專利名稱：核因子－κB p65亞基拮抗肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別是涉及一組治療用核因子-κB(NF-κB)p65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一組能夠與核因子-κB p65亞基特異結合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這些核因子-κB p65亞基拮抗肽的制備和應用。
背景技術：
NF-κB是普遍存在于幾乎所有細胞胞漿中的一種轉錄因子，是多種信號轉導途徑的匯聚點，具有調控多種參與免疫應答、炎癥反應、病毒復制、細胞凋亡和增殖以及生長發(fā)育相關基因表達的功能。NF-κB系由兩種Rel家族蛋白構成的二聚體蛋白質。根據(jù)結構、功能和合成方式等方面的差異，可將Rel蛋白家族分成兩類一類是前體蛋白p105和p100，其C末端含錨蛋白重復序列(ankin repeat motif)，可通過ATP依賴的蛋白水解過程裂解，變?yōu)槌墒斓膒50和p52。該類蛋白缺乏反式激活結構域，無獨立激活基因轉錄的功能；另一類是RelA(p65)、Rel(c-Rel)、v-Rel和RelB，其C末端含有1個或多個反式激活域(transactivationdomain)，具有獨立激活基因轉錄的功能[1]。
當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB主要與κB抑制蛋白(IκBs)結合形成三聚體，以無活性方式存在于細胞質中。當細胞受到前炎癥細胞因子、病毒、內毒素、紫外線、氧化劑和放射線等多種外界信號刺激而啟動細胞第二信使系統(tǒng)時，IκBs在IκB激酶(IKK)的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB失去IκBs的嚴格控制而被激活，并移位進入細胞核內，其亞基形成環(huán)狀結構與靶基因啟動子內的特定部位結合，高效誘導促炎細胞因子(如TNF、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-11、IL-17等)、趨化因子(如IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2等)、粘附分子(如ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等)、免疫受體(如IL-2R)以及參與炎癥反應級聯(lián)放大的多種酶(如NO合成酶、環(huán)氧化酶等)的表達[2]。NF-κB所誘導的一些蛋白可進一步反轉活化NF-κB，導致炎癥反應的擴大和延續(xù)?；谏鲜稣J識，許多學者認為抑制NF-κB的轉錄活性將為炎性相關疾病的治療開辟新的途徑。另外，NF-κB在細胞凋亡和增殖中也發(fā)揮重要作用，其可通過直接上調凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受體相關因子(TRAF1和TRAF2)、鋅指蛋白A20、超氧化錳歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表達，抑制細胞的凋亡[3]。在腫瘤治療中，化療和放療可使NF-B活化，致使腫瘤細胞對化療耐藥和對放射線不敏感。因此，抑制NF-B的轉錄活性，降低腫瘤細胞的抗凋亡能力不失為提高抗癌藥物治療功效的良策[4]。
由于NF-κB強大的轉錄調控功能，NF-κB的過渡活化在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的作用如風濕性關節(jié)炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌相關性胃炎、炎癥性腸道疾病等慢性炎性疾病[5，6，7，8]，膿毒癥、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等急性炎性疾病[9]，Alzheimer′s病[10]，動脈粥樣硬化[11]，系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病[12]和癌癥的發(fā)生和發(fā)展均于NF-κB過度或持續(xù)活化密切相關。另外，NF-κB也參與了鼻病毒、流感病毒、EB病毒、巨細胞病毒、腺病毒、HTL病毒和HIV病毒等在感染細胞中的轉錄和復制，在這些病毒的感染和致病過程中起著重要的作用[13]。
鑒于NF-κB在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，以NF-κB及其信號傳導通路中的相關蛋白為靶點，研發(fā)NF-κB相關疾病的治療藥物已成為本領域中的研究熱點。目前國外有關以NF-κB為靶點的拮抗治療策略主要包括以下幾個方面[14，15，16，17(1)應用傳統(tǒng)抗炎藥物——糖皮質激素等激素藥物直接地或間接地部分拮抗NF-κB的活性；(2)抗氧化治療如抗氧化劑——乙酰半胱氨酸、阿司匹林水楊酸鈉和吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)等作為NF-κB的抑制劑，其中PDTC作為NF-κB的抑制劑已受到眾多研究者的青睞；(3)抑制IκK的形成及活性如靶向IκKα的反義核酸，可阻止IκKα的形成，從而緩解或減輕IκB的磷酸化及降解過程，最終達到抑制NF-κB活性的目的；NF-κB必需調節(jié)蛋白(NF-κB essential modifier，NEMO)是IκK蛋白復合物的調節(jié)蛋白，對維持IκK的功能有重要作用。May等設計了針對NEMO的抗炎多肽，該多肽包含NEMO結合域(NEMO binding domain，NBD)，它可以與NEMO結合，阻止NEMO與IκKβ的連接，從而抑制IκK的活性及其后續(xù)效應；(4)減少IκB的降解某些蛋白酶小體抑制劑如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近來發(fā)現(xiàn)的epoxomicin均可通過抑制IκB的降解從而拮抗NF-κB的活性，某些絲氨酸蛋白酶抑制劑如TLCK(N alpha-p-tosyll-L-lysinechloromethyl ketone)、TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)以及分泌性白細胞蛋白酶抑制劑也具有類似的功能；(5)促進IκB的生成應用IκBα的腺病毒表達載體，使IκBα顯型失活突變體過量表達，可明顯抑制NF-κB的核移位及其后續(xù)效應。(6)抑制NF-κB的合成如針對p50和p65的反義寡脫氧核苷酸可與編碼NF-κB的基因及mRNA結合，進而阻斷基因的轉錄、翻譯過程，最終抑制NF-κB的形成。設計針對NF-κB家族高保守區(qū)的核酶，可對編碼NF-κB的mRNA進行切割破壞，在mRNA水平阻斷NF-κB的形成。
上述以NF-κB為靶點的治療策略在動物實驗及體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中已表現(xiàn)出不同程度的療效。但上述措施均存在特異性欠佳的問題。事實上，要獲得最佳的治療效果并盡可能地減少系統(tǒng)毒性，則應注意NF-κB靶性治療的特異性。如糖皮質激素是NF-κB的強效抑制劑，但全身應用時具有擾亂內分泌和物質代謝的副作用[18]。而抗氧化劑對NF-κB活性的抑制效應更無特異性可言[19]，動物實驗表明，PDTC具有很強的毒副作用。蛋白酶小體，它除了可降解IκB外，還具有其他許多重要的功能，因此抑制蛋白酶小體活性將導致潛在的嚴重副作用[5]。盡管有學者認為IκK、IκB對NF-κB的調節(jié)是特異性的，但迄今的研究尚無足夠的證據(jù)表明IκK、IκB對其他的蛋白分子不具備調節(jié)作用，因此就不能確切的肯定靶向IκK、IκB的措施對NF-κB活性的干預就是特異性的。抑制NF-κB的合成策略對于NF-κB是特異性的，但在一些急性炎癥反應性疾病中，NF-κB的活化(而不是合成)過程(細胞質中無活性的NF-κB→活化入核→與DNA結合→啟動基因表達)更為重要，因此抑制NF-κB的合成策略并非最優(yōu)選擇。從NF-κB的整個活化途徑不難看出，NF-κB與DNA順式元件的結合是特異性的，也是NF-κB啟動靶基因轉錄的必經(jīng)之路。只有對NF-κB與DNA順式元件的結合實施直接的干預措施，才能達到真正意義上的特異性。而對NF-κB活化的上游途徑進行干預則難以達到這一目的。
由p50和p65兩亞基形成的異二聚體是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于體內所有細胞，其含量遠高于其它二聚體。此異二聚體的氨基末端可構成1個環(huán)狀結構域，由其介導與DNA堿基特異性結合。晶體衍射分析顯示，p50/p65異源二聚體與免疫球蛋白κ鏈基因增強子κB序列特異性結合的方式為p50亞單位的Arg-54、Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸殘基與κB序列5′端的5′-G-5G-4G-3A-2C-1-3′堿基系列特異結合；p65亞單位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，與κB序列3′端的5′-T+1T+2C+3C+4-3′4個堿基對特異結合。另外，由NF-kB P 50/p65異源二聚體的氨基端和二聚化結構域共同構成的環(huán)狀結構域，還可非特異地識別DNA核糖磷酸骨架[20]。即由p50和p65 N末端共同構成的這一環(huán)狀結構域形成了NF-κB的DNA結合結構域，介導其與順式作用元件的結合，值得注意的是，這鐘結合為特異性結合。NF-κB激活靶基因首先需要DNA結合結構域識別靶基因啟動子區(qū)域內的順式作用元件，并與之結合，后在p65反式激活域的輔助下，激活靶基因的表達。如果我們能夠阻斷NF-κB p65亞基與其順式作用元件的結合，則可阻斷含p65亞基的NF-κB異二聚體與其順式作用元件的結合，最終達到抑制NF-κB調控靶基因表達的目的。
隨著20世紀80年代后期崛起的一種研究蛋白質相互作用的有力工具——酵母雙雜交技術的建立、成熟和發(fā)展，對NF-κB拮抗多肽的篩選工作最終成為可能。酵母雙雜交系統(tǒng)具有很高的靈敏度，能檢測微弱而短暫的蛋白質間相互作用，且該系統(tǒng)中蛋白質的相互作用發(fā)生于酵母細胞胞內和/或核內。與原核細胞相比，真核酵母細胞對蛋白質的翻譯和加工更加接近哺乳細胞，以其為工程菌研究蛋白質的相互作用將更佳接近哺乳細胞的生理狀態(tài)，即保持蛋白質天然的折疊狀態(tài)，使蛋白質間相互作用更接近哺乳細胞內的真實水平。因此，應用該系統(tǒng)研究蛋白質間的相互作用已得到愈來愈廣泛的應用，特別對胞內靶蛋白相互作用蛋白或多肽的篩選，此系統(tǒng)更為首選[21]。NF-κB是核轉錄因子，存在于細胞漿中，但于細胞核內發(fā)揮轉錄調控功能。因此，我們選用酵母雙雜交系統(tǒng)，以NF-κB p65 DNA結合域為誘餌蛋白，從一個16肽的隨機肽庫中篩選NF-κB相互作用多肽，并鑒定這些多肽的功能。目前我們已篩選獲得兩組具有一致序列的NF-κB p65亞基拮抗肽，這里所列的是其中一組具有一致序列的NF-κB拮抗肽。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供能夠與核因子-κB p65亞基專一結合，并能夠抑制核因子-κB活性及其所調控基因表達的核因子-κB拮抗肽。
本發(fā)明的另一目的是提供這些核因子-κB拮抗肽的用途。
本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽具有以下通式結構X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16式中，X1代表任何氨基酸殘基；X2代表任何氨基酸殘基；X4代表任何氨基酸殘基或缺失；X7代表任何氨基酸殘基或缺失；X8代表任何氨基酸殘基或缺失；X9代表任何氨基酸殘基或缺失；X11代表任何氨基酸殘基或缺失；X12代表任何氨基酸殘基或缺失；X13代表任何氨基酸殘基或缺失；X14代表任何氨基酸殘基或缺失；X16代表任何氨基酸殘基；優(yōu)選的是
X2代表非極性氨基酸；X4代表非極性氨基酸；X7代表蘇氨酸；X8代表非極性氨基酸；X16代表亮氨酸或蘇氨酸；其他與上相同。
更優(yōu)選的是X2代表纈氨酸或丙氨酸；X4代表纈氨酸或異亮氨酸；X8代表纈氨酸或色氨酸；其他與上相同。
特別優(yōu)選的是X1代表Val；X2代表Val；X4代表Ile；X7缺失；X8缺失；X9缺失；X11缺失；X12缺失；X13缺失；X14缺失；X16代表Leu；其氨基酸序列為Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu。
或X1代表Leu；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；
X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe Thr。
或X1代表Pro；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe Thr。
或X1代表Thr；X2代表Gln；X4缺失；X7代表Thr；X8代表Trp；X9代表Arg；X11代表Glu；X12代表Cys；X13代表Cys；
X14代表Leu；X16代表Leu；其氨基酸序列為Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu。
其中“-”代表氨基酸缺失。
以上特別優(yōu)選的4個多肽結構如下PT1Val Val Met Ile Glu Val---Val----Phe LeuPT2Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe ThrPT3Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp Gly Phe ThrPT4Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu本發(fā)明還包括，本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應用。所述抗核因子-κB的藥物是治療免疫相關疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。
本發(fā)明還包括，含有本發(fā)明的核因子-κB p65亞基拮抗肽的藥物組合物。
具有上述結構模式的多肽可與核因子-κB p65亞基專一結合，并阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結合，從而抑制核因子-κB的生物學活性，即核因子-κB調控各種靶基因表達的活性。此類結構模式既可以多肽形式單獨存在，也可與其它蛋白和多肽融和，或插入蛋白質表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質連接。無論以什么形式存在，含此結構模式的物質可能表現(xiàn)出與核因子-κB p65亞基結合，并抑制核因子-κB活性的作用。
本發(fā)明通過對一組與核因子-κB p65亞基結合多肽的結構分析，確定了與核因子-κB p65亞基結合的氨基酸序列模式或稱結構模式，這對于設計和研制新型抗核因子-κB的藥物具有重要意義。
研究結果表明，本發(fā)明篩選到的多肽不僅能夠競爭性阻斷核因子-κB與其順式作用元件的結合，也能夠抑制核因子-κB所調控的靶基因的表達，因而可以成為新的抗核因子-κB藥物或藥物前體，本發(fā)明的多肽可以用于治療各種炎癥或免疫性相關疾病和腫瘤?？梢詫⑵渥鳛樗幬锘钚猿煞种苽涑伤幬锝M合物，該組合物根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的載體，可以采用制劑學常規(guī)技術制備該組合物，本發(fā)明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選的組合物是單位劑量的注射劑形式如凍干粉針劑。本發(fā)明的核因子-κB拮抗肽在制造抗核因子-κB的藥物中具有廣泛的應用價值及廣闊的市場前景。
另外，本發(fā)明的核因子-κB p65亞基結合肽作為生物制劑也有著潛在的應用價值，如作為配體用于核因子-κB的親和純化、作為探針用于核因子-κB的檢測等等。
根據(jù)核因子-κB p65亞基結合肽序列模式的多種存在形式，可以有多種獲取含此序列模式物質的方法，如固相合成方法，溶液中合成方法，基因重組方法，以及其它化學方法合成。以上制備方法可以采用多肽合成和制備的常規(guī)方法，如教科書中的方法，優(yōu)選的制備方法列在本發(fā)明的具體實施例中。
含此序列模式的物質可有各種應用方式，主要包括在體外和體內抑制核因子-κB的活性，以各種給藥方式實現(xiàn)以抑制核因子-κB活性為目的的疾病治療，以及核因子-κB的檢測或純化等。
含本發(fā)明序模式列的物質在生物醫(yī)學方面的應用還包括1、通過合成或基因重組的方式，將含此序列模式的肽段與其它蛋白或肽融合，用于以抑制核因子-κB活性為目的的各種炎性相關疾病、自身免疫疾病、腫瘤以及其它相關疾病的治療。
2、 將其與瓊脂糖偶聯(lián)后，用于核因子-κB的親和分離。
3、將其與指示標簽偶聯(lián)后，用于核因子-κB的鑒定。


圖1A為GST融合肽大腸桿菌表達結果。M為蛋白Marker；GST為pET-42a(+)空載體表達產(chǎn)物；1～4號分別與PT1～PT4 GST融合肽對應。
圖1B為GST融合肽GST親和層析純化的結果。M為蛋白Marker；GST為pET-42a(+)空載體表達產(chǎn)物；1～4PT1～PT4 GST融合肽。
圖2A為PT1/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結合的生物傳感器的檢測結果圖2B為PT2/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結合的生物傳感器的檢測結果圖2C為PT3/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結合的生物傳感器的檢測結果圖2D為PT4/GST融合肽與核因子-κBp65亞基結合的生物傳感器的檢測結果圖3為ELISA檢測GST融合肽與核因子-κBp65亞基的特異性結合的結果。GST為pET-42a(+)空載體表達產(chǎn)物；1～4號分別與PT1～PT4 GST融合肽對應。
圖4為ELISA方法檢測GST融合肽對核因子-κBp65亞基與核因子-κB順式作用元件結合的競爭抑制實驗的結果曲線圖5A為熒光素酶報告基因實驗檢測PT1穿膜肽對核因子-κB反應性熒光素酶報告基因表達的抑制效應。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5B為熒光素酶報告基因實驗檢測PT2穿膜肽對核因子-κB反應性熒光素酶報告基因表達的抑制效應。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5C為熒光素酶報告基因實驗檢測PT3穿膜肽對核因子-κB反應性熒光素酶報告基因表達的抑制效應。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
圖5D為熒光素酶報告基因實驗檢測PT4穿膜肽對核因子-κB反應性熒素酶報告基因表達的抑制效應。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+5μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+10μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+20μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+40μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+80μg/mL穿膜拮抗肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+160μg/mL穿膜拮抗肽。
具體實施例方式
實施例1、核因子-κB p65亞基拮抗肽的GST融合表達和純化根據(jù)PT1、PT2、PT3、PT4多肽的基因序列，在保持多肽蛋白編碼序列不變的情況下，按照大腸桿菌偏愛密碼子，分別設計并合成上游序列含BamHI，下游序列含SalI粘性末端的互補DNA片段，DNA序列如下PT1-FP5’-GATCGTTGTAATGATCGAAGTAGTTTTCCTGTAG-3’，PT1-RP5’-TCGACTACAGGAAAACTACTTCGATCATTACAAC-3’PT2-FP5’-GATCCTGGCGATGGTTGAAGTAACTGTTGTTCTGTCTTGGGGTTTCACTTAG-3’PT2-RP5’-TCGACTAAGTGAAACCCCAAGACAGAACAACAGTTACTTCAACCATCGCCAG-3’PT3-FP5′-GATCCCGGCGATGGTTGAAGTAACTGTTGTTCTGTCTTGGGGTTTCACTTAG-3′PT3-RP5′-TCGACTAAGTGAAACCCCAAGACAGAACAACAGTTACTTCAACCATCGCCGG-3′
PT4-FP5′-GATCCAGACTCAGATGGAAGTTACTTGGCGTGTTGAATGTTGCCTGTTCCTGTAG-3′PT4-RP5′-TCGACTACAGGAACAGGCAACATTCAACACGCCAAGTAACTTCCATCTGAGTCTG-3′用無菌雙蒸水將上述DNA序列溶解，終濃度為20μM，后取4個0.5ml EP管并標記為PT1、PT2、PT3和PT4，分別于PT1 EP中加入20μl PT1-FP和20μl PT1-RP，于PT2 EP中加入20μl PT2-FP和20μl PT2-RP，于PT3 EP中加入20μl PT3-FP和20μl PT3-RP，于PT4 EP中加入20μl PT4-FP和20μl PT4-RP，充分混合，后將混合物放入94℃水浴變性，室溫放置讓水浴自然冷卻，使多肽基因序列能夠緩慢退火形成雙鏈。后分別用T4連接酶將4條多肽基因序列插入經(jīng)BamHI/SalI雙酶切的pET 42a載體內，并轉化CaCl2法制備的E.coliDH-5α感受態(tài)細胞。各挑取數(shù)個單菌落進行酶切鑒定，并測序。分別將鑒定正確的重組質粒pET42a/PT1、pET42a/PT2、pET42a/PT3、pET42a/PT4轉化CaCl2法制備的E.coli.BL-21感受態(tài)細胞，挑取新鮮轉化的單菌落，接種于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100比例將過夜菌菌液轉接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.5～0.6，加IPTG至終濃度為0.1-0.5mmol/L，移至30℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體，菌體可進行純化或凍存于-70℃。將誘導表達的菌體按原菌液1/10的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF15μl后超聲破碎細胞(6×10sec×40hz)，后加入終濃度為1％的Triton X-100，輕輕振蕩20min，于4℃，12000r/m離心15min取上清，加DTT至終濃度為1mmol/L。同時用10倍柱體積的PBS液平衡Glutathione Sepharose4B親和樹脂，后取適量的上述上清液上柱，使GST融合肽蛋白與樹脂結合，再用10倍柱體積的PBS液洗去非特異結合的雜蛋白。最后用10mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白，并通SDS-PAGE鑒定其純度，純化蛋白經(jīng)蒸餾水充分透析去除還原型谷胱甘肽后凍干于-20℃保存。SDS-PAGE電泳結果表明，4條GST融和多肽為可溶性表達，表達量約為總蛋白量的20％(圖1A)。經(jīng)GST親和純化后融和蛋白純度達到85％以上(圖1B)實施例2、生物傳感器(Biosensor)檢測GST融合肽與核因子-κB p65亞基的結合將羧甲基葡聚糖生物傳感片裝入Iasys Plus系統(tǒng)微射流卡盤，用60μl PBS/T(pH 7.4PBS，0.05％吐溫20)沖洗3次，平衡10min，待基線走平后采集基線數(shù)據(jù)5min；將EDC和NHS按1∶1比例混合，取40μl混合液沖洗樣品池2次，后再在樣品池中加入40μl混合液，保留7min以激活傳感片表面；用50μl PBS/T沖洗樣品池3次采集基線值1min；用40μl 10mM pH5.5的乙酸緩沖液沖洗樣品池3次，后再加入40μl乙酸緩沖液，采集基線值1min；然后在樣品池中加入40μl用乙酸緩沖液稀釋的總量約為0.5μg的p65標準蛋白；反應20min后用PBS/T沖洗3次，并采集基線值1min；用40μl 1M pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液沖洗樣品池3次，并保留3min以封閉未反應的NHS；用40μl 10mM HCl沖洗3次，除去傳感片上殘留的沒用發(fā)生共價結合的p65標準蛋白；用50μl PBS/T沖洗3次，采集基線值1min，4℃放置待后進行結合反應。
用蛋白結合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)將GST-結合肽融合蛋白稀釋成10μg/L，取50μl融合蛋白稀釋液加入樣品池，溫度25℃，結合反應5～10min；待反應完全，用50μl蛋白結合緩沖液沖洗樣品池3次，以洗脫非特異性結合，待反應曲線走平后采集反應曲線值1min；用40μL10mM HCl沖洗樣品池3次，再生傳感片；再用50μl蛋白結合緩沖液沖洗樣品池3次，采集基線數(shù)據(jù)1min，開始新一輪的結合反應。
Biosensor結果表明，本發(fā)明的4條p65拮抗多肽均能高親和與p65結合，其中PT3多肽與p65結合的親和力最強，見圖2A～2D。
實施例3、ELISA方法檢測GST融合肽與核因子-κB p65亞基的特異性結合用去離子水洗ELISA平板包被孔數(shù)次，倒置平版，并在一清潔濾紙上拍打平板，去除剩余的水份；用PBS緩沖液稀釋p65蛋白，濃度為10μg/ml；加100μl稀釋的p65蛋白至96孔酶聯(lián)板的包被孔中，室溫孵育3～4h或4℃過夜孵育，注意水份蒸發(fā)；用300μl PBS洗孔3次，去除未結合的p65蛋白；制備5％的脫脂奶粉水溶液，每孔加入200μl，室溫孵育1h或4℃過夜孵育封閉包被孔；用蛋白結合緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl，10mM MgCl2，10uM ZncL2，1mM DTT，0.1％(v/v)NP40)洗板5次；加入0.5μmol/L的GST融合肽(蛋白結合緩沖液稀釋)100μl/孔(除未包被的對照孔外，設置加GST融合肽同時加入系列濃度的p65蛋白作為對照，以檢測GST融合肽與p65蛋白的特異性結合。)，室溫結合1h；PBST(PBS+0.1％TWEEN-20)洗板3次后加入抗GST的單克隆抗體(1∶1000稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(按產(chǎn)品說明要求稀釋于PBS中)100μl/孔，室溫孵育1h；PBST洗板3次后加入顯色液100μl/孔避光保存顯色5～10min，加入1mol/L H2SO450μl/孔終止反應，立即測定OD450。
結果表明，本發(fā)明的短肽PT1、PT2、PT3和PT4均可特異性地與P65結合，隨著p65加入量的增加，多肽與包被蛋白的結合減少，見圖3。
實施例4、ELISA方法檢測GST融合肽對核因子-κB p65亞基與核因子-κB順式作用元件結合的競爭抑制實驗于包被了核因子-κB順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Clontech公司的MercuryTMTransfactor p65 kits)中加入150μl/孔轉錄因子封閉液，室溫孵育15min；棄轉錄因子封閉液后加入50μl/孔用轉錄因子封閉液稀釋的檢測樣品，樣品分別為含10ng/μl的p65標準蛋白作為陽性對照、含10ng/μl的p65標準蛋白同時加入系列濃度GST融合肽以及含10ng/μl的p65標準蛋白同時加入相同系列濃度GST純化蛋白的樣品，室溫孵育1h，空白對照為加入50μl轉錄因子封閉液；加入轉錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉錄因子封閉液以1∶500稀釋的p65抗體100μl/孔，室溫孵育1h；加入轉錄因子封閉液150μl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉錄因子封閉液以1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室溫孵育30min；加入轉錄因子緩沖液250μl/孔洗滌4次，每次4min，去除洗滌液；加入TMB底物，室溫孵育10min，待液體變藍后，用100μl/孔的終止液終止反應；于450nm和630nm雙波長檢測OD值。P65結合肽對p65與其順式作用元件結合的抑制百分數(shù)計算公式為(同一濃度GST純化蛋白OD-同一濃度GST融合肽OD)/p65標準蛋白陽性對照OD。
結果表明，本發(fā)明的短肽PT1、PT2、PT3和PT4均可特異性抑制P65與其順式作用元件的結合，而這種抑制效應具有量效關系，既抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，而GST則不影響P65與其順式作用元件的結合。在4條多肽中PT3的抑制效應優(yōu)于其它3條，如圖4所示。
實施例5、多肽的有機合成因為核因子-κB拮抗肽只有進入細胞內才能有效抑制核因子-κB的轉錄活性及炎癥相關基因的表達，為此我們分別將穿膜肽(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)與PT1、PT2、PT3和PT4融合，并采用有機合成的方法合成這4條融合多肽(由深圳翰宇生物工程有限公司合成)，工藝流程如下1)稱1g(0.01mmol)Rink樹脂置于反應器中，用DMF溶脹30min，濾去DMF；2)向樹脂中加入5mL 20％哌啶-DMF溶液，反應10min，脫除Fmoc保護基，然后濾去脫保護試劑；3)用DMF和甲醇交替洗滌樹脂3次(5mL×3，1min)，再用DMF洗滌1次；4)將Fmoc-AA-OH(0.4mmol)，HBTU(0.4mmol)，HOBT(0.4mmol)和N-甲基嗎啉(0.6mmol)溶于適量DMF，加入樹脂中，于35～40℃恒溫搖床中振搖反應1h；5)濾除反應液，洗滌同3)，再用乙醚(5mL×2，1min)洗滌，抽干；取2～3粒樹脂，用茚三酮法檢測是否有自由氨基；如果結果為陰性；進入下一循環(huán)；否則重復4)～6)；7)循環(huán)操作2)～6)，依次分別按穿膜肽與PT1、PT2、PT3和PT4的融合多肽的氨基酸序列自C-端至N-端序列加入Fmoc-AA-OH和縮合試劑，直到肽鏈組裝完畢；8)最后脫除Fmoc，操作同2)；9)用DMF、甲醇、冰乙酸、DMF和無水乙醚充分洗滌樹脂，干燥保存；10)將合成好的多肽經(jīng)過G10柱脫鹽和HPLC純化，冷凍干燥保存。其純度分別為82.3％、79.6％、85.3％、88.8％，將其溶解于DMSO中，濃度為20mmol/L。
實施例6、核因子-κB p65亞基拮抗肽對核因子-κB反應性報告基因表達的抑制實驗。
1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細胞，轉染前一天將細胞密度調整為0.5～2.5×105個/mL，過夜培養(yǎng)；取3mL過夜培養(yǎng)細胞或以1-2×105個細胞/孔細胞量加入6孔培養(yǎng)板；取3μL GeneJuice轉染試劑加入100μL無血清1640培養(yǎng)基中，旋渦混勻，室溫放置5min；取1μg p4-kB-Luc質粒加入GeneJuice/1640培養(yǎng)基混合物中，輕輕吹打混勻，室溫放置5-15min；將上述混合物逐滴加入完全培養(yǎng)基中，輕輕震蕩，使混合物和細胞充分混勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉染5h后，加入終濃度為1μg/mL的LPS進行刺激，同時加入系列濃度(0、1、5、10、20、40、80、160μg/mL)的穿膜拮抗肽，2h后吸取細胞500g離心5min，PBS洗滌細胞一次，除盡PBS上清；以100μl/孔加入1×CCLR細胞裂解緩沖液；渦旋EP管10-15s，4℃，12000rpm離心2min，取上清，-70℃保存或直接檢測熒光素酶的活性；于96孔檢測板中加入100μL/孔熒光素酶檢測試劑后，再加入100μL/孔細胞裂解液后立刻讀數(shù)，并打印或記錄數(shù)據(jù)。
結果表明，本發(fā)明的短肽穿膜肽Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys與PT1、PT2、PT3和PT4的融合多肽均具有抑制核因子-κB反應性熒光素酶報告基因表達的效應，且這種抑制效應具有量效關系，既抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，且這種穿膜PT3拮抗肽的抑制效應最強，如圖5A-D所示。由此說明，我們篩選獲得的p65拮抗肽具有抑制核因子-κB轉錄活性的功能，既也具有抗炎功能。
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序列表<110>徐祥 梁華平<120>核因子-κB p65亞基拮抗肽及其應用<160>8<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>1Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu1 59<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>2Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val Val Leu Ser TRP Gly Phe Thr1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>3Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val Val Leu Ser TrP Gly Phe Thr1 5 10 15
<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>4Thr Gln Met Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys Leu Phe Leu15 10 15<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>5gttgtaatga tcgaagtagt tttcctgtag 30<210>6<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>6ctggcgatgg ttgaagtaac tgttgttctg tcttggggtt tcacttag 48<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>7ccggcgatgg ttgaagtaac tgttgttctg tcttggggtt tcacttag 48
<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>8cagactcaga tggaagttac ttggcgtgtt gaatgttgcc tgttcctgta g 5權利要求
1.具有以下通式結構的核因子-κB p65亞基拮抗肽X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16式中，X1代表任何氨基酸殘基；X2代表任何氨基酸殘基；X4代表任何氨基酸殘基或缺失；X7代表任何氨基酸殘基或缺失；X8代表任何氨基酸殘基或缺失；X9代表任何氨基酸殘基或缺失；X11代表任何氨基酸殘基或缺失；X12代表任何氨基酸殘基或缺失；X13代表任何氨基酸殘基或缺失；X14代表任何氨基酸殘基或缺失；X16代表任何氨基酸殘基；
2.根據(jù)權利要求1的核因子-κB p65亞基拮抗肽，具有以下結構，X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16其特征在于，式中X2代表非極性氨基酸；X4代表非極性氨基酸；X7代表蘇氨酸；X8代表非極性氨基酸；X16代表亮氨酸或蘇氨酸；其他與權利要求1相同。
3.根據(jù)權利要求2的核因子-κB p65亞基拮抗肽，具有以下結構，X1-X2-Met-X4-Glu-Val-X7-X8-X9-Val-X11-X12-X13-X14-Phe-X16其特征在于，式中X2代表纈氨酸或丙氨酸；X4代表纈氨酸或異亮氨酸；X8代表纈氨酸或色氨酸；其他與權利要求2相同。
4.根據(jù)權利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Val；X2代表Val；X4代表Ile；X7缺失；X8缺失；X9缺失；X11缺失；X12缺失；X13缺失；X14缺失；X16代表Leu；其氨基酸序列為Val Val Met Ile Glu Val Val Phe Leu。
5.根據(jù)權利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Leu；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Leu Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp GlyPhe Thr。
6.根據(jù)權利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Pro；X2代表Ala；X4代表Val；X7代表Thr；X8代表Val；X9缺失；X11代表Leu；X12代表Ser；X13代表Trp；X14代表Gly；X16代表Thr；其氨基酸序列為Pro Ala Met Val Glu Val Thr Val-Val Leu Ser Trp GlyPhe Thr。
7.根據(jù)權利要求3的核因子-κB p65亞基拮抗肽，其特征在于，X1代表Thr；X2代表Gln；X4缺失；X7代表Thr；X8代表Trp；X9代表Arg；X11代表Glu；X12代表Cys；X13代表Cys；X14代表Leu；X16代表Leu；其氨基酸序列為Thr Gln Met-Glu Val Thr Trp Arg Val Glu Cys Cys LeuPhe Leu。
8.權利要求1-7中任意一項的核因子-κB p65亞基拮抗肽在制備抗核因子-κB的藥物中的應用。
9.權利要求8的應用，所述抗核因子-κB的藥物是治療免疫相關疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。
10.含有權利要求1-7中任意一項的核因子-κB p65亞基拮抗肽的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及核因子－κB p65亞基拮抗肽及其應用，特別是涉及一組治療用核因子－κB(NF－κB)p65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一組能夠與核因子－κB p65亞基特異結合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這些核因子－κB p65亞基拮抗肽的制備和應用。
文檔編號A61P29/00GK1683395SQ200510007479
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權日2005年2月22日
發(fā)明者徐祥, 梁華平, 王正國 申請人:徐祥, 梁華平