苷酸，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用激酶和ATP的那些技術(shù)可以加入磷酸。
化學(xué)合成的寡核苷酸的3′末端通常有一游離的羥基，存在連接酶，如T4DNA連接酶時(shí)，就容易與另一多核苷酸，如另一寡核苷酸的5’磷酸形成磷酸二酯鍵。正如熟知的，如果需要在連接前通過(guò)除去其他多核苷酸的5’磷酸可以選擇性地抑制該反應(yīng)。
“質(zhì)?！笔欠€(wěn)定遺傳的而不是其宿主細(xì)胞染色體一部分的遺傳元件。它們可以由DNA或RNA組成，可以是線(xiàn)性的或環(huán)狀的。質(zhì)粒編碼確保其在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的分子，而且可以編碼相當(dāng)重要的醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)和環(huán)境的產(chǎn)物。例如它們可以編碼能夠大大提高致病菌的毒力的毒素。它們還可以編碼賦予抗生素抗性的基因。在分子生物學(xué)中，廣泛地使用質(zhì)粒作為載體克隆并表達(dá)重組基因。根據(jù)本領(lǐng)域熟悉的標(biāo)準(zhǔn)命名慣例，本文用一個(gè)小寫(xiě)的“p”，在其前面和/或后面跟著大寫(xiě)字母和/或數(shù)字來(lái)表示質(zhì)粒。本文公開(kāi)的起始質(zhì)粒可以是市售的，公開(kāi)可得到的，或可以通過(guò)熟知的公開(kāi)方法的常規(guī)應(yīng)用，從可得到的質(zhì)粒構(gòu)建而得。根據(jù)本發(fā)明可以使用的許多質(zhì)粒和其他克隆和表達(dá)載體是熟知的，而且對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)是容易得到的。此外，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以容易地構(gòu)建任何適用于本發(fā)明的其他質(zhì)粒。在本發(fā)明中所述質(zhì)粒，以及其他載體的特性，構(gòu)建和用途從本發(fā)明的公開(kāi)來(lái)看，對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是顯而易見(jiàn)的。
“多核苷酸”通常指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未被修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。因此，例如本文所用的多核苷酸之單鏈和雙鏈DNA，是單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，是單鏈和雙鏈區(qū)之混合物的RNA，可以是單鏈或更通常是雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的含有DNA和RNA雜交體分子。另外，本文所用的多核苷酸指含有RNA或DNA或RNA和DNA的三股鏈區(qū)。在所述區(qū)域中的鏈可以來(lái)自相同的分子或來(lái)自不同分子。所述區(qū)域可以包括一個(gè)或多個(gè)分子的全部，但更通常是只涉及某些分子的一個(gè)區(qū)域。三股螺旋區(qū)的一種分子常常是寡核苷酸。正如本文所用的，術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基的上述DNA或RNA。因此帶有因穩(wěn)定性或其他原因而修飾之骨架的DNA或RNA是多核苷酸，正是本文該術(shù)語(yǔ)所指的。此外，含有不正常堿基，如次黃苷或修飾的堿基，如三苯甲基化的堿基(僅說(shuō)了兩個(gè)實(shí)例)的DNA或RNA是多核苷酸，正如本文所用的術(shù)語(yǔ)。應(yīng)理解，已經(jīng)對(duì)DNA和RN進(jìn)行了各種修飾，適合于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的有用的目的。術(shù)語(yǔ)多核苷酸(正如本文所用的)包括多核苷酸的化學(xué)，酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞，包括特別簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞的DNA和RNA特性的化學(xué)形式。
本文所用的“多肽”包括下列描述的所有多肽。多肽的基本結(jié)構(gòu)是熟知的，而且已經(jīng)在本領(lǐng)域的許多教科書(shū)和其他文獻(xiàn)中作了描述。在本文中，本文所用的該術(shù)語(yǔ)指任何肽或蛋白質(zhì)，它們含有通過(guò)肽鍵彼此線(xiàn)性相連的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸。如本文所用的，該術(shù)語(yǔ)指短鏈，這在本領(lǐng)域中通常指肽，寡肽或寡聚物，該術(shù)語(yǔ)也指長(zhǎng)鏈，這在本領(lǐng)域中通常指蛋白質(zhì)，其中都有許多類(lèi)型。
應(yīng)該理解，所述多肽常常含有除通常提及的20種天然產(chǎn)生的氨基酸以外的氨基酸，而且在所給的多肽中，用天然方法，如加工和其他翻譯后修飾，或化學(xué)修飾技術(shù)(這些都是本領(lǐng)域熟知的)可以修飾許多氨基酸，包括末端氨基酸。甚至在多肽中天然發(fā)生的普通修飾也是很多的，難以在此窮舉，但在基本教科書(shū)和更詳細(xì)的專(zhuān)著以及大量的研究文獻(xiàn)中均有詳細(xì)的描述，因此對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在本發(fā)明多肽中存在的已知的修飾包括，但不限于，乙?；；?，ADP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價(jià)連接，血紅素部分的共價(jià)連接，核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接，脂或脂衍生物的共價(jià)連接，phosphotidylinositol的共價(jià)連接，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，去甲基化，共價(jià)交聯(lián)的形成，胱氨酸的形成，焦谷氨酸鹽的形成，甲?；?，γ-羧基化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘化，甲基化，豆蔻?；?，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊烯基化，外消旋化，氫(氧)硒基化，硫酸化，轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的將氨基酸加到蛋白質(zhì)中如精氨?；捅樵诘鞍谆?。這些修飾對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是熟知的，而且在許多科學(xué)文獻(xiàn)中均有詳細(xì)的描述。在大多數(shù)基本教科書(shū)，如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993。中描述了幾種最常用的修飾，包括糖基化，脂附著，硫酸化，谷氨酸殘基的γ-羧基化，羥基化和ADP-核糖基化。還可以得到有關(guān)該方面的詳細(xì)綜述。參見(jiàn)例如Wold，F(xiàn).，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives andProspects，pgs.1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson，E.，Academic Press，New York，1983；Seifteret al.，“Analysis for protin modifictions and nonprotein cofactors”，Meth.Enzymol.，1990，182626-646 and Rattan et al.，“ProteinSynthesisPosttranslational Modificarions and Aging”，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992 66348-62。
正如熟知的和上文說(shuō)明的，應(yīng)該理解，所述多肽并不總是完整的線(xiàn)性。例如，多肽可以因遍在蛋白化而是分支的，它們可以是環(huán)狀的，有或沒(méi)有分支，通常是翻譯后加工過(guò)程的結(jié)果，包括天然加工和因非自然的人工操作而生產(chǎn)的過(guò)程。用非翻譯天然方法和完全的合成方法可以合成環(huán)狀的，分支的和分支的環(huán)狀多肽。
修飾可以發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽骨架，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。事實(shí)上，通過(guò)共價(jià)修飾來(lái)阻斷多肽中的氨基或羧基通常是天然過(guò)程，而合成的多肽和所述修飾也可以存在于本發(fā)明的多肽中。例如在大腸桿菌中產(chǎn)生的多肽的氨基末端殘基，在加工前幾乎總是N-甲酰甲硫氨酸。
在多肽中發(fā)生的修飾經(jīng)常是它如何制備的一種功能。為了通過(guò)在宿主中表達(dá)克隆的基因而制備多肽，大部分修飾的性質(zhì)和程度取決于宿主細(xì)胞翻譯后修飾的能力和在多肽氨基酸序列中存在的修飾信號(hào)。例如，象已知的，在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中一般不發(fā)生糖基化。因此，當(dāng)需要糖基化時(shí)，應(yīng)在糖基化的宿主，通常是真核細(xì)胞中表達(dá)多肽。昆蟲(chóng)細(xì)胞經(jīng)常象哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣完成翻譯后糖基化，由于該原因，已經(jīng)發(fā)展了昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)有效表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，所述哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)特別地具有天然的糖基化方式?？梢詫⑾嗨频目紤]用于其他修飾。
應(yīng)該理解，可以在給定多肽中的數(shù)個(gè)位點(diǎn)，以相同或不同的程度存在相同類(lèi)型的修飾。另外，所給的多肽還可以含有許多類(lèi)型的修飾。
總之，如本文所用的，術(shù)語(yǔ)多肽包括了所有所述修飾，特別是在通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸而合成的多肽中存在的那些。
本文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸或多肽的“變異體”分別是不同于參考多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽。下面和在本發(fā)明公開(kāi)的別處更詳細(xì)地描述了上述意義上的變異體。
變異體包括核苷酸序列不同于另一種參考多核苷酸的多核苷酸。通常，要限制這種差異以便使參考和變異體的核苷酸序列總的來(lái)說(shuō)很相似，而且在許多區(qū)域中相同。
正如下面說(shuō)明的，在變異體核苷酸序列中的改變是沉默的。即，它們不會(huì)改變由所述多核苷酸編碼的氨基酸。在將改變限制于這種類(lèi)型的沉默改變時(shí)，變異體將編碼與參考有相同氨基酸序列的多肽。下面還說(shuō)明，在變異體核苷酸序列中的改變將改變由參考多核苷酸編碼之多肽的氨基酸序列。如下文所討論的，所述核苷酸改變會(huì)導(dǎo)致由參考序列編碼之多肽的氨基酸取代，增加，缺失，融合和截短。
變異體還包括氨基酸序列不同于另一種參考多肽的多肽。通常要限制這種差異以便使參考和變異體的序列總的來(lái)說(shuō)很相似，而且在許多區(qū)域中相同。
變異體和參考多肽在氨基酸序列中可以因一個(gè)或多個(gè)取代，增加，缺失，融合和截短(可以存在任何組合)而有所不同。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白質(zhì)”是由兩種，經(jīng)常是不相關(guān)的融合的基因或其片段編碼的蛋白質(zhì)。EP-A-O 464533(加拿大同族2045869)公開(kāi)了融合蛋白，它含有免疫球蛋白分子恒定區(qū)的不同部分和另一人蛋白質(zhì)或其部分。在許多情況下，用免疫球蛋白Fc區(qū)作為融合蛋白的部分對(duì)于用于治療和診斷是有利的，這樣會(huì)導(dǎo)致例如改善藥物動(dòng)力學(xué)特性(EP-A 0232 262)。另一方面，為了某些用途，在融合蛋白被表達(dá)，檢測(cè)和純化后，需要能夠檢測(cè)Fc部分。因此，需要將融合蛋白組分與化學(xué)或酶促裂解的連接區(qū)相連。這就是證明Fc部分妨礙治療和診斷應(yīng)用時(shí)的那種情況，例如當(dāng)將融合蛋白用作免疫抗原時(shí)。在藥物篩選中，例如已經(jīng)將人蛋白質(zhì)，如ShIL-5α與Fc部分融合以用于高處理量篩選試驗(yàn)以鑒定hIL-5的拮抗劑。參見(jiàn)D.Bennett et al.，Journal of MolecularRecognition，1995，852-58；和K.Johanson et al.，The Journal ofBiological Chemistry，1995，270(16)9459-9471。
因此，本發(fā)明還涉及遺傳工程加工的可溶的融合蛋白，由EXT2或其部分和各種亞類(lèi)免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE)重鏈或輕鏈恒定區(qū)的不同部分組成。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG，特別是IgG1重鏈的恒定部分，融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)插入一個(gè)可以用血凝集因子X(jué)a裂解的裂解序列就可以簡(jiǎn)單地除去Fc部分。本發(fā)明還涉及通過(guò)基因工程方法制備這些融合蛋白的方法，以及其用于診斷和治療的用途。本發(fā)明的另一方面還涉及編碼所述融合蛋白的多核苷酸。
膜結(jié)合蛋白在形成融合蛋白時(shí)是特別有用的。所述蛋白質(zhì)的特征主要在于擁有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)區(qū)，細(xì)胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。本發(fā)明期望將一個(gè)或多個(gè)這些區(qū)域作為融合蛋白的組分。在WO94/29458和WO94/22914中可以發(fā)現(xiàn)所述融合蛋白技術(shù)的實(shí)例。
“結(jié)合分子”(或稱(chēng)為“相互作用分子”或“受體組分因子”)指與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合或與本發(fā)明多肽相互作用的分子，包括受體。這種結(jié)合分子是本發(fā)明的一部分，結(jié)合分子還可以是非天然產(chǎn)生的如與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，和抗體衍生的試劑。
正如本領(lǐng)域已知的，兩種多肽之間的“相似性”是通過(guò)將一種多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代與第二種多肽的序列進(jìn)行比較而確定的。此外，本領(lǐng)域還已知的“相同性”指兩種多肽或兩種多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，這是通過(guò)所述序列兩個(gè)鏈之間的匹配相同性而確定的。相同性和相似性都很容易計(jì)算(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BIOCOMPUTINGINFORMATICS ANDGENOME PROJECTS，Smith，D.W.ed.，academic Press，New York，1993；COMPUTER ANALYSES OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.andGriffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SEQUENCE ANALYSESIN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987；andSEQENCE ANALYSES PRIMER，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。存在許多測(cè)量?jī)煞N多核苷酸或多肽序列之間相同性和相似性的方法，術(shù)語(yǔ)“相同性”和“相似性”是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的(Carillo，H.，and Lipton，D.，SIAM J.Applied math.，1988，481073)。通常用于確定兩個(gè)序列之間相同性或相似性的方法包括，但不限于在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，SanDiego，1994，and Carillo，H.，and Lipton，D.，SIAM J.Applied Math.，1988，481073中公開(kāi)的那些。設(shè)計(jì)確定相同性的優(yōu)選方法是給出待測(cè)兩個(gè)序列之間的最大匹配。用計(jì)算機(jī)程序也編制了確定相同性和相似性的方法。確定兩個(gè)序列間相同性和相似性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic acids Research，1984，12(1)387)，BLAST，F(xiàn)ASTA(Atschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.，1990，215403)。
本發(fā)明涉及下文將詳細(xì)描述的新EXT2多肽和多核苷酸等。特別是，本發(fā)明涉及新EXT2的多肽和多核苷酸，它與EXT1有氨基酸序列同源性。本發(fā)明特別涉及具有圖1所示之核苷酸和氨基酸序列的EXT2。多核苷酸根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的多核苷酸，它編碼具有圖1推導(dǎo)的氨基酸序列的EXT2多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，如mRNA，或通過(guò)克隆得到的或通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)的或其組合方法得到的DNA形式，包括例如，cDNA和基因組DNA。所述DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱(chēng)為有意義鏈，或者，它也可以是非編碼鏈，也稱(chēng)為反義鏈。
編碼多肽的編碼序列可以與圖1所示的多核苷酸的編碼序列，SEQ ID NO1相同。它可以是有不同序列的多核苷酸，由于遺傳密碼的過(guò)多(簡(jiǎn)并性)，它還可以編碼圖1SEQ ID NO2的多肽。
編碼圖1多肽的本發(fā)明多核苷酸包括，但不限于其自身成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和其他的編碼序列；成熟多肽的編碼序列，帶有或不帶有前述的其他編碼序列并含有其他的非編碼序列。其他編碼序列的實(shí)例包括，但不限于編碼前導(dǎo)或分泌序列的序列，如前-或原或前原蛋白質(zhì)序列。其他非編碼序列的實(shí)例包括，但不限于內(nèi)含子和非編碼5′和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄，和mRNA加工中起作用的轉(zhuǎn)錄非翻譯的序列，包括例如用于mRNA與核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性的剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)。在多肽中也可以摻入能提供其他功能性的編碼序列。因此，例如，可以將所述多肽與標(biāo)記序列如有利于融合多肽純化的肽融合。在本發(fā)明該方面特定優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是六聚組氨酸肽，如在pQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的。如Gentz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1989，86821-824)中所描述的，例如，六聚組氨酸有利于融合蛋白的純化。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是HA標(biāo)記。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于流感病毒血細(xì)胞凝集素衍生的表位，例如，已經(jīng)由Wilson等人(Cell，1984，37767)作了描述。許多其他的所述標(biāo)記可以從商業(yè)途徑獲得。
根據(jù)前述，本文所用的術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括多核苷酸，根據(jù)遺傳密碼過(guò)多，包括編碼本發(fā)明多肽的任何序列，特別是含有圖1，SEQ ID NO2所列氨基酸序列的EXT2。該術(shù)語(yǔ)還包括多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼多肽(例如，由內(nèi)含子間斷的)的一個(gè)連續(xù)區(qū)或不連續(xù)區(qū)以及其他區(qū)域，也可含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明還涉及本文上述多核苷酸的變異體，它編碼具有圖1推導(dǎo)的氨基酸序列之多肽的片段，類(lèi)似物和衍生物。所述多核苷酸的變異體可以是天然產(chǎn)生的變異體例如，天然產(chǎn)生的等位基因變異體，或者它可以不是天然產(chǎn)生的變異體。所述多核苷酸的非天然產(chǎn)生的變異體可以通過(guò)誘變技術(shù)包括用于多核苷酸，細(xì)胞或生物體的那些來(lái)制備。
從這點(diǎn)看，變異體是通過(guò)核苷酸取代，缺失或增加而不同于上述多核苷酸的變異體。取代，缺失或增加可涉及一個(gè)或多個(gè)核苷酸?？梢栽诰幋a或非編碼區(qū)或這兩個(gè)區(qū)中改變所述變異體。在編碼區(qū)中的改變可以產(chǎn)生保守的或非保守氨基酸取代，缺失或增加。
從這點(diǎn)看，本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼具有圖1所列EXT2氨基酸序列之多肽的多核苷酸；其變異體，類(lèi)似物，衍生物和片段，以及所述變異體，類(lèi)似物和衍生物的片段。
由此看來(lái)，特別優(yōu)選的是編碼EXT2變異體，類(lèi)似物，衍生物和片段，以及所述片段之變異體，類(lèi)似物和衍生物的多核苷酸，它們含有圖1中EXT2多肽的氨基酸序列，其中有數(shù)個(gè)，幾個(gè)5-10，1-5，1-3，2，1或沒(méi)有氨基酸殘基以任何組合取代，缺失或增加。在這些中特別優(yōu)選的是沉默取代，增加和缺失，它們不改變EXT2的特性和活性。從這點(diǎn)看，特別優(yōu)選的是保守取代。最優(yōu)選的是編碼沒(méi)有取代的具有圖1氨基酸序列之多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方案是與編碼具有圖1氨基酸序列之EXT2多肽的多核苷酸至少有96％的相同的多核苷酸，和與所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
此外，在該方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼多肽的多核苷酸，所述多肽基本上保持與圖1的cDNA所編碼之成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
本發(fā)明還涉及與本文上述序列雜交的多核苷酸。在該方面，本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下，與本文上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指只有在兩個(gè)序列之間至少96％的相同性，才會(huì)發(fā)生雜交。
對(duì)于本文另外討論的本發(fā)明的多核苷酸檢測(cè)，例如可以將上文討論的本發(fā)明多核苷酸用作cDNA和基因組DNA的雜交探針以分離編碼EXT2的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，并分離與EXT2基因有高度序列相似性的其他基因的cDNA和基因組克隆。所述探針通常含有至少15個(gè)核苷酸。優(yōu)選的，所述探針至少有30個(gè)核苷酸，而且可以至少有50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的30-50個(gè)核苷酸之間。
例如，用已知DNA序列合成寡核苷酸探針，通過(guò)篩選可以分離編碼EXT2基因的編碼區(qū)。然后用與本發(fā)明基因序列互補(bǔ)的標(biāo)記的寡核苷酸篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫(kù)以確定與探針雜交的文庫(kù)成員。
可以用本發(fā)明的多核苷酸和多肽作為研究試劑和物質(zhì)以發(fā)現(xiàn)治療和診斷人疾病的方法，如本文與多核苷酸檢測(cè)有關(guān)的部分將進(jìn)一步討論。
多核苷酸可以編碼為成熟蛋白質(zhì)加其余的氨基或羧基末端氨基酸，或成熟多肽內(nèi)氨基酸(例如當(dāng)成熟形式有一個(gè)以上多肽鏈時(shí))的多肽。所述序列可以在從前體到成熟形式的蛋白質(zhì)加工中起作用，可以有利于蛋白質(zhì)的開(kāi)放通行，可以延長(zhǎng)或縮短蛋白質(zhì)的半衰期或有利于蛋白質(zhì)檢測(cè)或生產(chǎn)的操作等。如通常在原位的情況下，通過(guò)細(xì)胞酶可以處理其他氨基酸以使之離開(kāi)成熟蛋白質(zhì)。
具有與一個(gè)或多個(gè)原序列融合之多肽的成熟形式的前體蛋白質(zhì)可以是失活形式的多肽。當(dāng)除去原序列時(shí)，所述失活的前體通常就被激活。在激活前可以除去一些或所有原序列。通常將所述前體稱(chēng)為原蛋白質(zhì)。
總之，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白質(zhì)，成熟蛋白質(zhì)加前導(dǎo)序列(可將其稱(chēng)為前蛋白質(zhì))，具有一個(gè)或多個(gè)不是前蛋白質(zhì)前導(dǎo)序列之原序列的成熟蛋白質(zhì)的前體，或前原蛋白質(zhì)(是原蛋白質(zhì)的前體)，它含有前導(dǎo)序列和一個(gè)或多個(gè)原序列，通常在產(chǎn)生活性和成熟形式多肽的加工步驟中將其除去。多肽本發(fā)明還涉及具有圖1，SEQ ID NO2推導(dǎo)的氨基酸序列的EXT2多肽。
本發(fā)明還涉及這些多肽的片段，類(lèi)似物和衍生物。當(dāng)稱(chēng)圖1多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”，“衍生物”和“類(lèi)似物”，指基本上保留了與所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性，即作為EXT2行使功能的多肽，或甚至所述多肽不發(fā)揮EXT2多肽之功能時(shí)，保留與任何受體或結(jié)合分子結(jié)合的能力。因此，例如類(lèi)似物包括通過(guò)裂解原蛋白質(zhì)部分從而被激活以產(chǎn)生有活性的成熟多肽的原蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽。在特定優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是重組多肽。
圖1多肽的片段，衍生物或類(lèi)似物可以是(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基由保守的或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)取代的一種，而且所述取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼所編碼的；(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基的一種；(iii)其中成熟多肽與另一種化合物，如提高成熟多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)融合的一種或(iV)其中其他氨基酸與成熟多肽融合的一種，如用于純化成熟多肽或原蛋白質(zhì)序列的前導(dǎo)或分泌序列。從本文的教導(dǎo)中，認(rèn)為所述片段，衍生物和類(lèi)似物在本領(lǐng)域熟知的范圍內(nèi)。
從這點(diǎn)看，本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是具有圖1 SEQ ID NO2所列EXT2氨基酸序列的多肽，其變異體，類(lèi)似物，衍生物和片段，以及所述片段的變異體，類(lèi)似物和衍生物。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案還是具有EXT2氨基酸序列的多肽，其變異體，類(lèi)似物，衍生物和片段，以及保留了該多肽活性/功能的所述片段的變異體，類(lèi)似物和衍生物。
優(yōu)選的變異體是通過(guò)保守氨基酸取代而不同于參考的那些。所述取代是用另一類(lèi)似特征的氨基酸取代多肽中一給定氨基酸的那些。在保守取代中通常所見(jiàn)到的是脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile之間的相互取代；羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基基Lys和Arg的交換，以及芳族殘基Phe和Tyr之間的取代。
就這點(diǎn)而言，特別優(yōu)選的是具有圖1EXT2氨基酸序列的變異體，類(lèi)似物，衍生物和片段，以及所述片段的變異體，類(lèi)似物和衍生物，其中有數(shù)個(gè)，幾個(gè)，5-10，1-5，13，2，1或沒(méi)有氨基酸取代，缺失或增加，或其中的任何組合。其中特別優(yōu)選的是不會(huì)改變所述多肽特性和活性的沉默取代，增加和缺失。就這點(diǎn)而言，特別優(yōu)選的是保守取代。最優(yōu)選的是具有圖1，SEQ ID NO2之氨基酸序列，沒(méi)有取代的多肽。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選的以分離的形式提供，而且優(yōu)選純化至均一。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQID NO2的多肽至少有96％相似性(更優(yōu)選至少96％相同性)的多肽。
也可以用本發(fā)明多肽的片段或部分通過(guò)肽合成方法生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此可以用片段作為中間產(chǎn)物生產(chǎn)全長(zhǎng)多肽。可以用本發(fā)明多核苷酸的片段或部分合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。片段可以是“游離狀態(tài)的”，即不是其他氨基酸或多肽的部分，或與其他氨基酸或多肽融合，或它們被包含在較大多肽中，形成一部分或區(qū)。當(dāng)在較大多肽內(nèi)時(shí)，目前所討論的片段最優(yōu)選形成一個(gè)單獨(dú)的連續(xù)區(qū)域。但是可以數(shù)個(gè)片段包含在一個(gè)較大的多肽中。例如，特定優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明EXT2多肽的片段，包含在用于在宿主中表達(dá)的前期多肽中，而且含有與EXT2氨基末端融合的異源前-和原-多肽區(qū)以及與所述片段羧基末端融合的其他區(qū)域。因此，在本文欲指意義的一方面，片段指的是衍生自EXT2的融合多肽或融合蛋白部分。
應(yīng)理解本發(fā)明另外還涉及編碼上述片段的多核苷酸，與編碼所述片段之多核苷酸雜交的多核苷酸，尤其是那些在嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸，以及用于擴(kuò)增編碼所述片段之多核苷酸的多核苷酸，例如，PCR引物。在這點(diǎn)上，優(yōu)選的多核苷酸是對(duì)應(yīng)于上文討論的優(yōu)選片段的那些多核苷酸。載體，宿主細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體，用本發(fā)明載體進(jìn)行基因工程處理的宿主細(xì)胞以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽。
通過(guò)基因工程操作，使宿主細(xì)胞中摻入多核苷酸并表達(dá)本發(fā)明多肽。例如，使用已知的感染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)載(transvection)和轉(zhuǎn)化技術(shù)可將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。可單獨(dú)導(dǎo)入多核苷酸，或與其他多核苷酸一起導(dǎo)入。這種其他的多核苷酸可單獨(dú)導(dǎo)入，其導(dǎo)入或與本發(fā)明的多核苷酸聯(lián)合導(dǎo)入。
因此，例如使用標(biāo)準(zhǔn)的共轉(zhuǎn)染和在如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇的技術(shù)，可將本發(fā)明的多核苷酸與另一個(gè)編碼可選擇標(biāo)記的分離多核苷酸一起轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在這種情況下，多核苷酸一般會(huì)穩(wěn)定地?fù)饺胨拗骷?xì)胞基因組。
另外，多核苷酸也可結(jié)合到含有可選擇標(biāo)記的載體上以在宿主中增殖?？赏ㄟ^(guò)上述技術(shù)將載體構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。通常，質(zhì)粒載體以沉淀物(如磷酸鈣沉淀物)中的DNA形式或以與帶電脂質(zhì)之復(fù)合體中的DNA形式被導(dǎo)入。也可使用電穿孔法將從核苷酸導(dǎo)入宿主。如果載體是病毒，可在體外包裝或?qū)氚b細(xì)胞，經(jīng)包裝的病毒可被導(dǎo)入細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，適于制備多核苷酸并將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的多種技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的和常規(guī)的。在Sambrook等人的著作中可詳細(xì)見(jiàn)到這種技術(shù)，該著作僅僅是詳細(xì)描述這些技術(shù)的許多實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)的例證而已。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，載體可以是例如質(zhì)粒載體，單或雙鏈?zhǔn)删w載體，或單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。可通過(guò)熟知的使DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)將這種載體作為多核苷酸，優(yōu)選作為DNA導(dǎo)入細(xì)胞，對(duì)于噬菌體和病毒載體而言，可以并優(yōu)選通過(guò)熟知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)使載體作為經(jīng)包裝或衣殼化的病毒導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是有復(fù)制活性的或復(fù)制缺陷的。在后一種情況下，病毒增殖一般僅在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中發(fā)生。
在某些方面，載體中優(yōu)選的是那些可用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸和多肽的載體。通常，這種載體含有順式作用的調(diào)控區(qū)，它可有效用于在宿主中的表達(dá)，該調(diào)控區(qū)與要表達(dá)的多核苷酸可操作地相連接。通過(guò)導(dǎo)入宿主，適當(dāng)?shù)姆词阶饔靡蜃涌梢杂伤拗魈峁苫パa(bǔ)載體提供或由載體自身提供。
在某些這方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，載體提供了特異性表達(dá)。這種特異性表達(dá)可以是誘導(dǎo)的表達(dá)或僅在某種類(lèi)型的細(xì)胞中的表達(dá)或者既是誘導(dǎo)的也是細(xì)胞特異性的表達(dá)。在誘導(dǎo)的載體中，特別優(yōu)選的是通過(guò)易于操縱的環(huán)境因素如溫度和營(yíng)養(yǎng)添加劑的誘導(dǎo)可表達(dá)蛋白質(zhì)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并常規(guī)使用多種適于本發(fā)明這一方面的載體，包括用于原核和直核宿主的組成型和可誘導(dǎo)型表達(dá)載體。
可在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)基因工程處理的宿主細(xì)胞，所述培養(yǎng)基或可經(jīng)過(guò)修飾以特別適于激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增基因。目前經(jīng)選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所用的培養(yǎng)條件如溫度，pH等等一般適于表達(dá)本發(fā)明的多肽，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
可使用多種表達(dá)載體表達(dá)本發(fā)明多肽。這種載體包括衍生自染色體，附加體和病毒的載體，例如，衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件，如桿狀病毒，乳多空病毒、SV40，痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、豬α皰疹病毒1型和逆轉(zhuǎn)錄病毒之病毒的載體，及衍生自它們之組合的載體，如衍生自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件粘粒和噬菌粒的載體。通常，在這一方面，任何適于在宿主中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸以產(chǎn)生多肽的載體都可用于表達(dá)。
可通過(guò)多種已知的常規(guī)技術(shù)中的任一種將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入載體。一般通過(guò)用一種或多種限制性?xún)?nèi)切粒酸酶裂解DNA序列和表達(dá)載體，再使用T4 DNA連接酶將限制性片段連接在一起即可使用于表達(dá)的DNA序列與表達(dá)載體相連接。用于此目的的限制和連接方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的和常規(guī)的。Sambrook等人的著作中詳細(xì)描述了在此方面的適當(dāng)方法，以及使用其他技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的適當(dāng)方法，這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的的和常規(guī)的。
表達(dá)載體中的DNA序列與包括例如指導(dǎo)mDNA轉(zhuǎn)錄之啟動(dòng)子的適當(dāng)表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。這種啟動(dòng)子的代表包括噬菌體入PL啟動(dòng)子，大腸桿菌Lac，trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，它們僅是列舉出的幾個(gè)熟知的啟動(dòng)子。應(yīng)理解對(duì)本發(fā)明此方面有用的大量其他啟動(dòng)子是已知的，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以本文討論和實(shí)施例部分中闡明的方式常規(guī)地使用它們。
通常，表達(dá)構(gòu)建體可含有轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有供翻譯用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可包括位于開(kāi)始部分的翻譯起始AUG和適當(dāng)定位于待翻譯多肽末端的終止密碼子。
另外，構(gòu)建體也可含有調(diào)節(jié)以及產(chǎn)生表達(dá)的調(diào)控區(qū)。通常，根據(jù)許多一般操作的方法，這一區(qū)域通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄來(lái)起作用、例子包括阻遏物結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子及其他。
用于增殖和表達(dá)的載體一般包括選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記基因，提供了表型性狀以選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，優(yōu)選的標(biāo)記包括但不限于用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性基因以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其他細(xì)菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。這種標(biāo)記也適于擴(kuò)增。另外，載體也可含有用于此目的的其他標(biāo)記。
使用適于表達(dá)本文所需多肽的多種已知技術(shù)可將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗?，所述載體含有本文所述的選定多核苷酸序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和其他適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列。適當(dāng)宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸菌，鏈霉菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2和草地夜蛾sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。多種表達(dá)構(gòu)建體的宿主是已知的，本發(fā)明的公開(kāi)可使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)選擇用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明此方面多肽的宿主。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明還包括如表達(dá)構(gòu)建體的重組構(gòu)建體，它含有一個(gè)或多個(gè)上述序列。此構(gòu)建體含有載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中已插入了本發(fā)明的序列。此序列可以正方向或反方向插入。在此方面某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)建體進(jìn)一步包含調(diào)控序列，包括例如與此序列可操作連接的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子，有很多市售載體適用于本發(fā)明。
例如可提供下列市售載體，優(yōu)選用于細(xì)菌的載體是得自Qiagen的PQE70，PQE60和PQE-9；得自Stratagene的PBS載體，Phagescipt載體，Bluescript載體，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；以及得自Pharmacia的ptrc 99a，pKK 223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優(yōu)選的真核載體是得自Stratagene的PWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和PSG；和得自Pharmacia的pSVK3，pBPV，pMSGT和pSVL。這些載體僅通過(guò)闡明多種商業(yè)可用已知載體的方式被列出，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將這些載體用于本發(fā)明。應(yīng)理解本發(fā)明在此方面可使用適于例如在宿主中導(dǎo)入、維持、增殖或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸或多肽的任何其他質(zhì)?；蜉d體。
可使用含有缺乏啟動(dòng)子區(qū)域之報(bào)道轉(zhuǎn)錄單元的載體從任何所需基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)域，所述單元例如位于導(dǎo)入候選啟動(dòng)子片段，即含有啟動(dòng)子三片段的限制性位點(diǎn)下游的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)轉(zhuǎn)錄單元。已知在CAT基因上游的限制性位點(diǎn)處將含有啟動(dòng)子的片段導(dǎo)入載體可導(dǎo)致CAT活性的產(chǎn)生，此活性可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的CAT檢測(cè)法檢測(cè)。適于此目的的載體是已知的并易于使用。這種載體的兩個(gè)例子包括pKK232-8和pCM7。因此，用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的啟動(dòng)子不僅包括已知的和易于使用的啟動(dòng)子，也包括通過(guò)使用報(bào)道基因的上述技術(shù)易于得到的啟動(dòng)子。
適于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸和多肽的已知細(xì)菌啟動(dòng)子是E.Coli Lac I和Lac Z啟動(dòng)子，T3和T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，λPR，PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子。
適于此方面的已知真核啟動(dòng)子是CMV立即早期啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，早期和晚期SV40啟動(dòng)子，如勞氏肉瘤病毒(“RSV”)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR啟動(dòng)子以及如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。
選擇適當(dāng)載體和啟動(dòng)子以在宿主細(xì)胞中表達(dá)是已知的方法，用于構(gòu)建表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入宿主并在宿主中表達(dá)的必需技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)技術(shù)。
本發(fā)明還涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。
構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞受磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他方法的影向。許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)中都描述了這類(lèi)方法。
可以常規(guī)方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體從而產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另外，也可通過(guò)常規(guī)的肽合成儀合成產(chǎn)生本發(fā)明多肽。
可在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制之下，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母菌、細(xì)菌或其也細(xì)胞中表達(dá)成熟的蛋白質(zhì)。使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)使用了衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA。Sambrook等人描述了原核和真核宿主使用的適當(dāng)克隆和表達(dá)載體。
一般而言，重組表達(dá)載體可包括復(fù)制起點(diǎn)，衍生自指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄之高表達(dá)基因的啟動(dòng)子和暴露于載體之后允許分離含有載體之細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子衍生自編碼如3-磷酸甘油酸激酶(“PGK”)的糖酵解酶，a-因子，酸性磷酸酶和熱體克蛋白等的基因。選擇性標(biāo)記包括E.coli的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的trp1基因。
通過(guò)在載體中插入增強(qiáng)了序列可增強(qiáng)高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明多肽之DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約為10至300bp，它在給定的宿主細(xì)胞類(lèi)型中起到增加啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用。增強(qiáng)子的例子包括SV40增強(qiáng)子，它位于bp100至270處之復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)，還包括細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。
通常，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼本發(fā)明多肽之異源結(jié)構(gòu)序列的本發(fā)明多核苷酸插入載體中以使它與啟動(dòng)子可操作地連接以供表達(dá)。將多核苷酸放在適當(dāng)?shù)奈恢靡允罐D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)大致位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的5’端，核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于AUG的5’方向。所述AUG可啟動(dòng)欲表達(dá)之多肽的翻譯。通常，沒(méi)有以起始密碼子(常為AUG)開(kāi)始，并位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之間的其他開(kāi)放閱讀框。而且多肽末端常具有翻譯終止密碼子，在轉(zhuǎn)錄區(qū)的3’末端大致分布有多聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
可在經(jīng)表達(dá)的多肽中摻入適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)以將經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，壁膜間隙或細(xì)胞外環(huán)境。此信號(hào)可與多肽內(nèi)源或異源。
此多肽可以修飾的形式(如融合蛋白)被表達(dá)，它不僅包括分泌信號(hào)還包括另外的異源功能性區(qū)域。因此，例如可在多肽的N-末端加上附加的氨基酸區(qū)域，尤其是帶電荷的氨基酸以在純化或隨后的處理和貯存過(guò)程中改善它在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持續(xù)性。也可以在多肽中增加一個(gè)區(qū)域以便于純化。在最終制備多肽之前可除去這一區(qū)域。在多肽中加入肽部分以引起分泌或外泌，改善穩(wěn)定性和便于純化等等都是本領(lǐng)域中熟知和常規(guī)技術(shù)。
用于增殖，維持或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸和多肽的適當(dāng)原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌。假單胞菌，鏈霉菌，和葡萄球菌的許多種也是適當(dāng)?shù)乃拗?。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其他宿主也可用于本發(fā)明。
作為一個(gè)代表性而非限制性的例子，供細(xì)菌使用的有用表達(dá)載體可含有衍生自市售質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，所述市售質(zhì)粒含有已知克隆載體pBR322(ATCC37017)的基因元件。這各商購(gòu)載體包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Pramega Biotec，Madison，WI，USA)。在這些載體中，pBR322“骨架”部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和欲表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相連接。
轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶曛螅顾拗骶晟L(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。當(dāng)選定的啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型時(shí)，可通過(guò)適當(dāng)方法(例溫度變化或暴露于化學(xué)誘導(dǎo)劑)誘導(dǎo)啟動(dòng)子并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。典型地再通過(guò)離心收集細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保留最終得到的粗提取作進(jìn)一步純化。
可通過(guò)任何便利的方法破碎表達(dá)蛋白質(zhì)所用的微生物細(xì)胞，包括反復(fù)凍融，超聲處理，機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些方法。
多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)也可用于表達(dá)，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括C127，3T3，CHO，HeLa，人腎293和BHK細(xì)胞系以及猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系，它們描述于Gluzman et al.，Cell，1981，23175。
哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可含有復(fù)制起點(diǎn)，適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子，和任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列以及表達(dá)所必需的5’側(cè)翼的非轉(zhuǎn)錄序列。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，將衍生自SV40剪接位點(diǎn)和SV40多聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列用于必需的非轉(zhuǎn)錄基因元件。
可通過(guò)已知方法從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化EXT2多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選使用高效液相層析(“HPLC”)純化。當(dāng)多肽在分離和或純化過(guò)程中變性可使用已知的再折疊蛋白質(zhì)技術(shù)以重新產(chǎn)生活性構(gòu)型。
本發(fā)明多肽包括天然純化的多肽，通過(guò)化學(xué)合成方法產(chǎn)生的多肽以及通過(guò)重組技術(shù)由包括例如細(xì)菌、酵母菌，高等植物，昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原核或真核宿主產(chǎn)生的多肽。依據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用的宿主，本發(fā)明多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，在某些情況下作為宿主介導(dǎo)過(guò)程的結(jié)果。本發(fā)明多肽也包括起始的經(jīng)修飾甲硫氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，EXT2多核苷酸和多肽可用于多種應(yīng)用，尤其是那些利用此酶化學(xué)和生物特性的應(yīng)用。其他的應(yīng)用涉及細(xì)胞、組織和生物體疾病的診斷和治療。下列討論中將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的這些方面。多核苷酸測(cè)定本發(fā)明還涉及使用EXT2多核苷酸以檢測(cè)互補(bǔ)的多核苷酸，從而用作例如診斷試劑。與機(jī)能障礙相關(guān)的EXT2突變型的檢測(cè)可提供一種診斷工具，此工具可增加或限定對(duì)疾病的診斷或?qū)膊〉囊赘行?，所述疾病是由EXT2的過(guò)少表達(dá)，過(guò)多表達(dá)或經(jīng)改變的表達(dá)引起的。通過(guò)多種技術(shù)可在DNA水平上檢測(cè)到攜有EXT2基因突變的個(gè)體。診斷用的核酸可得自病人的細(xì)胞，如血液，尿液，唾液、組織活檢或尸檢材料?？芍苯訉⒒蚪MDNA用于檢測(cè)，或者也可在分析前通過(guò)使用PCR來(lái)酶促擴(kuò)增基因組DNA。PCR(Saikiet al.，Nature，1986，324163-166)。也可以類(lèi)似方式使用RNA或cDNA。作為例子，可使用與編碼EXT2之核酸互補(bǔ)的PCR引物來(lái)鑒定和分析EXT2的表達(dá)和突變。例如，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物與正?；蛐捅容^后從大小的變化可檢測(cè)缺失和插入。通過(guò)使擴(kuò)增的DNA與經(jīng)過(guò)放射性標(biāo)記的EXT2 RNA或經(jīng)放射性標(biāo)記的EXT2反義DNA序列雜交可鑒定點(diǎn)突變。通過(guò)RNase A消化或解鏈溫度的差異可區(qū)分精確匹配的序列和不匹配的雙螺旋。
通過(guò)直接的DNA測(cè)序也可揭示出參考基因和具有突變之基因之間的序列差異。另外，也可使用克隆的DNA片段作為探針以檢測(cè)特殊的DNA片段。通過(guò)適當(dāng)使用PCR或其他擴(kuò)增方法可大大增強(qiáng)這種方法的敏感性。例如，由經(jīng)修飾的PCR產(chǎn)生的雙鏈PCR產(chǎn)物或單鏈模板分子使用了測(cè)序引物。通過(guò)帶有放射性標(biāo)記核苷酸的常規(guī)方法或通過(guò)帶有熒光標(biāo)記物的自動(dòng)測(cè)序方法可進(jìn)行序列測(cè)定。
通過(guò)用或不用變性劑，檢測(cè)凝膠中DNA片段電泳泳動(dòng)率的變化可達(dá)到基于DNA序列差異的基因測(cè)定。通過(guò)高分辨的凝膠電泳，肉眼即可觀(guān)察到小的序列缺失和插入。在變性的甲酰胺梯度凝膠上可區(qū)分序列不同的DNA片段，在此凝膠中，不同DNA片段根據(jù)其特異的解鏈或部分解鏈溫度，其泳動(dòng)被阻滯在凝膠中的不同位置(例見(jiàn)Myers et al.，Science，1985，2301242)。
通過(guò)核酸酶保護(hù)測(cè)定法，如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)裂解法也可揭示出特異位置處的序列變化(例Cotton et al.，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1985，854397-4401)。
因此，通過(guò)例如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)裂解，直接DNA測(cè)序或使用限制性酶(如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(“RFLP”)和基因組DNA的Southern印跡的方法可檢測(cè)特殊的DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了診斷或確定遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)之易感性的方法。EXT2基因的突變或能是對(duì)遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)之易感性的象征；在確定這種易感性的試驗(yàn)中可使用上述核酸序列。因此，例如可通過(guò)試驗(yàn)確定本文所述的EXT2基因中的突變，如取代，缺失，截短，插入、移碼等，這種突變是遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)之易感性的象征。
本發(fā)明提供了診斷疾病的方法，具體地說(shuō)，提供了診斷遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)的方法；包括測(cè)定患者樣品中具有圖1，SEQID NO1之序列的多核酸非正常減少或增加的表達(dá)水平。使用本領(lǐng)域熟知的任何定量多核苷酸的方法，如PCR，RT-PCR，PNase保護(hù)，Northern印跡和其他雜交法都可測(cè)量多核苷酸表達(dá)的減少或增加。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序外，原位分析也可檢測(cè)到突變。多肽的測(cè)定本發(fā)明還涉及檢測(cè)細(xì)胞組織中EXT2蛋白質(zhì)水平的診斷試驗(yàn)。這種試驗(yàn)可以是定量或定性的，因此，例如，可使用根據(jù)本發(fā)明用于檢EXT2蛋白之過(guò)少表達(dá)(與正常的對(duì)照組織樣品相比)的診斷試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)遣傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于測(cè)定宿主樣品中蛋白質(zhì)(如本發(fā)明的EXT2蛋白)水平的測(cè)定技術(shù)，這種測(cè)定方法包括放射性免疫測(cè)定，競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，Western印跡分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，其中常優(yōu)選ELISA。ELISA試驗(yàn)首先包括制備EXT2特異性抗體，優(yōu)選為單隆抗體。此外正常需制備與單克隆抗體結(jié)合的報(bào)道抗體。報(bào)道抗體與可檢測(cè)的試劑結(jié)合，如放射性、熒光或酶試劑、如辣根過(guò)氧化物酶)。
為了進(jìn)行ELISA，可從宿主中取出樣品，并在可束縛樣品中蛋白質(zhì)的固體支撐物，如聚苯乙烯平皿中保溫。然后通過(guò)與非特異性蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白一起保溫即可封閉平皿上任何空余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在平皿中保溫單克隆抗體，其時(shí)單克隆抗體與結(jié)合劑聚苯乙烯平皿上的任何EXT2蛋白結(jié)合，用緩沖液洗去未結(jié)合的單克隆抗體。在平皿中加入與辣根過(guò)氧化物酶相聯(lián)的報(bào)道抗體，可使報(bào)道抗體與結(jié)合劑EXT2蛋白上的任何單克隆抗體結(jié)合，然后洗去未結(jié)合的報(bào)道抗體，在平皿中加入過(guò)氧化物酶活性試劑，包括比色底物。通過(guò)一級(jí)和二級(jí)抗體與EXT2相連的固定化過(guò)氧化物酶產(chǎn)生了有色反應(yīng)產(chǎn)物。在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)色的量表示樣品中所存在EXT2蛋白的量，典型地，通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得到定量的結(jié)果。
也可使用競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，其中固體支持物結(jié)合的EXT2特異性抗體與經(jīng)標(biāo)記的EXT2和宿主的樣品從固體支持物上通過(guò)。檢測(cè)到的與固體支撐物結(jié)合之標(biāo)記物的量與樣品中EXT2的量相關(guān)?？贵w也可以將多肽，其片段或其他衍生物或其類(lèi)似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞用作免疫原以產(chǎn)生其抗體。例如，這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合、單鏈和人源化抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。也可使用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)這種抗體和片段。
通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法可得到抗對(duì)應(yīng)于本發(fā)明序列之多肽而產(chǎn)生的抗體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將多肽直接注射給動(dòng)物，優(yōu)選注射給非人類(lèi)動(dòng)物。再將如此得到的抗體與多肽自身結(jié)合。在此實(shí)施方案中，甚至也可使用僅編碼多肽片段的序列以產(chǎn)生與整個(gè)天然多肽結(jié)合的抗體。可使用這種抗體從表達(dá)所述多肽的組織中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，可使用能提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.，Nature，1975256495-497)，trioma技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozboret al.，Immunology Today，1983，472)和EBv-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，MONOCLONAL ANTIBOOIES AND CANCER THERAPY，pg，77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
經(jīng)描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,946,778)也適于產(chǎn)生本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠，或包括其他哺乳動(dòng)物的其他生物來(lái)表達(dá)本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
通過(guò)將抗體與固體支持物結(jié)合以通過(guò)親和層析分離和/或純化，即可使用上述抗體分離或鑒定表達(dá)多肽的克隆或純化本發(fā)明多肽。
可使用抗EXT2的抗體來(lái)抑制遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥，如軟骨肉瘤及其他。EXT2結(jié)合分子和測(cè)定也可使用EXT2以分離與其相互作用的蛋白質(zhì)；這種相互作用可能是干擾的靶子。EXT2和其他因子之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑會(huì)導(dǎo)致能調(diào)節(jié)EXT2活性的藥劑的產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明也提供了鑒定EXT2之結(jié)合分子的方法。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法如配體淘選和FACS分類(lèi)法即可鑒定編碼EXT2結(jié)合分子之蛋白質(zhì)的基因。這種方法描述于多種實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中，如Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第5章，1991。
例如，酵母雙雜合體系統(tǒng)使用轉(zhuǎn)錄激活劑活性的重建可提供體內(nèi)檢測(cè)第一種試驗(yàn)蛋白質(zhì)和第二種試驗(yàn)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。美國(guó)專(zhuān)利5,283,173中公開(kāi)了此方法；可使用Clontech和Stratagene的試劑。簡(jiǎn)而言之，使EXT2 cDNA與Gal4轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合區(qū)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。將得自感興趣細(xì)胞的cDNA文庫(kù)成員與Gal4的反式激活區(qū)融合，表達(dá)能與EXT2相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA克隆會(huì)導(dǎo)致Gal4活性的重建和如Gal4-lacZ的報(bào)道基因表達(dá)的反式激活作用。
另一種方法涉及用重組EXT2篩選λgt11 λZAP(Stratagene)或等價(jià)的cDNA表達(dá)文庫(kù)。重組的EXT2蛋白或其片段與如FLAG、HSV或GST的小肽標(biāo)記物融合。所述肽標(biāo)記物具有便利的激酶(如心肌肌酸激酶)磷酸化位點(diǎn)或者它們可被生物來(lái)?；Ｖ亟MEXT2可被32[P]磷酸化，也可以未經(jīng)標(biāo)記的形式使用之，用鏈霉親和素或抗此標(biāo)記物的抗體可檢測(cè)之。從感光趣的細(xì)胞中制得λgt11 cDNA表達(dá)文庫(kù)，并與重組EXT2一起保溫，洗滌并分離與EXT相互作用的cDNA克隆。此方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的方法，例見(jiàn)Sambrook et al。
另一種方法是篩選哺乳動(dòng)物表達(dá)文庫(kù)，在此方法中，在載體的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)之間克隆cDNA并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS或293細(xì)胞中。48小時(shí)后，通過(guò)將固定的和經(jīng)洗滌的細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的EXT2一起保溫可檢測(cè)結(jié)合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EXT2被碘化，通過(guò)放射自顯影術(shù)可檢測(cè)任何結(jié)合的EXT2，例見(jiàn)Sims et al.，Science，1988，241585-589和McMahan et al.，EMBO J.，1991，102821-2832。以這種方式，可選擇含有編碼感光趣之結(jié)合蛋白的cDNA庫(kù)，通過(guò)進(jìn)一步次分每個(gè)庫(kù)，接著進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、結(jié)合和放射自顯影的循環(huán)可分離感興趣的cDNA。另外，通過(guò)將完整的cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并在含有與平板結(jié)合之EXT2的平皿中淘選細(xì)胞可分離感興趣的cDNA。裂解洗滌后仍附著的細(xì)胞，分離質(zhì)粒DNA，在細(xì)菌中擴(kuò)增，重復(fù)轉(zhuǎn)染和淘選的循環(huán)直至得到單個(gè)cDNA克隆。見(jiàn)Seed et al，Proc，Natl.Acad. Sci，USA1987，843365和Aruffo et al.，EMBO J.，1987，63313。如果結(jié)合蛋白是可分泌的，則一旦建立了結(jié)合或中和試驗(yàn)以測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液即可通過(guò)類(lèi)似的建庫(kù)策略得到其cDNA。Wong et al.，Science，1985，228810-815中公開(kāi)了篩選上清液的一般方法。
另一種方法涉及直接從細(xì)胞中分離與EXT2相互作用的蛋白質(zhì)。制備EXT2與GST或小的肽標(biāo)記物的融合蛋白并固定在小珠上。制備得自感興趣細(xì)胞的生物合成標(biāo)記或未標(biāo)記的蛋白質(zhì)提取物，與小珠一起保溫并用緩沖液洗滌。從小珠上特異性地洗脫與EXT2相互作用的蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE分析之。通過(guò)微量測(cè)序得到結(jié)合對(duì)象的一級(jí)氨基酸序列數(shù)據(jù)。任選地，可用能誘導(dǎo)功能性反應(yīng)(如細(xì)胞蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化)的試劑處理細(xì)胞。這種試劑的例子可以是生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2。
另一種方法是免疫親和純化。將重組EXT2與標(biāo)記或未標(biāo)記的細(xì)胞提取物上起保溫，并用抗人抗體免疫沉淀。用蛋白質(zhì)A-Sepharose回收免疫沉淀物并通過(guò)SDS-PAGE分析。通過(guò)生物來(lái)?；饔脴?biāo)記未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并在含鏈霉親和來(lái)的SDS凝膠上檢測(cè)。通過(guò)微量測(cè)序分析結(jié)合對(duì)象蛋白質(zhì)。另外，在微量測(cè)序前可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)生化純化步驟。
另一種方法涉及篩選結(jié)合對(duì)象的肽文庫(kù)。使用重組的經(jīng)標(biāo)記的EXT2從與EXT2相互作用的肽或磷酸肽文庫(kù)中選擇肽。測(cè)定肽的序列可鑒定出在相互作用的蛋白質(zhì)中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)的共有肽序列。激動(dòng)劑和拮抗劑-測(cè)定和分子在篩選可激活此多肽(激動(dòng)劑)或抑制此多肽激活(拮抗劑)的化合物的方法中，可使用本發(fā)明的EXT2。
例如，可以表達(dá)與EXT2結(jié)合的分子(如受EXT2調(diào)節(jié)的信號(hào)或調(diào)節(jié)途徑分子)的細(xì)胞中制備細(xì)胞區(qū)室，如膜或其制品(如膜制品)。在可能是EXT2激動(dòng)劑或拮抗劑的候選分子缺乏或存在的情況下，將制品與經(jīng)標(biāo)記的EXT2一起保溫。經(jīng)標(biāo)記的配體結(jié)合的減少可反映出候選分子與結(jié)合分子結(jié)合的能力。無(wú)償結(jié)合的分子，即會(huì)不誘導(dǎo)EXT2對(duì)EXT2結(jié)合分子結(jié)合作用的分子可能是最好的拮抗劑。結(jié)合良好并產(chǎn)生與EXT2相同或密切相關(guān)之作用的分子是激動(dòng)劑。
例如，通過(guò)測(cè)定候選分子與細(xì)胞或適當(dāng)?shù)募?xì)胞制品相互作用之后第二信使系統(tǒng)的活性，將其作用效果與EXT2的或能產(chǎn)生與EXT2相同之作用的分子的作用效果相比較，可測(cè)定潛在的激動(dòng)劑和拮抗劑的EXT2一樣作用。在此方面有用的第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌醇水解第二信使系統(tǒng)。
EXT2拮抗劑測(cè)定法的另一個(gè)例子是競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，即在適當(dāng)?shù)母?jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)的條件下，使EXT2和潛在的拮抗劑與膜結(jié)合的EXT2受體分子或重組的EXT2受體分子結(jié)合。EXT2可被如放射性標(biāo)記以使與受體分子結(jié)合的EXT2分子數(shù)目能被精確測(cè)定從而是估計(jì)出潛在拮抗劑的效力。
潛在拮抗劑的例子包括抗體，或在某些情況下還包括能與多肽結(jié)合但不會(huì)產(chǎn)生可抑制多肽活性之第二信使反應(yīng)的寡核苷酸。
潛在的拮抗劑也包括已喪失酶活性的與EXT2密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，即多肽片段。
潛在的拮抗劑也包括通過(guò)使用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。使用反義技術(shù)可通過(guò)三股螺旋的形成或反義DNA或RNA來(lái)控制基因的表達(dá)，兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，可使用編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分來(lái)設(shè)計(jì)一個(gè)長(zhǎng)度約為10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。經(jīng)設(shè)計(jì)DNA寡核苷酸與涉及轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)互補(bǔ)(三股螺旋，見(jiàn)Lee et al.，Nucl.Acids Res.，1979，63073；Cooneyet al.，Science，1988，241456；and Dervan et al.，Science，1991，2511360)，從而可防止EXT2的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交，并阻斷了mRNA分子翻譯成酶(反義-見(jiàn)Okano，J.Neurochem.，((1991)56560；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。上述寡核苷酸也可被傳遞到細(xì)胞中以使反義RNA或DNA在體內(nèi)表達(dá)從而抑制EXT2的產(chǎn)生。
另一種潛在的拮抗劑是小分子，它與多肽結(jié)合，使得它不能與結(jié)合分子接近從而抑制了正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小肽或肽樣分子。
潛在的拮抗劑也包括EXT2的可溶性形式，例如多肽片段，它與結(jié)合分子結(jié)合，從而防止結(jié)合分子與膜結(jié)合的EXT2相互作用。
在哺乳動(dòng)物宿主中，EXT2無(wú)處不在，它對(duì)包括多種病理的各種生物學(xué)功能起作用。因此，希望能發(fā)現(xiàn)一方面可刺激酶活性，另一方面，可抑制EXT2功能的化合物和藥物。
可將EXT2拮抗劑用于此類(lèi)遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)的多種治療和預(yù)防目的。
本發(fā)明還提供了治療與EXT2活性過(guò)量相關(guān)之非正常狀況的方法，包括給受試者施用有效量的上述抑制劑化合物(拮抗劑)以及藥用可接受的載體以抑制酶的激活，或通過(guò)抑制第二信號(hào)從而減輕非正常狀況。
通常，可將EXT2激動(dòng)劑用于治療和預(yù)防遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)的目的。
本發(fā)明還涉及治療與EXT2及其活性過(guò)少表達(dá)相關(guān)之非正常狀況的方法，包括給受試者施用治療有效量的可激活多肽的化合物(激動(dòng)劑)，從而減輕遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥(如軟骨肉瘤等)的非正常狀況。組合物和試劑盒可將可溶性形式的EXT2以及可激活或抑制此酶的化合物與適當(dāng)?shù)乃幱幂d體聯(lián)合使用。這種組合物含有治療有效量的多肽或化合物，以及藥物可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水，甘油，乙醇及它們的組合。配方應(yīng)適合施用的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)進(jìn)行根據(jù)施用方式選擇適當(dāng)載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物成套試劑或試劑盒，該試劑盒含有一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器充滿(mǎn)一種或多種上述本發(fā)明組合物成分。施用可單獨(dú)或與其他化合物(如治療化合物)一起使用本發(fā)明多肽和其他化合物。
可以任何有效、便利的方式施用藥物組合物，包括例如通過(guò)局部、口服、肛門(mén)，陰道，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑等施藥。
通常以有效治療或預(yù)防特異性癥狀的量施用藥物組合物。一般以至少約10μg/kg體重的量施用組合物。大多數(shù)情況下以不超過(guò)每天的8mg/kg體重的量施用組合物，大多數(shù)情況下優(yōu)選的施藥劑量是每天約10μg/kg至約1mg/kg體重。應(yīng)理解考慮到癥狀，其嚴(yán)重程度，施藥方式，復(fù)雜情況等，通過(guò)每種治療方式和療法的標(biāo)準(zhǔn)方法可確定最適的劑量?；蛑委熗ㄟ^(guò)在治療方法中表達(dá)多肽(通常指的是“基因治療”)可根據(jù)本發(fā)明使用EXT2多核苷酸，多肽，激動(dòng)劑和拮抗劑(都是多肽)。
因此，例如可用多核苷酸(如DNA或RNA)改造來(lái)自病人的細(xì)胞以編碼來(lái)自間接體內(nèi)的多肽。然后可將經(jīng)改造的細(xì)胞提供給用多肽治療的病人。在此實(shí)施方案中，通過(guò)例如使用含有編碼本發(fā)明多肽之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可在間接體內(nèi)選細(xì)胞。本領(lǐng)域已知這種方法，從本文的教導(dǎo)中可看出它們?cè)诒景l(fā)明中的應(yīng)用是顯而易見(jiàn)的。
類(lèi)似地，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)改造細(xì)胞以在體內(nèi)表達(dá)多肽。例如，可改造本發(fā)明多核苷酸以在上述的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達(dá)。然后分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體，并導(dǎo)入經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞，所述載體含有編碼本發(fā)明多肽的RNA，包裝細(xì)胞從而可產(chǎn)生含有感興趣基因的感染性病毒顆粒?？梢越o病人施用這些生產(chǎn)細(xì)胞以在體內(nèi)改造細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)多肽。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，這些和其他施用本發(fā)明多肽的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
本文上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體之來(lái)源的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，勞氏肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，Gibbon Ape白血病病毒，人免疫缺損病毒，腺病素，骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺癌病素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體衍生自Moloney鼠白血病病毒。
這種載體會(huì)包括一種或多種啟動(dòng)子以表達(dá)多肽?？梢允褂玫倪m當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRSV40啟動(dòng)子；和人肥大細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(描述于Millet et al.，Biotechniques，1989，7980-990)。也可使用如真核細(xì)胞啟動(dòng)子的細(xì)胞啟動(dòng)子，它們包括但不限于組蛋白，RNA聚合酶III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，可以使用的其他病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。鑒于本文所含的教導(dǎo)，適當(dāng)啟動(dòng)子的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列被置于適當(dāng)啟動(dòng)子的控制之下，可使用的適當(dāng)啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如肥大細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如MMT啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子白蛋白啟動(dòng)子；ApiAI啟動(dòng)子人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，如單純
病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(包括上述的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是能控制編碼多肽之基因的天然啟動(dòng)子。
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501，PA317，Y-2，Y-AM，PA12，T19-14X，VT-19-l7-H2，YCRE YCRIP，Gp+E-86，Gp+envAml 2和DAN細(xì)胞系(描述于miller，A.，Human Gene Therapy，1990，15-14)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到包裝細(xì)胞內(nèi)。這種方法包括但不限于電穿孔，脂質(zhì)體的使用和CaPO4沉淀。在一個(gè)替代方法中，將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包熏在脂質(zhì)體中或與脂質(zhì)偶聯(lián)，然后給宿主施用。
生產(chǎn)細(xì)胞系會(huì)產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，它包括編碼多肽的核酸序列。然后可使用這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞可表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞，胚胎癌細(xì)胞以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。實(shí)施例EXT2的基因治療表達(dá)通過(guò)皮膚活檢從受試者體內(nèi)得到成纖維細(xì)胞，將所得組織置入組織培養(yǎng)基中并分離成小片。在組織培養(yǎng)瓶的潮濕表面放置組織小碎片，每瓶中約放10片。將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，緊密靠近并置于室溫中過(guò)夜，在室溫下放24小時(shí)后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(組織碎片固定在瓶底)，加入新鮮培養(yǎng)基(例如Ham氏F12培養(yǎng)基，它含有10％FBS，青霉素和鏈霉素)。然后將組織在37℃下保溫約1周。此時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次。再培養(yǎng)兩周后，出現(xiàn)單層成纖維細(xì)胞，用胰蛋白酶消化單層并擴(kuò)大到大瓶規(guī)模。
用限制性酶消化用于基因治療的載體以克隆需表達(dá)的片段，用牛小腸磷酸酶處理經(jīng)消化的載體以防止自身連接。在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離去磷酸化的線(xiàn)性載體并純化之。
分離能表達(dá)活性EXT2的EXT2 cDNA，如有必要可修飾片段的末端以克隆到載體上。例如，可用DNA聚合酶處理5’突出端以產(chǎn)生鈍端。使用S1核酸酶可除去3’突出端。用T4 DNA連接酶可將接頭連接到鈍端上。
將等量的Moloney鼠白血病病毒線(xiàn)性骨架和EXT2片段相混合并使用T4 DNA連接酶連接。使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再將細(xì)菌涂布在含卡那霉束的瓊脂上，卡那霉素類(lèi)型和限制性分析可確證載體已正確地插入基因。
在含有10％牛血清(CS)，青霉素和鏈霉素的Dulbeco氏修改的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中，組織培養(yǎng)包裝細(xì)胞，使其生長(zhǎng)后鋪滿(mǎn)密度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將含有EXT2基因的載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞。從現(xiàn)在被稱(chēng)作生產(chǎn)細(xì)胞的包裝細(xì)胞中收集含有EXT2基因的感染性病毒顆粒。
在生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基，保溫適當(dāng)時(shí)間之后，從鋪滿(mǎn)生產(chǎn)細(xì)胞的平板中收集培養(yǎng)基。通過(guò)Millipore濾器過(guò)濾含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基以除去脫附的生產(chǎn)細(xì)胞。然后使用經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)基感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的匯合品平板中除去培養(yǎng)基，并快速換上經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中可包括溴化己二甲銨(Aldrich)以便于轉(zhuǎn)導(dǎo)。適當(dāng)保溫后除去培養(yǎng)基并換上新鮮培養(yǎng)基。如果病毒的滴定度高，實(shí)際上所有的成纖維細(xì)胞將被雜而不需要選擇。如果病毒的滴定度低，則有必要使用具有選擇性標(biāo)記(如neo或his)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以選擇出被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用于擴(kuò)充。
或者單獨(dú)或者在微載體珠(如cytodex 3珠)上已生長(zhǎng)而匯合后將經(jīng)改造的成纖維細(xì)胞注射到大鼠體內(nèi)。經(jīng)注射的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了EXT2產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用傳遞給宿主。
顯然，也可不以上述描述部分和實(shí)施例所具體描述的那樣實(shí)施本發(fā)明。
鑒于上文的教導(dǎo)，本發(fā)明的各種修飾和變化都是可能的，因此它們?cè)谒綑?quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人湖南醫(yī)科大學(xué)(ii)發(fā)明名稱(chēng)EXT2(iii)序列數(shù)目2(iv)通訊地址(A)地址SmithKline Beecham Corporation(B)街道709 Swedeland Road(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼19406(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)形式磁盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM Compatible(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Version 1.5(vi)本申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日(C)分類(lèi)(vii)在先申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名William T.Han(B)登記號(hào)34,344(C)參考/檔案號(hào)ATG50019(ix)電訊信息(A)電話(huà)(610)270-5219(B)電話(huà)傳真(610)270-5090(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3003個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii) 分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(v) 片段類(lèi)型(vi)原始來(lái)源(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCGCCAGCC CAGACTCGGC CCTGGCAGTG GCGGCTGGCG ATTCGGACCG ATCCGACCTG 60GGCGGAGGTG GCCCGCGCCC CGCGGCATGA GCCGGTGACC AAGCTCGGGG CCGAGCGGGA 120GGCAGCCGTG GCCGAGGAGT GTGAGGAAGA GGCTGTCTGT GTCATTATGT GTGCGTCGGT 180CAAGTATAAT ATCCGGGGTC CTGCCCTCAT CCCAAGAATG AAGACCAAGC ACCGAATCTA 240CTATATCACC CTCTTCTCCA TTGTCCTCCT GGGCCTCATT GCCACTGGCA TGTTTCAGTT 300TTGGCCCCAT TCTATCGAGT CCTCAAATGA CTGGAATGTA GAGAAGCGCA GCATCCGTGA 360TGTGCCGGTT GTTAGGCTGC CAGCCGACAG TCCCATCCCA GAGCGGGGGG ATCTCAGTTG 420CAGAATGCAC ACGTGTTTTG ATGTCTATCG CTGTGGCTTC AACCCAAAGA ACAAAATCAA 480GGTGTATATC TATGCTCTGA AAAAGTACGT GGATGACTTT GGCGTCTCTG TCAGCAACAC 540CATCTCCCGG GAGTATAATG AACTGCTCAT GGCCATCTCA GACAGTGACT ACTACACTGA 600TGACATCAAC CGGGCCTGTC TGTTTGTTCC CTCCATCGAT GTGCTTAACC AGAACACACT 660GCGCATCAAG GAGACAGCAC AAGCGATGGC CCAGCTCTCT AGGTGGGATC GAGGTACGAA 720TCACCTGTTG TTCAACATGT TGCCTGGAGG TCCCCCAGAT TATAACACAG CCCTGGATGT 780CCCCAGAGAC AGGGCCCTGT TGGCTGGTGG CGGCTTTTCT ACGTGGACTT ACCGGCAAGG 840CTACGATGTC AGCATTCCTG TCTATAGTCC ACTGTCAGCT GAGGTGGATC TTCCAGAGAA 900AGGACCAGGT CCACGGCAAT ACTTCCTCCT GTCATCTCAG GTGGGTCTCC ATCCTGAGTA 960CAGAGAGGAC CTAGAAGCCC TCCAGGTCAA ACATGGAGAG TCAGTGTTAG TACTCGATAA 1020ATGCACCAAC CTCTCAGAGG GTGTCCTTTC TGTCCGTAAG CGCTGCCACA AGCACCAGGT 1080CTTCGATTAC CCACAGGTGC TACAGGAGGC TACTTTCTGT GTGGTTCTTC GTGGAGCTCG 1140GCTGGGCCAG GCAGTATTGA GCGATGTGTT ACAAGCTGGC TGTGTCCCGG TTGTCATTGC 1200AGACTCCTAT ATTTTGCCTT TCTCTGAAGT TCTTGACTGG AAGAGAGCAT CTGTGGTTGT 1260ACCAGAAGAA AAGATGTCAG ATGTGTACAG TATTTTGCAG AGCATCCCCC AAAGACAGAT 1320TGAAGAAATG CAGAGACAGC TCTTCATGGA ACCAGTCAGG AGAGAGAACT GGTCAGCTGC 1380TAATCACCAA ATGAACTCCC TGATCTGGCC TAGGGAACAG TGGGATTCAC AGATTATCAA 1440TGACCGGATC TATCCATATG CTGCCATCTC CTATGAAGAA TGGAATGACC CTCCTGCTGT 1500GAAGTGGGGC AGCGTGAGCA ATCCACTCTT CCTCCCGCTG ATCCCACCAC AGTCTCAAGG 1560GTTCACCGCC ATAGTCCTCA CCTACGACCG AGTAGAGAGC CTCTTCCGGG TCATCACTGA1620AGTGTCCAAG GTGCCCAGTC TATCCAAACT ACTTGTCGTC TGGAATAATC AGAATAAAAA1680CCCTCCAGAA GATTCTCTCT GGCCCAAAAT CCGGGTTCCA TTAAAAGTTG TGAGGACTGC1740TGAAAACAAG TTAAGTAACC GTTTCTTCCC TTATGATGAA ATCGAGACAG AAGCTGTTCT1800GGCCATTGAT GATGATATCA TTATGCTGAC CTCTGACGAG CTGCAATTTG GTTATGAGGT1860CTGGCGGGAA TTTCCTGACC GGTTGGTGGG TTACCCGGAT CGTCTGCATC TCTGGGACCA1920TGAGATGAAT AAGTGGAAGT ATGAGTCTGA GTGGACGAAT GAAGTGTCCA TGGTGCTCAC1980TGGGGCAGCT TTTTATCACA AGTATTTTAA TTACCTGTAT ACCTACAAAA TGCCTGGGGA2040TATCAAGAAC TGGGTAGATG CTCATATGAA CTGTGAAGAT ATTGCCATGA ACTTCCTGGT2100GGCCAACGTC ACGGGAAAAG CAGTTATCAA GGTAACCCCA CGAAAGAAAT TCAAGTGTCC2160TGAGTGCACA GCCATAGATG GGCTTTCACT AGACCAAACA CACATGGTGG AGAGGTCAGA2220GTGCATCAAC AAGTTTGCTT CAGTCTTCGG GACCATGCCT CTCAAGGTGG TGGAACACCG2280AGCTGACCCT GTCCTGTACA AAGATGACTT TCCTGAGAAG CTGAAGAGCT TCCCCAACAT2340TGGCAGCTTA TGAAACGTGT CATTGGTGGA GGTCTGAATG TGAGGCTGGG ACAGAGGGAG2400AGAACAAGGC CTCCCAGCAC TCTGATGTCA GAGTAGTAGG TTAAGGGTGG AAGGTTGACC2460TACTTGGATC TTGGCATGCA CCCACCTAAC CCACTTTCTC AAGAACAAGA ACCTAGAATG2520AATATCCAAG CACCTCGAGC TATGCAACCT CTGTTCTTGT ATTTCTTATG ATCTCTGATG2580GGTTCTTCTC GAAAATGCCA AGTGGAAGAC TTTGTGGGCA TGCTCCCAGA TTTAAATCCA2640GCTGAGGCTC CCTTTGTTTT CAGTTCCATG TAACAATCTG GAAGGAAACT TCACGGACAG2700GAAGACTGCT GGAGAAGAGA AGCGTGTTAG CCCATTTGAG GTCTGGGGAA TCATGTAAAG2760GGTACCCAGA CCTCACTTTT AGTTATTTAC ATCAATGAGT TCTTTCAGGG AACCAAACCC2820AGAATTCGGT GCAAAAGCCA AACATCTTGG TGGGATTTGA TAAATGCCTT GGGACCTGGA2880GTGCTGGGCT TGTGCACAGG AAGAGCACCA GCCGCTGAGT CAGGATCCTG TCAGTTCCAT2940GAGCTATTCC TCTTTGGTTT GGCTTTTTGA TATGATTAAA ATTATTTTTT ATTCCTTTTA3000AAA 3003(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度728個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii) 分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)無(wú)(iv) 反義無(wú)(v) 片段類(lèi)型N-末端(vi) 原始來(lái)源(xi) 序列描述SEQ ID NO2Met Cys Ala Ser Val Lys Tyr Asn Ile Arg Gly Pro Ala Leu Ile Pro1 5 10 15Arg Met Lys Thr Lys His Arg Ile Tyr Tyr Ile Thr Leu Phe Ser Ile20 25 30Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Gln Phe Trp Pro His35 40 45Ser Ile Glu Ser Ser Asn Asp Trp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Arg50 55 60Asp Val Pro Val Val Arg Leu Pro Ala Asp Ser Pro Ile Pro Glu Arg65 70 75 80Gly Asp Leu Ser Cys Arg Met His Thr Cys Phe Asp Val Tyr Arg Cys85 90 95Gly Phe Asn Pro Lys Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ile Tyr Ala Leu Lys100 105 110Lys Tyr Val Asp Asp Phe Gly Val Ser Val Ser Asn Thr Ile Ser Arg115 120 125Glu Tyr Asn Glu Leu Leu Met Ala Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Tyr Thr130 135 140Asp Asp Ile Asn Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu145 150 155 160Asn Gln Asn Thr Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln165 170 175Leu Ser Arg Trp Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu180 185 190Pro Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp195 200 205Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln210 215 220Gly Tyr Asp Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val225 230 235 240Asp Leu Pro Glu Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser245 250 255Ser Gln Val Gly Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu260 265 270Gln Val Lys His Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn275 280 285Leu Ser Glu Gly Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln290 295 300Val Phe Asp Tyr Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val305 310 315 320Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln325 330 335Ala Gly Cys Val Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe340 345 350Ser Glu Val Leu Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu355 360 365Lys Met Ser Asp Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln370 375 380Ile Glu Glu Met Gln Arg Gln Leu Phe Met Glu Pro Val Arg Arg Glu385 390 395 400Asn Trp Ser Ala Ala Asn His Gln Met Asn Ser Leu Ile Trp Pro Arg405 410 415Glu Gln Trp Asp Ser Gln Ile Ile Asn Asp Arg Ile Tyr Pro Tyr Ala420 425 430Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro Pro Ala Val Lys Trp Gly435 440 445Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu Ile Pro Pro Gln Ser Gln450 455 460Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp Arg Val Glu Ser Leu Phe465 470 475 480Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro Ser Leu Ser Lys Leu Leu485 490 495Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro Pro Glu Asp Ser Leu Trp500 505 510Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val Arg Thr Ala Glu Asn Lys515 520 525Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu Ile Glu Thr Glu Ala Val530 535 540Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu Thr Ser Asp Glu Leu Gln545 550 555 560Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro Asp Arg Leu Val Gly Tyr565 570 575Pro Asp Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu Met Asn Lys Trp Lys Tyr580 585 590Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met Val Leu Thr Gly Ala Ala595 600 605Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr Thr Tyr Lys Met Pro Gly610 615 620Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met Asn Cys Glu Asp Ile Ala625 630 635 640Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly Lys Ala Val Ile Lys Val645 650 655Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu Cys Thr Ala Ile Asp Gly660 665 670Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu Arg Ser Glu Cys Ile Asn675 680 685Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Val Glu His690 695 700Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Pro Glu Lys Leu Lys705 710 715 720Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu72權(quán)利要求
1.一種含有選自下列組中之成員的分離的多核苷酸(a)與編碼含有SEQ ID NO2氨基酸的多肽的多核苷酸至少有96％的相同性的多核苷酸；(b)利用遺傳密碼豐余而編碼SEQ ID NO2相同氨基酸的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；和
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸含有SEQ ID NO1中所列的核苷酸。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，編碼含有SEQ ID NO2氨基酸的多肽。
6.含有權(quán)利要求2DNA的載體。
7.含有權(quán)利要求6載體的宿主細(xì)胞。
8.生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
9.生產(chǎn)表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞以使所述細(xì)胞表達(dá)由載體中所含的人cDNA編碼的多肽。
10.含有與SEQ ID NO2氨基酸序列至少有96％相同之氨基酸序列的多肽。
11.含有SEQ ID NO2所列氨基酸序列的多肽。
12.權(quán)利要求10多肽的激動(dòng)劑。
13.權(quán)利要求10多肽的抗體。
14.權(quán)利要求10多肽的拮抗劑。
15.治療需要EXT2之患者的方法，包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求10的多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)給患者施用編碼所述多肽并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽的DNA而施用治療有效量的所說(shuō)多肽。
17.治療需要抑制EXT2多肽之患者的方法，包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求16的拮抗劑。
18.診斷與權(quán)利要求10多肽表達(dá)相關(guān)之疾病或疾病易感性的方法，包括確定編碼所述多肽的核酸序列中的突變。
19.用于疾病診斷的方法，包括分析來(lái)自宿主的樣品中權(quán)利要求10多肽的水平。
20.鑒定結(jié)合并激活或抑制權(quán)利要求10多肽之受體的化合物的方法，包括在允許與受體結(jié)合的條件下，將在其表面上表達(dá)所述多肽之受體的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，所述受體與能夠提供可檢測(cè)信號(hào)以應(yīng)答化合物與所述受體結(jié)合的第二組分有關(guān)；和通過(guò)檢測(cè)是否存在由所述化合物與所述受體相互作用而產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)確定所述化合物是否結(jié)合并激活或抑制所述受體。
全文摘要
公開(kāi)了EXT2多肽和編碼所述酶的DNA(RNA)以及用重組技術(shù)生產(chǎn)所述多肽的方法。還公開(kāi)了用所述EXT2發(fā)展治療遺傳多發(fā)性外生骨疣和癌癥,如軟骨肉瘤等的方法。還公開(kāi)了檢測(cè)與核酸序列中的突變和所述多肽濃度改變相關(guān)之疾病的診斷方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1180709SQ96121928
公開(kāi)日1998年5月6日 申請(qǐng)日期1996年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月21日
發(fā)明者鄧漢湘, 夏家輝, 范朝紅 申請(qǐng)人:湖南醫(yī)科大學(xué)