專利名稱：：制癌化合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制癌化合物及其制造方法，更具體地說，本發(fā)明涉及在中藥狼毒中所含的新穎的抑制癌的化合物及其制備方法。中藥具有很古老的歷史，它是總結(jié)了人類的智慧而產(chǎn)生的。本發(fā)明人等在研究一些尚未探明其制癌活性本質(zhì)的具有制癌性的中藥過程中，結(jié)果確認(rèn)，在狼毒(Stellerachamaejasme.L，Eu-phorbiafischerianaSteud.，E.ebiacteolaHayata)中含有強(qiáng)制癌活性的物質(zhì)，于是在以前曾經(jīng)以抗腫瘤性物質(zhì)的提取方法提出了專利申請(qǐng)(特許出平成2年第58126號(hào))。但是，在該專利申請(qǐng)中，未能很有效地離析出具有制癌活性的化合物，以至于不能確認(rèn)它對(duì)原發(fā)性癌的有效性。本發(fā)明者等進(jìn)一步對(duì)在狼毒的抗腫瘤物質(zhì)中所含的制癌活性成分進(jìn)行了反復(fù)研究，離析出擔(dān)負(fù)狼毒的制癌活性的成分。而且，又在其中發(fā)現(xiàn)了一種含有以下列結(jié)構(gòu)式表示的新穎化合物。也就是說，本發(fā)明的第1個(gè)目的是提供由下列結(jié)構(gòu)式(I)或(II)所表示的斯特萊拉馬克啉(stelleramacrin)A和斯特萊拉馬克啉B。另外，本發(fā)明的第2個(gè)目的是提供一種由狼毒制備斯特萊拉馬克啉A和斯特萊拉馬克啉B的方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種含有斯特萊拉馬克啉A或斯特萊拉馬克啉B的抗癌劑。本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供一種以格寧地馬克啉(gnidimacin)或匹美利亞(Pimelea)因子P2作為有效成分的原發(fā)性癌的治療劑。圖1是表示本發(fā)明的斯特萊拉馬克啉A的質(zhì)子NMR圖。圖2是表示本發(fā)明的斯特萊拉馬克啉B的質(zhì)子NMR圖。用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方案。本發(fā)明的以式(I)或式(II)表示的斯特萊拉馬克啉A和斯特萊拉馬克啉B(以下將其統(tǒng)稱為“斯特萊拉馬克啉”)可以通過使用有機(jī)溶劑來抽提狼毒的地上部分或地下部分(根莖)，然后再將此抽提液加以精制而獲得。具體地說，例如，首先將狼毒的地上部分或地下部分用甲醇、乙醇、丙醇等低級(jí)醇來抽提，再將此抽提液用石油醚等水不溶性的有機(jī)溶劑來萃取，于是獲得了粗的提取液。然后，精制此粗的提取液，其中包括使用己烷-醋酸乙酯等作為洗脫溶劑的硅膠柱色譜法、使用甲醇-水等進(jìn)行的ODS柱色譜法等，這樣就獲得了一些活性級(jí)分。然后再附加使用高速液相色譜法和分離用薄層色譜法純化所獲物質(zhì)，借此能離析出可作為具有制癌活性化合物的、以式(I)或(II)表示的斯特萊拉馬克啉。在按照上述的分離、精制過程中，還獲得一些斯特萊拉馬克啉以外的抗癌化合物，例如，格寧地馬克啉[guidimacrin；J.Nat.Prod.1985，48(3)，440～445]、匹美利亞因子P2(PimeleafactorP2；天然有機(jī)化合物討論會(huì)講演要旨集，27，734-741)、亞毒素A(SubtoxinA；天然有機(jī)化合物討論會(huì)講演要旨集，27，734-741)、ヒェラトキシン(huratoxin；天然有機(jī)化合物討論會(huì)講演要旨集，27，734-741)、單純桿菌素(simplexin；Aust.Vet.J.，51(6)，325-326)等，所謂這些化合物是作為不同級(jí)分得到的，另外，使用紫外線吸收光譜、質(zhì)子核磁共振譜、質(zhì)譜等，通過分析確定這些化合物的結(jié)構(gòu)。另外，這些從狼毒中提取的是其他制癌化合物的格寧地馬克啉、匹美利亞因子P2等是已知的物質(zhì)，這些已知物質(zhì)在過去被認(rèn)為對(duì)腹水型白血病的改善是有效的。但是，這些藥物對(duì)白血病的作用與對(duì)原發(fā)性癌的制癌活性之間的關(guān)系，例如，像從肼基醌和爭(zhēng)光毒素的例子容易理解那樣，還不清楚，并且不知道這些化合物對(duì)原發(fā)性癌是否具有制癌活性。根據(jù)本發(fā)明人等的研究結(jié)果，最新發(fā)現(xiàn)，格寧地馬克啉、匹美利亞因子P2即使對(duì)胃癌、肺癌和肝癌等原發(fā)性癌也具有很強(qiáng)的抑制作用。在將本發(fā)明的斯特萊拉馬克啉作為制癌劑使用的情況下和將格寧地馬克啉和匹美利亞因子P2作為原發(fā)性癌治療劑使用的情況下，可以將它們照原樣，或者可以將它們與常用的制劑載體一起，給動(dòng)物和人服用。作為斯特萊拉馬克啉或格寧地馬克啉、匹美利亞因子P2的投藥形態(tài)沒有特別的限定，根據(jù)需要可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。例如，可以作為片劑、膠囊劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑等口服劑，或者也可以作為注射劑、栓劑等非口服劑型。根據(jù)本發(fā)明，制備的是新穎化合物的斯特萊拉馬克啉A的LD50值為5mg/kg，斯特萊拉馬克啉B的LD50值為12mg/kg，在將這些藥物作為口服劑使用時(shí)，為了發(fā)揮所期望的效果，其用量應(yīng)根據(jù)患者的年齡、體重、病情程度而有所不同，通常，在使用斯特萊拉馬克啉的情況下，對(duì)于成年人來說，投藥量按每日0.02mg～20mg的范圍，每日分?jǐn)?shù)次投藥較為合適。另外，在使用格寧地馬克啉、匹美利亞因子P2的情況下，對(duì)于成年人來說，投藥量按每日0.01mg～10mg的范圍較為合適。對(duì)于口服劑來說，可以使用淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽類等作為賦形劑，按照常規(guī)的方法來制造。當(dāng)作為口服劑時(shí)，為了進(jìn)行調(diào)節(jié)，除了上述的賦形劑外，還可以適當(dāng)?shù)嘏浜险辰Y(jié)劑、潰散劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、矯味劑、著色劑和香料等，各自的具體例子列舉如下。作為粘結(jié)劑，例如可以列舉出淀粉、糊精、阿拉伯樹膠粉未、明膠、羥丙基淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、結(jié)晶纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇等。作為潰散劑，例如可以列舉出淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素、低置換羥丙基纖維素等。作為表面活性劑，例如可以列舉出十二烷基硫酸鈉、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、聚山梨醇酯80等。作為潤(rùn)滑劑，例如可以列舉出滑石、蠟類、加氫植物油、蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋁、聚乙二醇等。作為流動(dòng)性促進(jìn)劑，例如可以列舉出輕質(zhì)無水硅酸、干燥氫氧化鋁凝膠、合成硅酸鋁、硅酸鎂等。另外，本發(fā)明的化合物類也可以作為懸濁液、乳劑、糖漿、酏劑投藥，在這些劑中還可以含有矯味矯臭劑、著色劑等。在將本發(fā)明的化合物類作為非口服劑使用的情況下，為了發(fā)揮所期望的效果，其用量應(yīng)根據(jù)患者的年齡、體重、病情程度而有所不同，通常對(duì)于成年人來說，本發(fā)明的化合物最好按1日0.005mg～5mg范圍的用量進(jìn)行靜脈注射、靜脈點(diǎn)滴、皮下注射、肌肉注射。這些非口服劑可按常規(guī)的方法制造，在制造過程中作為稀釋劑可使用一般注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等。還根據(jù)需要，可以加入殺菌劑、防腐劑、穩(wěn)定劑。另外，這些非口服劑，從穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮，最好方法可以是裝入小玻璃瓶等中后冷凍，也可以是按照通常的凍干技術(shù)除去水分，使其成為凍結(jié)的干燥物，然后在直到使用之前再將其調(diào)制成液體劑。另外，根據(jù)需要，可以適當(dāng)?shù)丶尤氲葷B劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑等。作為其他非口服劑，可列舉出外用液劑、軟膏等涂敷劑、用于插入直腸內(nèi)的栓劑等，它們都可按常規(guī)的方法制造。下面列出一些實(shí)施例，并借此更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。實(shí)施例1將1kg瑞香狼毒(Stellerachamaejasme.L)的地下部分粉碎，往其中加入3L的甲醇，然后進(jìn)行5小時(shí)的加熱回流抽提。對(duì)抽提后的殘?jiān)侔赐瑯拥臈l件抽提，將兩批抽提液合在一起進(jìn)行減壓過濾，獲得甲醇抽提物153.6g。進(jìn)而，將此甲醇抽提物利用索格利特提取器用石油醚抽提5小時(shí)，獲得石油醚抽提物(MMP)15.8g。將這種MMP6.5g用硅膠柱色譜法(直徑5cm、長(zhǎng)16.5cm)，用己烷-醋酸乙酯作為洗脫溶劑[1∶4(V/V)、1∶2(V/V)、1∶1(V/V)]依次洗脫，形成各級(jí)分。將己烷-醋酸乙酯＝1∶1(V/V)的洗脫級(jí)分1g，用ODS逆相柱(直徑0.2cm、長(zhǎng)25cm)高速液相色譜法，用甲醇-水[10∶1(V/V)]洗脫。結(jié)果證實(shí)，在停留時(shí)間為9.5分、11.4分、14.8分、17.2分、19.8分和21.0分的幾個(gè)級(jí)分中分別存在具有強(qiáng)制癌活性的物質(zhì)。將各級(jí)分從其停留時(shí)間最短算起，依次分為級(jí)分1、級(jí)分2、級(jí)分3、級(jí)分4、級(jí)分5和級(jí)分6。然后，根據(jù)需要，將各級(jí)分分別用分離薄層色譜法[硅膠柱、己烷-醋酸乙酯＝1∶2(V/V)]和分離用高速液相色譜法[ODS柱，甲醇-水＝10∶1(V/V)]反復(fù)精制，分離出單一化合物。從各級(jí)分中分離出的單一化合物的收量分別為級(jí)分1為1.90mg，級(jí)分2為3.29mg，級(jí)分3為2.06mg，級(jí)分4為8.23mg，級(jí)分5為1.23mg(當(dāng)以狼毒的地上部分作為原料，按照完全同樣的操作步驟處理時(shí)，所獲得收量分別為級(jí)分1為1.35mg、級(jí)分2為3.61mg)。對(duì)這些離析出的化合物逐個(gè)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，從級(jí)分1中離析出的化合物是一種由式(I)所表示的新穎化合物[本發(fā)明人等將這種新穎化合物命名為斯特萊拉馬克啉A(StelleramaerinA)]。另外，從級(jí)分2中離析出的化合物為格寧地馬克啉，從級(jí)分3中離析出的化合物為匹美利亞因子P2，從級(jí)分4中離析出的化合物為亞毒素A，從級(jí)分5中離析出的化合物為ヒェラトキシン，而從級(jí)分6中離析出的化合物為單純桿菌素。在離析出的化合物中，是新穎化合物的斯特萊拉馬克啉的物理化學(xué)性質(zhì)如下所示。斯特萊拉馬克啉的物理化學(xué)性質(zhì)分子式C37H50O11性狀白色粉未質(zhì)量分析M+H＝671苯甲酰基1個(gè)ダフナン系列具有雙萜骨架質(zhì)子核磁共振譜(δppm，在CDCl3中)1H-NMR；2.59(1H，dd，J＝12.5)，1.65(1H，m)，3.81(1H，d)，3.72～3.95(1H)，3.39(1H，s)，3.03(1H，d，J＝2.9)，2.91(1H，d，J＝12.5)，2.76(1H，m)，2.02(1H，d，J＝7.5)，2.32(1H，d，J＝14.7)，4.40(1H，d，J＝2.9)，5.19(1H，s)，4.95(1H，s)，1.84(3H，s)，4.92(1H，bd，J＝10.0)，4.37(1H，t，J＝10.0)，1.17(3H，d，J＝7.6)，3.89(1H，d，J＝10.0)，3.73(1H，d，J＝11)，2.26(1H，m)，3.78～3.89(1H，d，J＝7.3)，1.00(3H，d，J＝7.6)，8.07(1H，m)，7.57(1H，m)，7.47(2H，m)碳原子核磁共振譜(δppm，在CDCl3中)13C-NMR；14.58，18.20，19.05，22.81，23.11，23.61，24.19，25.18，27.25，28.52，29.51，36.53，37.62，40.85，48.01，48.13，61.28，63.18，65.12，68.27，70.81，72.08，78.47，79.42，81.03，81.34，84.42，111.89，118.50，128.43，129.73，130.30，133.13，145.56，167.09.實(shí)施例2把按照實(shí)施例1中記載的方法制得的MMP2g放在以O(shè)DS(LC-Sorb，SP-A-ODS，ケムコ社制)為載體的敞口式色譜柱上(ODS柱，甲醇-水＝10∶1，V/V)，以甲醇-水＝9∶1(V/V)的溶液洗脫。將此洗脫物以254nm檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)在所獲得的6個(gè)級(jí)分中，在級(jí)分1、2和3中具有強(qiáng)的制癌活性。在這三個(gè)級(jí)分中，將顯示最強(qiáng)制癌活性的級(jí)分2再放在分離用高速液相色譜柱上(柱子Shim-PackPREP-ODS，20mm×25cm)，以甲醇-水(10∶1，V/V)作為洗脫溶劑，邊用UV228nm監(jiān)測(cè)，邊進(jìn)行洗脫。其結(jié)果是，在洗脫時(shí)間為17.5分時(shí)洗脫出斯特萊拉馬克啉A，在洗脫時(shí)間為27.9分時(shí)洗脫出格寧地馬克啉，在洗脫時(shí)間為44.4分時(shí)洗脫出斯特萊拉馬克啉B。所獲得斯特萊拉馬克啉A和B的質(zhì)子NMR分別示于圖1和圖2中。另外，從上述的級(jí)分1和3也同樣得到斯特萊拉馬克啉。試驗(yàn)例1往每一只BDF1小鼠的腹腔內(nèi)移植1×106個(gè)小鼠白血病細(xì)胞P-388，從第2日起按每日1次，一連5日將被試驗(yàn)藥物投入小鼠的腹腔內(nèi)，然后將它們的生存日數(shù)與對(duì)比組作比較，據(jù)此求出其延命率。其結(jié)果示于表1中。表1試驗(yàn)例2將一些從人體分離出的胃癌、肺癌、肝癌以及白血病的細(xì)胞分別按照104個(gè)/毫升加入一種含有10％仔牛血清的RPM-1640培養(yǎng)基中，然后在碳酸氣培育箱中，在37℃下培養(yǎng)4日。然后將斯特萊拉馬克啉按不同的濃度加入上述的培養(yǎng)物中，求出能夠阻止人癌細(xì)胞50％增殖的試料濃度(IC50)。其結(jié)果示出表2中。表2試驗(yàn)例3對(duì)每一只BDF1小鼠皮下移植1×106個(gè)路易士(ルィス)肺癌細(xì)胞，對(duì)每一只BALB/C小鼠皮下移植5×106個(gè)克隆26(Clon26)大腸癌細(xì)胞，對(duì)每一只BDF1小鼠皮下移植0.25ml的B-16黑素瘤(メラノマ)原發(fā)性癌的20％均漿，以此作為原發(fā)性癌，從第2日起按每日1次，一連5日將格寧地馬克啉和匹美利亞因子P2投入小鼠的腹腔內(nèi)，然后與對(duì)比組比較延命率。關(guān)于格寧地馬克啉的結(jié)果示于表3中，關(guān)于匹美利亞因子P2的結(jié)果示于表4中。表3</tables>表4</tables>另外，將格寧地馬克啉對(duì)患了ルィス肺癌的小鼠按0.06mg/kg進(jìn)行靜脈注射時(shí)，所獲得延命率為47.8％。實(shí)驗(yàn)例4將一些從人體分離出的胃癌、肺癌、肝癌以及白血病的細(xì)胞分別按照104個(gè)/毫升加入含有10％仔牛血清的RPM-1640培養(yǎng)基中，然后在碳酸氣培育箱中，在37℃下培養(yǎng)4日。然后將格寧地馬克啉或匹美利亞因子按不同的濃度加入上述的培養(yǎng)物中，求出能夠阻止人癌細(xì)胞50％增殖的試料濃度(IC50)。其結(jié)果示于表5中。表5實(shí)驗(yàn)例5利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究格寧地馬克啉對(duì)原發(fā)性癌的作用。也就是說，首先，在雌性BALB/c小鼠(1組6只，17～21g)的皮下接種調(diào)制成1×106個(gè)/毫升MethA纖維狀肉瘤細(xì)胞(フィプ口ザコ-マ)的添加有10％牛胎仔血清的RPMI1640液0.01ml。在接種后經(jīng)過7日在小鼠上形成的原發(fā)性癌，此時(shí)按照0.001mg/kg的投藥量給小鼠注射溶解于含有0.5％CMC的生理食鹽水中的格寧地馬克啉。這種投藥為1日1次，共注射5日。在接種MethA纖維狀肉瘤細(xì)胞后的第21日取出腫瘤，其重量與未注射格寧地馬克啉的對(duì)比組進(jìn)行比較。結(jié)果表明，注射過格寧地馬克啉的一組小鼠的平均腫瘤重量為0.4g，而對(duì)比組的平均腫瘤重量為2.1g，格寧地馬克啉對(duì)原發(fā)性癌的增殖抑制為81％。制劑例1片劑(處方)①玉米淀粉48g②結(jié)晶纖維素42g③羧甲基纖維素鈣8g④輕質(zhì)無水硅酸0.5g⑤硬脂酸鎂0.5g⑥斯特萊拉馬克啉A1g合計(jì)100g(制法)按照上述的處方將①～⑥混合均勻，然后用壓片機(jī)將其壓縮成型，獲得一片為200mg的片劑。在這些片劑的一片中含有在實(shí)施例1中獲得的斯特萊拉馬克啉A2mg，成年人的服用量為每日1～10片，分?jǐn)?shù)次服用。制劑例2顆粒劑(處方)①玉米淀粉88g②硬脂酸鎂1.5g③羧甲基纖維素鈣8g④輕質(zhì)無水硅酸1.5g⑤斯特萊拉馬克啉B1g合計(jì)100g(制法)按照上述的處方將①～⑤混合均勻，然后用壓縮成型機(jī)其壓縮成型，然后用破碎機(jī)粉碎并篩分，就得到顆粒劑。在這種顆粒劑1g中含有在實(shí)施例2中獲得的斯特萊拉馬克啉B10mg，成年人的服用量為每日0.1～2g，分?jǐn)?shù)次服用。制劑例3膠囊劑(處方)①玉米淀粉98.5g②輕質(zhì)無水硅酸1.0g③斯特萊拉馬克啉A0.5g合計(jì)100g(制法)按照上述的處方將①～③混合均勻，然后將其裝入2號(hào)膠囊中，每個(gè)膠囊裝入200mg。在這種膠囊劑的1個(gè)膠囊中含有在實(shí)施例1中獲得的斯特萊拉馬克啉A1mg，成年人的服用量為每日1～20個(gè)膠囊，分?jǐn)?shù)次服用。制劑例4針劑(處方)①注射用蒸餾水89.5g②大豆油5g③大豆磷脂質(zhì)2.5g④甘油2g⑤斯特萊拉馬克啉A1g合計(jì)100g(制法)按照上述處方，將⑤溶解于②和③中，然后再往其中加入①和④的溶液并使之乳化，就得到針劑。如上所述，本發(fā)明的斯特萊拉馬克啉具有高的制癌活性，因此有可能作為適用范圍很廣的制癌劑來使用。另外，含有格寧地馬克啉或匹美利亞因子P2的原發(fā)性癌治療劑，對(duì)治療胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等原發(fā)性癌癥是有用的。權(quán)利要求1.一種含有以格寧地馬克啉或匹美利亞因子P2作為有效成分的原發(fā)性癌治療劑。全文摘要公開了由下式(Ⅰ)或(Ⅱ)所表示的斯特萊拉馬克啉A或斯特萊拉馬克啉B及其制造方法以及含有以這些物質(zhì)作為有效成分的抗癌劑。另外,還公開了含有以格寧地馬克啉或匹美利亞因子P文檔編號(hào)A61K31/335GK1192901SQ9612150公開日1998年9月16日申請(qǐng)日期1996年12月9日優(yōu)先權(quán)日1996年12月9日發(fā)明者池川哲郎,池川信夫申請(qǐng)人:池川哲郎