專利名稱：生長因子樣活性的肽組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子，特別地涉及一個具有(或者模擬)轉化生長因子-β活性的合成的小肽，基質以及含有該小肽的組合物。
生長因子是一類諸如多肽激素的物質，能夠在體內或體外影響動物細胞確定種群的生長，但又不是營養(yǎng)物質。與組織生長和組織分化有關的蛋白質可能促進或抑制生長，可能促進或抑制分化，因而普通術語“生長因子”包括細胞因子和營養(yǎng)因子。
典型的生長因子是分子量介于5000-50,000道爾頓的多肽。根據(jù)結構上的相似性，生長因子分為以下幾類胰島素樣生長因子(IGFs)，血小板衍生的生長因子(PDGFs)，成纖維細胞生長因子(FGFs)，表皮生長因子(EGFs)，神經(jīng)生長因子(NGFs)和轉化生長因子β型(TGF-βs)。
TGF-βs最初是由于其能夠轉化正常成纖維細胞，使其具有錨地-非依賴性生長能力而得名的。然而，不論它的名字，TGF-βs是多種上皮，內皮及間充質細胞正常發(fā)育、生長和分化所需的多功能生長因子。與其它細胞因子相似，TGF-βs的特殊效應依賴于特定的細胞類型和它周圍的環(huán)境。
TGF-βs對細胞的效應一般分為增殖性的和非增殖性的。正如最初通過第一個對成纖維細胞的實驗所證實的，TGF-βs是真實的生長因子。TGF-βs能增強其增殖的兩種重要細胞類型是成骨細胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的施旺細胞。然而，對許多細胞而言，TGF-βs是有效的細胞增殖抑制劑。這種負生長控制可能是用于檢驗特定組織再生的調節(jié)機制，并可能在癌變的起始中起作用。
TGF-βs最重要的非增殖功能是增強細胞外基質的形成。雖然這最初主要是通過增加膠原和纖連蛋白的轉錄獲得的，但抑制蛋白酶對基質的降解也對基質的穩(wěn)定作出了貢獻。通過減少蛋白酶的分泌，同時增加蛋白酶抑制劑的水平，抑制了胞外基質的降解。TGF-βs對胞外基質顯著的和一般的效應是很可能在組織修復過程及某些纖維組織疾病發(fā)病中起著重要作用。
Lin等人在1993年5月13日公布的PCT申請書WO 93/09228中描述了DNA編碼的一些不同的TGF-β受體。TGF-β受體的存在將會便于對TGF-β功能的進一步評估。
TGF-β總家族的許多成員都有了特征性記述。例如，Basler等用圖表闡明了TGF-β總家族成員間的序列關系。細胞(Cell)，73，PP.687-702(1993)。Massague，細胞生物學年鑒(Annu.Rev.Cell.Biol.)，6，pp.599-641(1990)也綜述了TGF-β家族，包括對TGF-β作用機制的討論。Daopin等報道了TGF-β1二級結構的核磁共振特征，并描述了TGF-β2的精確三維晶體結構。蛋白質(Proteins)，17，PP.176-192(1993)。TGF-β2單體采納了類似輕微彎曲的左手的折疊，兩對反平行β折疊形成四根手指。這些四指區(qū)和保守的二硫鍵確定了TGF-β總家族的折疊。
在TGF-β成員還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。BMPs曾被指出有益于傷口愈合，組織修復及誘導軟骨和/或骨的生長。例如，在1993年5月13日公布的PCT申請書9,309,229中，發(fā)明人Israel和Wolfman描述了具有骨刺激活性蛋白的應用，比如用于骨折愈合或可能用于牙周病治療及其它牙修復過程。最近，在C&EN，Hubbell和Langer所寫的一篇特別的文獻中，(PP.42-54，1995年5月13日)，報道了把BMP摻入到聚合物顆粒中，以使當聚合物降解時，蛋白質緩慢釋放到周圍組織，刺激細胞遷移到多孔基質中，并最后實現(xiàn)了新骨的合成。文獻同時指出，通過緩慢釋放TGF-β也可產生骨。
由于TGF-βs在臨床治療中的廣泛應用，它已成為許多方面研究的焦點。雖然多數(shù)研究工作涉及體外應用，最近的體內研究已證實了一些更有前景的體外效應。因此，TGF-βs的一些可能的臨床應用包括刺激血管生長，與傷口愈合有關的肉芽組織的形成，以及骨和軟骨的形成。
發(fā)明人Derynk和Goeddel在1994年2月8日公布的美國專利5284763中描述了核酸編碼TGF-β及TGF-β的多種用途。發(fā)明人Chu等在1993年11月2日公布的美國專利5258029中描述了移植后出現(xiàn)骨向內生長的承壓修補物制劑，該修補物包含以膠原組合物或陶瓷為載體的TGF-β。發(fā)明人Hunziker在1994年11月29日公布的美國專利5,368,858中描述了生物可降解基質制劑，其中含有TGF-βs作為增殖劑，趨化劑和轉化因子。
發(fā)明人Palladino等在1991年10月8日公布的美國專利5,055,447中描述了用于治療和預防菌血感染造成的膿毒性休克的方法和組合物。從而，例如，這個專利提供了通過服用TGF-β治療遭受或具有膿毒性休克危險病人的方法。近來，人們更多地認為“膿毒癥”是一種炎性狀態(tài)，并有一批研究人員建議命名“全身發(fā)炎反應綜合癥”來描述“膿毒癥”(血流中存在細菌造成的感染)和其它(非膿毒癥性)發(fā)炎狀態(tài)。胸(Chest)，101，PP.1644-1655(1992)。
因此，生長因子在多種治療，臨床，科研、診斷及藥物設計應用中作用。但是，前已述及，典型的生長因子一般較大。TGF-β家族的天然成員分子量可高至25千道爾頓。生長因子的臨床應用(包括TGF-βs)可能由于它們的大小會導致諸如免疫反應等而受到局限。例如，人的TGF-β1是一個25,000道爾頓的同型二聚體蛋白質。除了可能有害的免疫反應，大的蛋白質也因為給藥和釋放中的困難而通常不是最好的藥物候選物。
所以，在使用或建議使用TGF-β的應用中需要能夠避免大多數(shù)這些問題的模擬天然生長因子的小肽。利用小肽模擬大的天然成員的生物活性有其優(yōu)點，因為基于摩爾質量，施藥時需要的小肽的凈量少得多，局部用藥也更為可行。同時，很小的肽趨向于只有很小的或沒有不良的免疫反應，而且能夠用簡單的肽化學工藝容易地進行合成。
本發(fā)明描述了一種名為“細胞調節(jié)素”的新肽的特征、性質和應用。細胞調節(jié)素能夠在多種細胞類型中模擬TGF-β1的廣泛的活性。另外，用人成骨瘤(HOS)細胞系進行實驗的原始結果表明細胞調節(jié)素也可能是TGF-β總家族其它成員的模擬物，例如可以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(HMPS)和成骨蛋白(OPS)，證據(jù)是它能特異性刺激的成骨細胞表型特征標示物(堿性磷酸酶和骨粘連蛋白)。
這種我們稱為細胞調節(jié)素的新化合物具有以下氨基酸順序丙氨酸-天門冬酰胺-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天門冬酰胺-丙氨酸(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)(序列1)，它能夠很容易地根據(jù)現(xiàn)有技術合成。因而，本明一方面提供了一種生物活性肽，它具有序列1所顯示的氨基酸順序。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于組織修復的組合物，該組合物包含有生物相容性基質及其結合的本質上具有序列1同樣氨基酸順序的肽(生長因子)。生物相容性基質可能是生物可降解性的或非生物可降解性的。肽以能有效促進細胞生長的用量摻入基質或以基質為載體。這些基質可用于在修復軟和硬組織中，快速替換丟失組織中，以及重塑和整形手術中構建模板。這些組合物保證和支持細胞再生，并且可與其它生長因子聯(lián)合使用，盡管如此，令人驚奇的是，本發(fā)明一個優(yōu)選實例的肽在沒有諸如表皮生長因子和血小板衍生生長因子等其它生長因子存在的情況下，可以誘導成纖維細胞集落形成。
本發(fā)明再一方面提供了一個藥物配方，其中包含實際上等同于序列1的化合物(可能以鹽的形式)及一個生理相容性載體。
我們稱之為細胞調節(jié)素的序列1化合物至少可以模擬TGF-βs的一類生物活性，例如抑制貂肺上皮細胞Mv-1-Lu的DNA合成，促進NRK-49F成纖維細胞的生長和集落形成，誘導I型膠原蛋白的增量表達，和/或誘導TGF-β的表達。附圖的簡要說明
圖1圖解表示了細胞調節(jié)素對貂肺上皮細胞Mv-1-Lu DNA合成的抑制作用。
圖2是顯微照片(放大500倍)，其中圖A是對照，圖B是有100nM細胞調節(jié)素的，圖C是有100nM細胞調節(jié)素加上EGF和PDGF的。所有試驗組都含有正常大鼠腎成纖維細胞NRK-49F，并在軟瓊脂中培養(yǎng)5天。
圖3圖解表示了細胞調節(jié)素對HOS細胞中基因表達的調節(jié)，其中圖A、B和D表明了增量表達而圖C中調節(jié)活性依賴于濃度，這是細胞中TGF-β的典型特征。
圖4中圖A到D是分別對應于圖3A到D數(shù)據(jù)的Northern印跡。
表5給出了本發(fā)明中細胞調節(jié)素實施例的1-101位原子的原子坐標。
本發(fā)明中的肽在生理條件下含有一個由-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)形成的穩(wěn)定β-彎曲。這個穩(wěn)定β-彎曲通過至少一個貼近的帶電氨基酸殘基而穩(wěn)定化。我們已命名這個新化合物為“細胞調節(jié)素”(cytomodulin)。這個我們稱為細胞調節(jié)素的新化合物的氨基酸順序是丙氨酸-天門冬酰胺-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天門冬酰胺-丙氨酸(序列1)，(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)，它很易于用本技術領域熟知的方法進行合成。
該肽可由多種合適的方法合成，優(yōu)選方法是手動或自動固相合成，該方法最早由R.B.Merrifield發(fā)展起來并由J.M.Stewart和J.D.Young在“肽的固相合成”(“Solid Phase Peptide Synthesis”)(1984)中記述?；瘜W合成從C末端開始按預定順序連接氨基酸?；镜墓滔嗪铣煞椒ㄐ枰袰末端保護的α-氨基酸偶聯(lián)到合適的不溶性樹脂載體上。用于合成的氨基酸需要保護α-氨基基團以保證與前面的殘基(或樹脂載體)形成正確的肽鍵。接下來是完成羧基端的縮合反應，去除α-氨基的保護基團以允許下一個殘基的加成。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”(1984)中描述了幾類α保護基團，其中包括歷史上優(yōu)選的，酸活潑的，氨基甲酸乙酯為基的叔丁氧羰基(Boc)。還可以使用其它的保護基團及其相關化學方案，其中包括堿活潑的9-芴甲氧羰基(FMOC)。同時，反應性的氨基酸側鏈官能團需要封閉直至合成結束。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”中綜述了官能封閉基團復合體系列及其應用中的策略和局限。
固相合成從前述C-末端α-保護的氨基酸殘基的偶聯(lián)開始。偶聯(lián)需要活化劑，例如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)同時加入或不加1-羥基苯并三唑(HOBT)，二異丙基碳二亞胺(DIIPC)或乙基二甲氨丙基碳二亞胺(EDC)。C末端殘基偶聯(lián)后，如果α-氨基保護基團是酸活潑叔丁氧羰基，則用溶于二氯甲烷的三氟乙酸(25％或更高濃度)去保護。用溶于二氯甲烷的三乙胺(10％)的中和步驟恢復了自由胺基(與鹽形式相對應)。C末端殘基加到樹脂上以后，將去保護，中和，偶聯(lián)及中間的洗脫步驟循環(huán)過程重復進行，以擴展保護的肽鏈。在合適的溶劑中，每一被保護的氨基酸均與等摩爾的偶聯(lián)劑一起過量(3至5倍)引入。最后，完全封閉的肽在樹脂載體上裝配好后，使用試劑把肽從樹脂上切下來并去除側鏈封閉基團。無水氟化氫用于切下酸活潑的叔丁氧羰基(Boc)化學基團。也有使用一些諸如甲硫醚和苯甲醚等親核清除劑的，以避免副反應特別是側鏈官能團的反應。
我們制備的細胞調節(jié)素，當以109-10-6M(1.4pg/mil到1400pg/mil)濃度加入細胞培養(yǎng)物中時，能引發(fā)若干不同細胞類型產生確定的高特異性效應，從而為生長因子模擬特性提供了證據(jù)。例如，這些觀察到的效應中包括貂肺上皮細胞Mv-1-LuDNA合成的抑制，成纖維細胞NRK-49F在軟瓊脂上的生長和集落形成，在新生兒表皮成纖維細胞原代培養(yǎng)物和HOS(人成骨瘤)細胞系中誘導I型膠原的增量表達，以及誘導轉化生長因子β的表達等。
含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽肯定能作為媒劑用于提高神經(jīng)和肌肉細胞的存活率或誘導生長。細胞調節(jié)素當然可作為一個新的培養(yǎng)基成分用于體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞。這個肽還可作為天然細胞因子的替代物應用到許多領域在外科手術中用作促進傷口愈合再生的藥劑；在矯形術中用作促進骨修復和移植整合的藥劑；在牙科中用于骨損傷修復和移植整合；在癌癥化療和放射性治療中作為細胞穩(wěn)定劑保護正常干細胞對抗細胞周期特異性過程；風濕性關節(jié)炎的治療；眼科學中用于修復斑點損傷，眼科學中用于眼色素層炎的治療；作為內臟動脈閉鎖癥倒灌損傷的保護劑，以及在生物學上作為研究生長因子的試劑。
本發(fā)明中的治療組合物將包括含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽，使用濃度取決于所需的有效劑量及所用的給藥方式。很容易想到關于細胞調節(jié)素組合物的多種治療適應癥。第一個適應癥是割傷和暴露組織的局部敷用以促進傷口愈合。傷口或其它可被治療的創(chuàng)傷類型包括(但不僅限于)一、二、三度燒傷(特別是二、三度燒傷)；表皮及內部手術割傷，包括美容手術；傷口，包括撕裂傷，割傷及刺傷；表皮潰瘍包括褥瘡，糖尿病，牙病，血友病，靜脈曲張。
使用方式多種多樣，例如全身給藥，局部施用，靜脈施藥，皮下施藥，腹膜內注射，骨膜下注射，氣管內施藥，多聚體或泵釋放，移植物，或脂質體釋放。合適的移植物(如果使用移植器械)包括諸如以凝膠泡沫，蠟或微粒為基的移植物。使用劑量應當足以使循環(huán)血漿中的有效成分濃度達到有效水平。有效劑量可以從體外或動物模型實驗系統(tǒng)中得到的劑量—響應曲線中推出。
新的細胞調節(jié)素也可用于誘導骨生長。所以，可以在藥學可接受載體或賦形劑中施用成骨有效劑量的新肽，以引導骨在原位沉積和成熟。另外，細胞調節(jié)素能摻入生物材料或以生物材料為載體，例如羥基磷灰石，以應用于骨再生或修復，使用方法例如見于1992年10月27日公布的美國專利5,158,934和1993年5月4日公布的美國專利5,208,219中的描述，細胞調節(jié)素可用組合物形式，例如1993年1月12日公布的美國專利5178845所述，以上專利的公開內容以參考文獻的形式并入本發(fā)明。
這些骨修復組合物特征性含有多種磷酸鈣礦物成分材料，例如，命名為Synthograft，Tricalcium Phosphate或Periogras的商品化羥基磷灰石。羥基磷灰石(或磷酸三鈣)可由已知方法制備而無須購買，例如Termine等在生物化學和生物物理文獻(Arch.Biochem.Biophys.)，140，TP307-325(1970)中公開的方法。這種材料可以粉狀提供，優(yōu)選顆粒大小一般在100-2,000微米范圍。
本發(fā)明的細胞調節(jié)素組合物的另一個治療適應癥是與基質形成材料結合。優(yōu)選的配方包括能提供發(fā)育的骨和軟骨構架的基質。潛在的基質可能是生物可降解性的或非生物降解性的，可進行化學性或生物性定義。
試舉一例，基質可以是惰性的，固體的和不含孔的，例如已知目前作為細胞培養(yǎng)容器的物質。
本發(fā)明基質可采取的另一種形式是可溶性多聚物。
本發(fā)明其它合適的實用基質包括多種多聚物和水凝膠。這些組合物可用于在軟組織修復，損失組織的快速替代以及重塑和整形手術模板構造。
因而，本發(fā)明的組合物能用多類可再吸收的多聚物制造，載有肽或把肽移植入多聚物材料網(wǎng)格中。當然，在重吸收特性上有局限性的多聚物載體，例如異丁烯酸羥乙酯，聚甲基丙烯酸甲酯，以及N-乙烯基吡咯烷酮甲基丙烯酸甲酯等也是適用的。然后，組合物就可植入組織損傷。
已知合適的可再吸收水凝膠中包括聚乳酸鹽和聚乙醇酸鹽的復合物。本發(fā)明的化合物能在多聚物合成中共價連接于這類物質，或可水解多聚物以便通過光照或化學活化多聚物產生自由基團以暴露接合位點。隨后使用常規(guī)技術把肽移植或固定到多聚物載體，制備發(fā)明的組合物。這樣制備的可重吸收水凝膠或多聚物尤其適用于軟組織重建。對硬組織的重建或修復(例如骨修復)，需要聯(lián)合那些水溶性的或可重吸收的多聚物種類與生物陶瓷，例如生物玻璃，氧化鋁，鋁酸鈣，磷酸三鈣和羥基磷灰石等。
當把細胞調節(jié)素混合于生理可接受的載體，即在使用劑量和濃度下對受體無毒的載體，制備成藥物時，通常需要把細胞調節(jié)素與緩沖液，抗氧化劑例如抗壞血酸，低分子量(小于10個殘基)多肽，蛋白質，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖和糊精，螯合劑例如EDTA，及其它賦形劑聯(lián)合起來。用于治療給藥的細胞調節(jié)素必須是無菌的。這可通過無菌濾膜(0.22微米)過濾很容易地完成。
含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽可通過任何藥學可接受載體施用，這取決于所需的給藥方式。其可與液相載體一起配制成脂質體，微囊，多聚體或蠟為基礎的可控釋放制劑，或配制成片劑，丸劑，或膠囊形式。
肽與有機和無機酸形成藥學可接受鹽，以鹽的形式給藥或者酰胺化新肽。形成藥學可接受鹽合適的酸的例子是鹽酸，硫酸，磷酸，醋酸，苯甲酸，檸檬酸，丙二酸，水楊酸，蘋果酸，延胡索酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，葡糖酸，抗壞血酸，馬來酸，苯磺酸，甲基磺酸和乙基磺酸，羥甲基磺酸和羥乙基磺酸。
鹽也可由合適的藥學可接受有機堿的加成而形成。這些有機堿形成這樣的一類，他們的局限性對那些本領域熟練技術人員來講易于理解。僅為了舉例說明，這一類可包括單，雙，或三烷基胺，例如甲胺，雙甲胺，和三乙胺；單，雙，或三羥基烷胺，例如單，雙，和三乙醇胺；氨基酸例如精氨酸和賴氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲還原葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；嗎啉；乙二胺；N-芐基苯乙胺；三(羥甲基)氨基甲烷；及以上類似物。(例如，可參看“藥用鹽”(“Pharmaceutical Salts”)，藥學雜志(J.Pharm.Sci.)，66(1)，1-19(1977))。
治療用細胞調節(jié)素制劑，例如用于促進骨細胞生長，可以把具所需純度的新肽與可選擇性的生理可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備成用于貯存的劑型，可采取凍干餅或水溶液形式。可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在施藥時使用的劑量和濃度下對受體是無毒的，它們包括諸如磷酸，檸檬酸和其它有機酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白。
其它成分包括甘氨酸，丁胺(blutamine)，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，雙糖，和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的平衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如TWEEN，PLURONICS或PEG。另外，其它需要包含于細胞調節(jié)素治療制劑的有用成分是一種或多種其它生長因子，例如表皮生長因子(EGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)。
局部敷用于例如用于傷口愈合時使用細胞調節(jié)素的最初劑量應當使釋放到治療部位的濃度在大約50到500納克/毫升范圍，然后根據(jù)臨床經(jīng)驗進行調節(jié)。由于細胞調節(jié)素組合物不但提供而且支持細胞再生，意味著連續(xù)使用或定期重敷該組合物。期望臨床醫(yī)生按照臨床經(jīng)驗修改使用劑量。
細胞調節(jié)素組合物可用無菌灌注形式使用，優(yōu)選地與生理鹽水聯(lián)用，或以油膏或懸浮液形式，優(yōu)選地與其它上文已述及的生長因子聯(lián)用，并可進一步與膠原，膠原類似物，或膠原模擬物聯(lián)用，例如發(fā)明人Bhatnagar在1994年10月11日公布的美國專利5,354,736中所述，其公開內容以參考文獻形式并入本發(fā)明。組合物也可滲入穿皮補片，石膏或繃帶，優(yōu)選的形式是液體或半液體。這類物品或組合物還應當包括磺胺嘧啶銀等自體微生物制劑。
細胞調節(jié)素也可經(jīng)全身給藥治療傷口和類似的創(chuàng)傷。全身給藥可用于不存在或極少有不希望的副反應的情況下，例如刺激癌癥病人瘤細胞生長。用于全身給藥的細胞調節(jié)素組合物優(yōu)選地配制成無菌，等滲腸胃外注射劑或輸注劑。
細胞調節(jié)素組合物，如前所述，或單獨使用細胞調節(jié)素，或聯(lián)合使用其它生長因子，膠原，前述的生理可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑，均可以生物相容性基質作為載體(或摻入生物相容性基質)。發(fā)明的基質可是多孔珠狀顆?；蚴抢w維狀。建議用例如磷酸鈣材料，諸如磷灰石為基礎的陶瓷來生產多孔組織移植物或假體材料，上有足夠的微孔允許組織附著。從而，本發(fā)明細胞調節(jié)素組合物一種治療應用是用于基質形成材料是生物可降解性的地方，并可用于例如軟骨修復。
用于填充或其它修整軟骨損傷的基質材料包括，例如，纖維蛋白原(在損傷或損壞時由凝血酶活化形成纖維蛋白)，膠原，明膠或任何其它生物可降解材料，這些材料形成的基質具足夠大的孔允許修復細胞填入和在其內增殖，并能在修復過程中降解和由軟骨替代。
本發(fā)明的組合物和方法中有用的基質可以預制成或在原位形成，例如通過多聚化合物和組合物，諸如纖維蛋白原以形成纖維蛋白基質?？梢灶A制的基質包括膠原，膠原類似物或膠原模擬物(例如膠原海綿和膠原羊毛)，化學修飾膠原，明膠珠或海綿，凝膠形成物質，任何其它由生物可降解基質材料組成，能填充組織或骨損傷并允許修復細胞填入其中的凝膠形成和組成物質，或者以上物質的混合物。
細胞調節(jié)素的生物活性現(xiàn)在將由下面的實施例進一步說明，這些實施例是為了說明而不是其限制。
實施例1貂肺上皮細胞Mv-l-Lu DNA合成的抑制TGF-β和細胞調節(jié)素的效應是通過測定[1H]胸苷摻入總酸不溶DNA的比率和細胞數(shù)進行評價。通?？蓞⒄誗ampath等，生物化學雜志(Joumal ofBiological Chemistry)，267，PP.20352-20362(1992)。DNA合成速率在三平行培養(yǎng)基中測定，培養(yǎng)物用不同濃度(10-9M至10-6M)的TGF-β或細胞調節(jié)素(用Merrifield方法合成)處理24小時，培養(yǎng)終止前6小時加入[甲基-3H]胸苷(μCi/ml，80Ci/mmol)。通過培養(yǎng)基抽吸終止摻入，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次后，三氯乙酸(10％)沉淀放射性DNA，用1.0％(W/V)十二烷基磺酸鈉，0.1M氫氧化鈉抽提，通過液體閃爍計數(shù)定量。測定細胞數(shù)，將1×105個細胞在含10％FBS的MEM培養(yǎng)基燒瓶中鋪平板，培養(yǎng)24小時后，以含不同種類TGF-β和細胞調節(jié)素的無血清培養(yǎng)基替代生長培養(yǎng)基。每24小時收集三平行培養(yǎng)物，連續(xù)7天，通過固定容積血球計數(shù)計中胰蛋白酶消化釋放的細胞計數(shù)測定細胞數(shù)。
細胞調節(jié)素的生長抑制曲線類似于在相同濃度范圍的TGF-β所觀察到的生長抑制曲線。
實施例2成纖維細胞NRK-49F在軟瓊脂上的生長和集落形成最初對TGF-β檢測其促進正常成纖維細胞不依賴于貼壁生長的能力仍然是TGF-β活性的一個標志。NRK-49F成纖維細胞生長在37℃的補充有10％胎牛血清的DEM培養(yǎng)基上。實驗使用培養(yǎng)基，10ng/mg表皮生長因子(EGF)和10ng/ml血小板衍生生長因子(DDGF)；然而，同TGF-β不同，它缺少這些生長因子時不能誘導集落形成(參看例如，Massagu，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，259，PP.9756-9761(1984))，細胞調節(jié)素確實在不存在上述兩種生長因子的情況下能誘導集落形成。在這里，或者加入100nM TGF-β(陽性對照)或者加入100nM細胞調節(jié)素。NRK-49F成纖維細胞(5×104細胞/毫升)混于0.3％瓊脂中在35毫米培養(yǎng)皿中鋪平板。第三天開始觀察到培養(yǎng)基中形成集落。
同預期一致，在基本培養(yǎng)基上沒有集落形成。也同預期一致，含TGF-β的克隆長成集落。令人驚奇的是，細胞調節(jié)素培養(yǎng)物也形成接近于TGF-β培養(yǎng)物同等程度的集落。TGF-β和細胞調節(jié)素培養(yǎng)物集落生長特征在生長期間相似。
參照圖2，展示的顯微照片攝于成纖維細胞培養(yǎng)的第5天。實際上第三天的培養(yǎng)物上已能觀察到集落形成。如圖2(A)所見，沒有任何生長因子的培養(yǎng)物中極少有細胞存活下來，圖2(B)和(C)展示了在細胞調節(jié)素存在下小集落(箭頭)的形成，(C)中還包括EGF和PDGF，誘導了更大的集落(箭頭)。這些類似于TGF-β誘導的集落形成，只是TGF-β需要同時存在表皮生長因子(EGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)；然而，如(B)中所見，細胞調節(jié)素的確能單獨誘導集落形成。
實施例3RNA分離和Northern檢測細胞總RNA基本上按Maniatis描述的方法分離。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，第二版(1989)。細胞用0.5％十二烷基磺酸鈉和0.1醋酸鉀裂解。用酚提取裂解液并在500rpm轉速離心15分鐘。水相在0.1M Tris，pH8.0和0.2M NaCl中用2倍體積乙醇沉淀。沉淀重新懸浮并通過測量260nm紫外吸收定量。RNA純度通過比較260m和280nm的紫外吸收進行鑒定。
RNA(10微克/泳道)在3到4伏/厘米條件下用0.7％瓊脂糖，2.2M甲醛變性凝膠電泳。毛細管轉移RNA至尼龍膜。RNA完整性，凝膠荷載和轉移效率通過亞甲藍染色的28S和18S帶進行鑒定。濾膜在80℃烘干2小時以固定RNA。烘干后，濾膜在65℃下于0.5M磷酸鈉緩沖液中雜交，該緩沖液pH值為7.0，且含有1mM EDTA，7％十二烷基磺酸鈉和1％牛血清白蛋白。cDNA探針使用Klenow酶按隨機引物方法標記上dDIG(熒光探針)。雜交在65℃進行18小時，然后沖洗。
按照制造商的步驟通過掃描地高辛-dVTP分析數(shù)據(jù)。(BoehringerMannheim Biochemica，DIG DNA標記試劑盒，Cat.No.1175033)。
表5給出了細胞調節(jié)素生物活性結構的原子坐標(原子1-101)。從而，表5描述了本發(fā)明肽的生物活性表面。我們相信可以合成出類似物，它呈現(xiàn)對細胞膜受體來講相同的或實質上相同的表面，從而等價于本發(fā)明的細胞調節(jié)素。另一方面，通過利用別構結合機理，可以合成對于細胞調節(jié)素來講增加了或減少了活性的復合物。因而，本發(fā)明的實施例，例如用于組合修復的組合物，包含一種生物相容性基質和一個由于是細胞調節(jié)素本身或是它的類似物而實質上與細胞調節(jié)素氨基酸序列相同的肽，該肽當摻入基質或以基質為載體并以能有效促進細胞生長的量存在時，可以表現(xiàn)相同于或本質上相同于圖5所示的生物活性表面。
當然，結合上述優(yōu)選的具體實施例描述了本發(fā)明，該描述和實施例都是為了說明，而不是限制本發(fā)明的范圍，它由附加的權利要求的范圍而確定。
序列表(1)一般資料(i)申請人加利福尼亞大學董事會(ii)發(fā)明名稱生長因子樣活性的肽組合物(iii)序列數(shù)目1(iv)通信地址(A)收信人Robbins，Berliner&Carson(B)街道201 N.Figueroa Street，5th Floor(C)城市洛杉磯(D)洲加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編90012-2628(V)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)填表日期(C)類別(viii)律師/代理人資料(A)姓名Berliner，Robert(B)登記號20121(C)目錄號(ix)電信資料(A)電話213-977-1001(B)傳真213-977-1003(2)序列1資料(i)系列特征
(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬無(iv)反義無(xi)序列描述序列1Ala Asn Val Ala Glu Asn Ala
權利要求
1.一個氨基酸序列為Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的生物活性肽。
2.一種有助于組織修復的組合物，其中含有一種生物相容性基質；以及一個實質上具有氨基酸序列Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的肽以有效促進細胞生長的量摻入基質或以基質為載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的肽，其中的氨基酸序列基本上由-Val-Ala-組成，它在生理條件下形成一個穩(wěn)定的β-彎曲。
4.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其中的生物相容性基質是生物可降解的。
5.根據(jù)權利要求4所述的組合物，其中的基質包括一種可再吸收的多聚物。
6.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其中的生物相容性基質是非生物可降解的。
7.根據(jù)權利要求6所述的組合物，其中的基質是多孔的。
8.一種藥物配方，其中含有一種含有氨基酸序列Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的化合物和它的鹽；一種生理可接受載體。
9.根據(jù)權利要求8所述的配方，其中的化合物具有至少一種實質上類似于TGF-β的生物特性。
全文摘要
本發(fā)明合成了一個序列為丙氨酸－天門冬酰胺－纈氨酸－丙氨酸－谷氨酸－天門冬酰胺－丙氨酸(ANVAENA)(序列1)的肽。該肽被命名為“細胞調節(jié)素”(cytomodulin)”,它能夠在多種細胞類型中模擬轉化生長因子－β1的多種活性。本發(fā)明提供了用于諸如組織修復等用途的組合物。該組合物包括一種生物相容性基質,而細胞調節(jié)素和其混合或者以該基質作為載體。
文檔編號A61P43/00GK1183103SQ96193633
公開日1998年5月27日 申請日期1996年4月18日 優(yōu)先權日1995年5月1日
發(fā)明者拉金卓·S·博塔納哥, 錢菁菁 申請人:加利福尼亞大學董事會