專利名稱：用于局部治療皮膚細(xì)胞增生疾病的核苷酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于局部治療牛皮癬及由皮膚細(xì)胞增生過(guò)度造成的其它疾病的制劑。具體地，本發(fā)明涉及利用含有核苷類似物、抗增生核苷和DNA鏈封端的二脫氧核苷的磷酸酯的制劑治療牛皮癬及其它皮膚疾病。
牛皮癬是人皮膚良性疾病，其特征一般在于斑塊被增厚的鱗屑覆蓋。該疾病是由未知原因的表皮細(xì)胞增生增加引起的。在正常皮膚中，細(xì)胞從底層移至上部顆粒層所需的時(shí)間大約為五周；而在牛皮癬中，部分由于增生細(xì)胞數(shù)量的增多以及分裂細(xì)胞比例的增加，此時(shí)間僅為6至9天(G.Grove,Int.J Dermatol 18:111,1979)。美國(guó)人口中大約有2％的人患有牛皮癬，其中大約有3％高加索美國(guó)人，大約1％非洲美國(guó)人，而很少本土美國(guó)人患有此疾病。
與炎癥有關(guān)的表皮增生是牛皮癬皮膚的特征。感染區(qū)域的皮膚活組織檢查顯示出隨核片段保留的角膜肥厚，隨著有缺陷角化的增生增加以及慢性炎癥浸潤(rùn)。(參見(jiàn)E.A.Bauer,M.Tabas和J.B.Goslen，內(nèi)科醫(yī)學(xué)課本(Texbook of Internal Medicine),W.N.Kelly(編輯),1989,pp1042-1045)。隨著細(xì)胞增生增加，感染組織中DNA合成增加，所述感染組織已是用于評(píng)估治牛皮癬藥的效力測(cè)定的基礎(chǔ)。
盡管已報(bào)道過(guò)具有牛皮癬臨床和病理組織學(xué)特征的稀有靈長(zhǎng)類(N.J.Lowe,Drug Dev.Res.13:147-155,1988)，卻沒(méi)有公認(rèn)的用于牛皮癬的動(dòng)物模型。因此治療牛皮癬藥物的研究依賴于經(jīng)受易剝落皮膚的自發(fā)突變(fsn)的動(dòng)物或小鼠菌株中的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)增生(J.P.Sundberg等人，J.Invest.Dermatol 92:414,1989)。用于與表皮增生有關(guān)的疾病的另一個(gè)小鼠模型是必須脂肪酸缺乏(EFAD)的無(wú)毛小鼠。
實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的動(dòng)物模型還包括無(wú)胸腺裸體小鼠，該小鼠具有免疫學(xué)缺陷并移植有疾病的人皮膚。
當(dāng)今的治療法是由降低細(xì)胞迅速增生和減少炎癥的嘗試組成的。這些治療法包括局部地、系統(tǒng)地使用活性劑，或者兩者，這種治療法可任意地結(jié)合照射。局部治療包括使用類固醇膏以及在紫外線照射(UVB,290-320nm)之后使用煤焦油軟膏。人們已在局部用5-氟尿嘧啶上取得了一些成功，但是這種治療會(huì)引起形成嚴(yán)重的紅斑、水腫、大皰以及在治療區(qū)域皮膚潰瘍，因此不能很好地被患者接受(C.J.McDonald,Pharmac.Ther.14:1-24,1981)。在牛皮癬患者皮膚上曾局部試驗(yàn)過(guò)TriazureTM(6-氮雜尿苷三乙酸酯)，但是沒(méi)有效果(William Drell，個(gè)人通訊(personal commuication),1993年5月)。
包括氨甲喋呤、6-氮雜尿苷和氮尿苷乙酯的抗增生劑也曾被系統(tǒng)地使用過(guò)。大面積的牛皮癬已通過(guò)口服，8-甲氧基補(bǔ)骨脂素-一種光敏劑，接著進(jìn)行紫外線A(320nm)照射或服用類視色素如阿維A酯，接著進(jìn)行紫外線A照射治療(C.J.McDonald,Pharmac.Ther.14:1-24,1981；E.A.Bauer,M.Tabas和J.B.GoSlen,in Textbook of Internal Medicine,W.N.Kelly(ed.),1989,pp 1042-1045)。由皮膚細(xì)胞增生引起的其它疾病包括特應(yīng)性皮炎、扁平苔癬、光化性角化病、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌?？乖錾塑蘸投撗鹾塑占捌漕愃莆锏牧姿狨サ木植坑猛具€沒(méi)有被報(bào)道用于治療牛皮癬或由皮膚細(xì)胞增生引起的其它疾病。
相關(guān)的PCT公開(kāi)WO94/26273公開(kāi)了抗皰疹核苷的磷酸酯如阿昔洛韋在由突變病毒菌株感染的動(dòng)物中是有效的，其中由于突變感染病毒酶、胸苷激酶，阿昔洛韋不能轉(zhuǎn)變成阿昔洛韋磷酸酯。
本發(fā)明提供了治療牛皮癬及由皮膚細(xì)胞增生引起的其它疾病的方法，該方法包括局部應(yīng)用含有具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽作為活性成分的組合物
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。該方法可通過(guò)使用含有具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽作為活性成分的組合物而進(jìn)行
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為2。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷或核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥(niǎo)苷(guanosine arabinoside)、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結(jié)核菌素、2＇-脫氧同型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋；根據(jù)本發(fā)明的方法，組合物中活性成分的濃度為0.001gm％至100gm％；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中活性成分的濃度為0.01gm％至10gm％；在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中活性成分的濃度為0.1gm％至5gm％。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在皮膚區(qū)域中每天應(yīng)用組合物1至10次，每次應(yīng)用劑量為0.001gm％至100gm％。另一種方法是在皮膚區(qū)域中每天應(yīng)用組合物1至10次，每次應(yīng)用劑量為0.01gm％至10gm％。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在皮膚區(qū)域中每天應(yīng)用組合物1至10次，每次應(yīng)用劑量為0.1gm％至5gm％。
本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，該組合物包含所述方法中的核苷類似物磷酸酯作為活性成分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物還含有丙二醇、聚乙二醇400和聚乙二醇3350。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還含有在局部應(yīng)用中能夠增強(qiáng)皮膚滲透的成分。
本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法中的抗增生核苷類似物的磷酸酯。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷類似物為氨基磷酸酯或硫代磷酸酯和/或亞甲基磷酸酯或硫代膦酸酯。
本發(fā)明提供了抗增生核苷的磷酸酯，如2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、胞苷或鳥(niǎo)苷阿糖苷、6-氮雜尿苷、6-巰基嘌呤核苷、5-氟尿苷、5-氟脫氧尿苷、阿昔洛韋、更昔洛韋、二脫氧胞苷及其它二脫氧核苷和鏈封端的核苷類似物；當(dāng)它們被局部應(yīng)用時(shí)，其在降低細(xì)胞增生速率和消除牛皮癬皮膚中的淋巴細(xì)胞上令人驚奇和不尋常地有效。
一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯具有下列通式
其中N為抗增生核苷類似物；Z為O、S或NH；以及n為1或2；或者它們具有下式
其中N為抗增生核苷類似物；Z為O、S或NH；X為O、CH2或S；以及n為1、2或3。
因此，所述磷酸酯可以是磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphothiorate)或氨基磷酸酯，二酯和三酯可以具有除氧原子之外的橋原子，如2,3-μ-硫代三磷酸酯或2,3-μ-亞甲基二磷酸酯。
與預(yù)期的結(jié)果相反，這些核苷類似物磷酸酯能夠令人驚奇地通過(guò)增生過(guò)度皮膚細(xì)胞的細(xì)胞膜并通過(guò)抑制嘌呤和嘧啶、核苷酸、RNA和DNA的生物合成中的各種酶步驟，可以降低細(xì)胞分裂速率。另外，化合物2-氯脫氧腺苷磷酸酯和2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷磷酸酯特別適用于治療牛皮癬炎癥部分，這是因?yàn)槠湟种拼嬖谟谂Ｆぐ_患者皮膚炎癥浸潤(rùn)物中的淋巴細(xì)胞和單核白血細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。本發(fā)明還提供了核苷類似物一-、二-和三磷酸酯的藥物制劑，其中所述磷酸酯的濃度應(yīng)當(dāng)能夠在局部應(yīng)用時(shí)有效地降低牛皮癬皮膚細(xì)胞的增生。當(dāng)以適當(dāng)?shù)木植恐苿┯糜谄つw時(shí)，DNA鏈封端的二脫氧核苷磷酸酯能夠類似地降低牛皮癬細(xì)胞的增生。它們包括阿昔洛韋、更昔洛韋、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷、3＇-疊氮二脫氧胸苷(AZT)及其它二脫氧核苷類似物，如未決美國(guó)專利申請(qǐng)SN07/373,088中所描述的那些，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
當(dāng)局部施用時(shí)可用作治牛皮癬藥的另外的核苷磷酸酯包括核苷酸代謝(Nucleotide Metabolism)(J.F.Henderson&A R.P.Paterson,AcadeicPress,1973,pp 266-271)中所羅列的那些。
這些化合物的鹽可容易地制得，這類鹽必須在水介質(zhì)(如膏、膠體或其它水分散體)中顯示出很強(qiáng)的溶解性。這些化合物的典型的有用鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽或氫鹽。也可使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的生理可接受的陽(yáng)離子。而且，這類鹽在提供良好的粘膜或皮膚分散相的聚乙二醇膏劑和洗液是有用和有效的。
局部用組合物本發(fā)明的另一方面提供了用于局部治療牛皮癬的方法，該方法包括將含有本發(fā)明核苷類似物磷脂酸的組合物應(yīng)用于感染患者皮膚的牛皮癬損害處。
如前所述的局部應(yīng)用的本發(fā)明核苷類似物磷酸酯、二脫氧核苷和鏈封端的核苷磷酸酯可通過(guò)引入各種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的組合物而制得，所述公知的組合物是指皮膚病學(xué)用途中有用和方便的組合物。核苷磷酸酯通常比相應(yīng)的堿更溶于水，因此，水溶液、油包水乳液或水膏是非常優(yōu)選的制劑。本發(fā)明核苷類似物磷酸酯的水溶性可通過(guò)制備其鹽如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽或氫鹽而得到提高。在特別優(yōu)選的組合物中，活性成分是在聚乙二醇(PEG)媒介物中制得的。另外，通過(guò)利用不溶性粉末如淀粉或滑石粉作為稀料或載體，可以以干粉制劑形式局部應(yīng)用活性成分。
由于媒介物可選擇成能夠提高滲透性、延長(zhǎng)活性持續(xù)時(shí)間或滿足用藥位置的要求，所以媒介物是一些局部用組合物中的重要成分。例如，應(yīng)用于身體胼胝部位如手掌或腳底的制劑可包括提高滲透劑如二甲基亞砜、丙二醇或AzoneTM。另外，粉狀組合物可選擇成適用于擦爛區(qū)域如人體兩腿分叉處、內(nèi)肘或手指或腳趾之間。組合物也可制成含有各種有機(jī)聚合物或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它組合物，從而得到活性治牛皮癬衍生物的持續(xù)釋放。
大量適合的局部用組合物可在藥物化學(xué)家公知的處方集中找到Blaug,S.,Ch.87 in Remington＇s Pharmaceutical Sciences(15th Ed.,1975,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042)。這些組合物包括如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、類脂、無(wú)水吸收劑、水包油或油包水乳劑、碳蠟乳劑(不同分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含碳蠟的半固體混合物。
本發(fā)明局部用組合物中活性成分的濃度可為約0.001gm％至100gm％，優(yōu)選約0.01gm％至10gm％，最優(yōu)選約0.1gm％至約5gm％。該組合物可進(jìn)一步包括有效濃度的有助于促進(jìn)皮膚滲透和愈合的其它試劑，正如上述參考處方集中描述及本領(lǐng)域高普通技術(shù)人員公知的那些。
含有本發(fā)明活性核苷類似物磷酸酯的局部用組合物的效力可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)試驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)估。這些包括使用模擬動(dòng)物模型(如表皮增生)和其它體內(nèi)預(yù)測(cè)測(cè)定(N.J.Lowe,Drug Dev.Res.13:147-155,1988)。
組合物可重復(fù)應(yīng)用于感染皮膚的牛皮癬損害處，如每天一次、兩次或幾次；治療可延續(xù)數(shù)天，直至達(dá)到愈合。其發(fā)生毒性和過(guò)敏的危險(xiǎn)是最小的。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷是由2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖腺苷、6-氮雜尿苷、5-氟尿苷或5-氟脫氧尿苷、鳥(niǎo)苷阿糖苷或二脫氧核苷及局部膏劑組成的，所述局部膏劑是由含聚乙二醇3350、聚乙二醇400和丙二醇或乙二醇的混合物組成的。
核苷類似物是由下列物質(zhì)組成的胞苷或鳥(niǎo)苷阿糖苷、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷和DNA鏈封端二脫氧核苷，如二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧肌苷，以及二脫氧核苷類似物，如PCT公開(kāi)WO90/00555中描述的化合物及相關(guān)化合物2-氯脫氧腺苷和2-氯-2＇-阿糖氟脫氧腺苷和2-氟阿糖脫氧腺苷。當(dāng)以一-、二-或三磷酸酯傳遞時(shí)，能夠抑制表皮細(xì)胞DNA聚合物酶的其它核苷類似物包括2＇-脫氧殺結(jié)核菌素、2＇-脫氧間型霉素和2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶。
可用作局部給用治牛皮癬藥的另外的化合物包括下列核糖核苷和脫氧核糖核苷衍生物的一-、二-和三磷酸酯8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、6-甲基巰基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤、8-氮雜黃嘌呤、間型霉素、狹霉素C、德夸菌素A、二甲苯酰腺苷、6-氯嘌呤、6-氮雜尿嘧啶、5-氟胞苷或5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和5-溴尿嘧啶；以及包括3＇-脫氧腺苷、脫氧木吡喃糖基胸苷、脫氧葡糖吡喃糖基胸苷和阿糖胞苷(化學(xué)結(jié)構(gòu)可參見(jiàn)核苷酸代謝，J.F.Henderson&A.R.P.Paterson,Academic Press,1973,pp.266-271)的一-、二-和三磷酸酯。
局部用藥物評(píng)估的測(cè)定1．表皮DNA合成抑制測(cè)定。由于增加的DNA合成是以牛皮癬皮膚中的表皮增生為特征，所以向利用藥劑治療的皮膚組織中摻入放射性DNA前體已被用于評(píng)估由藥劑引起的DNA合成的抑制程度。簡(jiǎn)而言之，將局部用載體中的治牛皮癬藥應(yīng)用于無(wú)胸腺小鼠區(qū)域中，其中利用本領(lǐng)域中公知技術(shù)已將患有牛皮癬的人真皮和表皮移植到所述區(qū)域上。類似地，將可將EFAD無(wú)毛小鼠模型用在測(cè)定中，從而測(cè)得抗增生藥物的效果。大約在治療6小時(shí)后，切除治療過(guò)的組織，將其置于含3H-胸苷脫氧核糖或3H-溴脫氧尿苷的組織培養(yǎng)基中進(jìn)行0.1-5小時(shí)的脈沖標(biāo)記。然后利用常規(guī)方法分離DNA，通過(guò)測(cè)定所分離DNA中的放射性(cpm/μgDNA)測(cè)量摻入到DNA中的3H-胸苷脫氧核糖或3H-溴脫氧尿苷量。通過(guò)比較從未治療組織摻入到DNA中的放射性與利用不同治牛皮癬藥的組合物(活性成分的％增加)的DNA放射性，可測(cè)定治牛皮癬藥抑制增生的效力。
2．多胺生物合成抑制測(cè)定。該測(cè)定基于表皮細(xì)胞中存在的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的量。ODC是在多胺形成中限制速率的酶，所述多胺通常在增生中增加，所述增生包括與牛皮癬有關(guān)的表皮增生。通過(guò)角質(zhì)層帶的剝脫(Lesiewicz等人，Models in Dermatology,vol,2,pp112-116(H.I.Maibach&N.J.Lowe,eds.),1985)，或通過(guò)應(yīng)用佛波醇酯(12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯或TPA)，也可引起ODC活性增加。
3．皮膚活組織檢查。在1-15天內(nèi)利用治牛皮癬藥物治療EFAD無(wú)毛小鼠、fsn/fsn易剝落皮膚小鼠或用患牛皮癬的人皮膚移植的無(wú)胸腺小鼠，檢查被治療的皮膚，從而得到牛皮癬的粗指征(皮膚的剝落、炎癥的紅腫性等)，然后利用活組織檢查進(jìn)行分析，在顯微鏡下利用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法可計(jì)數(shù)表皮細(xì)胞層的數(shù)量。將表皮細(xì)胞層的數(shù)量與類似的正常未治療牛皮癬皮膚進(jìn)行比較，從而確定利用治牛皮癬藥物治療的效果。再者，通過(guò)測(cè)定表皮毛細(xì)管中的白血細(xì)胞(即中性白細(xì)胞和/或單核白細(xì)胞)數(shù)量及相對(duì)于未治療牛皮癬皮膚和正常對(duì)照皮膚的毛細(xì)管擴(kuò)張，可以定量組織中的炎癥相對(duì)程度。
類似地，利用皮膚活組織檢查和顯微鏡檢查的人臨床試驗(yàn)可通過(guò)使用具有少量應(yīng)用于大約3cm直徑皮膚區(qū)域(如前臂或腿上)的治牛皮癬藥劑的兩側(cè)成對(duì)比較而進(jìn)行。特別優(yōu)選兩側(cè)成對(duì)比較以避免由治療區(qū)域到非治療對(duì)照區(qū)域的交叉作用的危險(xiǎn)。
4．使用易剝落皮膚小鼠。將經(jīng)受易剝落皮膚的自發(fā)突變(fsn/fsn)的近親繁殖的小鼠發(fā)展成白色鱗狀皮膚，在斷奶后，該鱗狀皮膚隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷地增厚，由此形成增生性皮膚疾病，特別是牛皮癬。到42天的年齡時(shí)，小鼠顯示出帶有多層底膜和炎癥的表皮增生，這是通過(guò)白血細(xì)胞和彎曲皮膚血管的增加測(cè)定的，所有這些特征均是人牛皮癬的特征。這些小鼠可用作確定利用局部應(yīng)用核苷磷酸酯的治療效力的人牛皮癬模型。將包括核苷磷酸酯的組合物應(yīng)用于fsn/fsn小鼠的背側(cè)或腹側(cè)皮膚的1-5mm部分，并且從12小時(shí)至后來(lái)的15天內(nèi)粗略地和顯微地觀察皮膚，從而利用常規(guī)皮膚病學(xué)和組織學(xué)方法確定表皮增生的程度和上述所出現(xiàn)的牛皮癬皮膚的其它癥狀。與未治療的小鼠的類似部分進(jìn)行相關(guān)的比較，與其它未治療的fsn/fsn小鼠進(jìn)行比較，與利用只含載體成分而沒(méi)有核苷磷酸酯的組合物治療的fsn/fsn小鼠進(jìn)行比較，以及與fsn位點(diǎn)類似治療的非突變小鼠進(jìn)行比較。
5．角化細(xì)胞標(biāo)記。蛋白質(zhì)表達(dá)的變化和與牛皮癬皮膚相關(guān)的增生變化是一致的。用于檢測(cè)皮膚異常疾病的兩種分子是角蛋白和細(xì)絲蛋白(filaggrm)?；可媳砥ぶ械奶貏e小鼠角蛋白K6的聚集為一般與增生相關(guān)的分子變化。在無(wú)毛EFAD小鼠或fsn/fsn小鼠中，基于抗體的檢測(cè)K6的方法可用于確定基部上表皮中所出現(xiàn)的分子以及該分子的量，因此可用作治療牛皮癬藥物效力的標(biāo)記。
細(xì)絲蛋白是表皮中的一種蛋白質(zhì)，它通常與顆粒層和過(guò)渡細(xì)胞中的角質(zhì)透明蛋白顆粒有關(guān)，但這種細(xì)絲蛋白在上部角化細(xì)胞中消失。然而，在fsn/fsn小鼠中，細(xì)絲蛋白仍以過(guò)渡細(xì)胞的模型特征保持存在于表面細(xì)胞層中。正如由抗細(xì)絲蛋白抗體檢測(cè)和/或通過(guò)顯微觀測(cè)的那樣，上部角化細(xì)胞中存在細(xì)絲蛋白是牛皮癬細(xì)胞的特征，可用于評(píng)估應(yīng)用于fsn/fsn小鼠皮膚的治療牛皮癬藥物的效力。
合成選擇的嘌呤和嘌呤核苷類似物。本文綜述了合成一些抗增生嘌呤和嘌呤核苷類似物的具體方法，所述嘌呤和嘌呤核苷類似物可用作治療牛皮癬的磷酸酯。另外的化合物和合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。有代表性的方法公開(kāi)在RK Robins和G.D.Kini，抗腫瘤藥化學(xué)(TheChemistry of Antitumour Agents)(D.E.V.Wilman編),1990,p299-321中。
(1)嘌呤類似物在高溫下，在1,2,3,4-四氫化萘中利用五硫化磷處理次黃嘌呤，合成6-巰基嘌呤。
在回流吡啶中利用五硫化磷處理鳥(niǎo)嘌呤，可合成6-硫代鳥(niǎo)嘌呤。
通過(guò)在咪唑[4,5-c]吡啶環(huán)系中閉環(huán)適當(dāng)取代的3,4-二氨基嘧啶，合成3-脫氮腺苷、3-脫氮次黃嘌呤和3-脫氮-6-巰基嘌呤(Robbins,R.K.等人，J.Org.Chem.28:3041,1963)。
當(dāng)利用三氯氧化磷使得5(4)-氨基甲?；谆溥?4(5)-羧酸甲酯脫水，制備經(jīng)液氨處理環(huán)化的5(4)-氰基甲基咪唑-4(5)-羧酸甲酯時(shí)，可合成3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤。
(2)嘌呤核苷利用催化劑氯化汞，縮合6-甲基巰基嘌呤和2,3,5-三-O-乙?；?D-核糖-呋喃糖基氯，接著進(jìn)行脫乙酰作用，可合成6-甲基巰基嘌呤核苷。另外，6-甲基巰基嘌呤核苷可由甲基化6-硫代肌苷直接制得(Fox,J.J.等人，J.Am.Chem.Soc.80:1669,1958)。
9-β-D-阿糖呋喃糖基腺嘌呤(ara-A)可由下列步驟合成利用甲磺酰氯處理9-(β-D-木呋喃糖基)腺嘌呤的3＇,5＇-二-O-異亞丙基衍生物，使其轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的2＇-O-甲磺?；苌?，然后由乙酸將該衍生物裂解成9-(2＇-O-甲磺?；?β-D-木呋喃糖基)腺嘌呤，再在甲醇中用甲醇鈉處理制得2＇,3＇-環(huán)氧化物，在含水二甲基甲酰胺中用鈉處理開(kāi)環(huán)，生成ara-A，再結(jié)晶純化。
相關(guān)化合物9-β-D-阿糖呋喃糖基-2-氟腺嘌呤(2-氟-ara-A)可由下列步驟合成在回流吡啶中，利用乙酐乙?；?,6-二氨基嘌呤，生成2,6-二乙酰氨基嘌呤，然后與2,3,5-三-O-芐基-α-D-阿糖呋喃糖基氯縮合，生成嵌段β-異頭物核苷；在乙醇中通過(guò)利用甲胺處理使其脫乙酰基，生成二氨基核苷，利用含硝酸鈉水溶液的氟硼酸和四氫呋喃混合物處理，使其生成2＇,3＇,5＇-三-O-芐基-β-D-阿糖呋喃糖基-2-氟腺嘌呤，利用三氯化硼處理，生成2-氟-ara-A。
通過(guò)稠合2,6-二氯嘌呤和1,3,5-三-O-乙?；?2-脫氧-D-赤-呋喃戊糖及通過(guò)其它方法(Robins和Kini，抗腫瘤藥化學(xué)，1990,p308)，可合成2-氯-2＇-脫氧腺苷。
(3)嘌呤環(huán)核苷酸和環(huán)核苷酸類似物
8-氯-cAMP可由下列步驟合成在氫氧化鈉水溶液存在下，將cAMP溴化成8-溴-cAMP，在高溫下利用硫脲將其處理成8-硫代-cAMP；在HCl甲醇溶液中利用氯氣氯化。
(4)其它與嘌呤相關(guān)的抗增生核苷噻唑呋林(2-β-D-核糖呋喃糖基)-噻唑-4-甲酰胺可由下列步驟合成利用溴丙酮酸乙酯處理2,5-脫水-3,4,6-三-O-苯甲?；?D-阿洛糖基硫代酰胺，促進(jìn)閉環(huán)，生成2-(2,3,5-三-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)噻唑-4-羧酸乙酯，為主要產(chǎn)品；然后分離并用甲醇氨處理。
相關(guān)化合物硒代噻唑呋林可由下列步驟合成利用液態(tài)H2Se處理2,5-脫水-3,4,6-三-O-苯甲酰基-D-阿洛糖腈，生成相應(yīng)的硒酰胺；與溴丙酮酸乙酯反應(yīng)，促進(jìn)閉環(huán)，生成2-(2,3,5-三-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)硒唑-4-羧酸乙酯，為主要產(chǎn)品；然后分離并用甲醇氨處理。
吡唑霉素(3-(1-β-D-核糖呋喃糖基)-4-羥基吡唑-5-甲酰胺)為天然存在的核苷，可從純白鏈霉菌中分離出來(lái)(Gutowski,G.E等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.51:312,1973)。另外，吡唑霉素可如下合成利用肼衍生物處理α-酮酯，生成二偶氮中間體；與乙酐和乙酸鈉加熱，生成環(huán)化羥基吡唑核苷；用甲醇氨胺化，然后脫芐基，生成吡唑霉素。
2-脫氧肋間型霉素(8R)-3-(2-脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-3,6,7,8-四氫咪唑[4,5-d][1,3]-二氮雜-8-醇可由下列步驟合成將糖苷配基、6,7-二氫咪唑[4,5-d][1,3]-二氮雜-8(3H)-酮與2-脫氧-3,5-二-O-對(duì)-甲苯酰-D-赤-呋喃戊糖基氯進(jìn)行糖基化作用(Chan,E等人，J.Org.Chem.47:3457,1982)。
合成核苷單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯及核苷磷酸酯類似物通過(guò)核苷與三氯氧化磷反應(yīng)而合成核苷單磷酸酯的方法描述在公開(kāi)WO90/00555和WO94/26273以及上文描述的文獻(xiàn)中(Yoshikawa等人，Bull.Chem.Soc.Japan 42:3505-3508,1969；Toorchen,D.和Topal,M.,Carcinogenesis 4:1591-1597,1983)。核苷二磷酸酯可根據(jù)Ott,D.G等人的方法制備(Anal.Biochem.21:469-472,1967)。
核苷三磷酸酯可由下述方法制備Seela和Roling的方法(Nuc.Acids Res.20:55-61,1992)；或通過(guò)Moffat和Khorana的方法(J.Am.Chem.Soc.83:663,1991)，由核苷單磷酸酯制得；或Hord和Ott的方法(J.Am.Chem.Soc.87:1785-1788,1963)。下列實(shí)施例1-3描述了用于制備核苷和核苷類似物的磷酸酯的一些詳細(xì)的合成方法。
其它核苷磷酸酯類似物，包括核苷硫代磷酸酯、核苷氨基磷酸酯、核苷膦酸酯和核苷氟代磷酸酯，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法合成，這些方法已由D.W.Hutchinson綜述(核苷單-、二-、三-和四磷酸酯和核苷酸的合成、反應(yīng)和性質(zhì)與磷酰殘基的變化。核苷酸和核苷化學(xué)(Chemistry of Nucleotides and Nucleosides),L.Townsend,ed.,1991,pp81-146及其所引用的參考文獻(xiàn))。通常的合成方法總結(jié)如下。
(1)核苷硫代磷酸酯是核苷酸類似物，其中一個(gè)或多個(gè)磷?；踉颖涣蛉〈?。早期的合成方法是將被保護(hù)的核苷與三(1-咪唑基)膦(phosphane)硫反應(yīng)，而最近的合成方法是利用硫代磷酰氯(PSCl3)代替后一試劑。通過(guò)用氫氧化鈉和二硫化碳處理，核苷苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)可轉(zhuǎn)變成硫代磷酸酯。核苷5＇-硫代磷酸酯可由核苷5＇-亞磷酸酯的直接硫化得到。嘌呤核苷2＇(3＇)-硫代磷酸酯可由下列步驟合成將2＇,3＇-O-二-正丁基甲錫亞烷基衍生物與硫代磷酰氯反應(yīng)，然后再堿解。
(2)核苷氨基磷酸酯是一種類似物，其中一個(gè)或多個(gè)磷酰基氧原子被氮取代，形成P-N鍵；即使在中等酸性條件下，該P(yáng)-N鍵比核苷硫代磷酸酯的P-S鍵更加不穩(wěn)定。合成這些化合物包括氨基核苷的磷酸化，并利用磷酸三酯處理核苷疊氮化物。親油核苷氨基磷酸酯是特別有用的治療牛皮癬化合物，理由是它們更容易被細(xì)胞吸收，然后被水解成生物活性化合物。
(3)核苷膦酸酯是一種化合物，其中磷?；难踉颖惶既〈纬煞€(wěn)定的P-C鍵；當(dāng)由代替氧的給電子的烷基基團(tuán)取代磷原子時(shí)，該化合物具有降低的P-OH基團(tuán)的酸性。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講，核苷磷酸酯可容易地利用或者Arbusov或者M(jìn)ichaelis-Becker反應(yīng)，由核苷鹵化物制得。核苷5＇-膦酸酯可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由2＇,3＇-被保護(hù)的5＇-碘-5＇脫氧核苷合成。等配核苷5＇-膦酸酯(其中5＇-氧被亞甲基基團(tuán)取代)可通過(guò)下列步驟合成偶合適當(dāng)保護(hù)的核苷5＇-醛和三苯基亞正膦基甲基膦酸二苯基酯，得到α,β-不飽和膦酸二酯，然后再還原并在磷?；鶜埢厦摫Ｗo(hù)，得到膦酸酯。等配核苷3＇-膦酸酯可通過(guò)下列步驟合成由膦?；颂?1氯化物開(kāi)始，將該化合物與嘌呤或嘧啶的重金屬鹽偶合。膦酸酯的極性通常低于其磷酸酯配對(duì)物，因此可用作治牛皮癬藥，理由是局部應(yīng)用時(shí)它們更容易被細(xì)胞吸收。
(4)核苷氟代磷酸酯是一種單核苷酸類似物。通過(guò)核苷酸的2,4-二硝基苯基酯，利用2,4-二硝基氟苯處理核苷5＇-磷酸酯制得核苷5＇-氟代磷酸酯。
(5)其它核苷磷酸酯類似物包括那些除氧原子之外的原子在核苷二-和三磷酸酯的α,β-磷原子之間或者在核苷三磷酸酯的β,γ-磷原子之間被取代的磷酸酯(包括在D.W.Hutchinson，核苷酸和核苷化學(xué)，LTownsend,ed.,1991的第119頁(yè)的表Ⅲ中所列的化合物)。通常地，α,β-類似物可通過(guò)下列步驟制備借助于DCC縮合2＇,3＇-O-被保護(hù)的核苷與焦磷酸酯類似物；或者通過(guò)親核置換反應(yīng)，該反應(yīng)包括利用亞甲基二膦酸酯離子替代甲苯磺?；塑盏?＇-位糖殘基上的甲苯磺?；?tosyl)殘基。β,γ-類似物的制備如實(shí)施例4所示。
局部用聚乙烯膏的制備在攪拌下，于70℃將5克核苷磷酸酯溶解于5ml丙二醇和60克聚乙二醇400(兩種試劑均購(gòu)自Spectrum ChemicalsInc.Los Angeles,CA)中。在攪拌下加入40克聚乙二醇3350(SpectrumChemicals Inc)，直至混合物變得完全清亮。然后將組合物置于管或其它容器中，冷卻至室溫并密封。組合物中活性成分的有效濃度可在0.001gm％至50gm％之間變化，優(yōu)選為0.01gm％至5gm％。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知，該組合物也可含有其它增強(qiáng)皮膚滲透性的成分(如二甲基亞砜或DMSO)和/或增強(qiáng)組合物儲(chǔ)存期間穩(wěn)定性的成分。
牛皮癬的治療將治療牛皮癬有效濃度為0.01gm％至10gm％的含治療增生或抗炎的核苷磷酸酯的本發(fā)明局部用組合物應(yīng)用于感染區(qū)域，每天1至6次。劑量標(biāo)準(zhǔn)和最佳的活性核苷磷酸酯化合物的濃度可容易地由治療牛皮癬領(lǐng)域的有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生確定。
實(shí)施例1由單核苷制備核苷三磷酸酯脫氧核糖核苷酸、二脫氧核糖核苷酸及類似物的5＇-三磷酸酯的制備包括下列表述的一系列反應(yīng)。
單核苷酸的合成描述在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào).08/060,258(1993年5月12日申請(qǐng))中。在室溫下，核苷酸(Ⅰ)和過(guò)量的1,1＇-羰基二咪唑(Ⅱ)反應(yīng)大約1小時(shí)，形成咪唑酯(Ⅲ)(imidazolidate)。在加入過(guò)量無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(Ⅳ)之前，用甲醇使未反應(yīng)的1,1＇-羰基咪唑分解。這消除了無(wú)機(jī)焦磷酸鹽的形成，該焦磷酸鹽將隨后從反應(yīng)材料中被除去。在加入無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(Ⅳ)后大約24小時(shí)完成磷?；磻?yīng)，然后利用DEAE-纖維素的陰離子交換色譜純化核苷三磷酸酯(Ⅴ)產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成鹽如鈉鹽。由于核苷酸(Ⅰ)和咪唑酯(Ⅲ)可在一起反應(yīng)形成對(duì)稱的焦磷酸鹽副產(chǎn)物，所以DEAE-纖維素的陰離子交換色譜應(yīng)當(dāng)在更低pH的條件下進(jìn)行，其中所需產(chǎn)物(Ⅴ)具有比無(wú)需副產(chǎn)物更少的電荷，這樣將可以分離這兩種化合物。
用于合成的一種試劑是三丁基銨焦磷酸鹽，該焦磷酸鹽可由下列步驟制備向焦磷酸吡啶鎓水溶液(通過(guò)將焦磷酸四鈉十水合物溶液(446ml,1mmol)經(jīng)過(guò)Dowex 50W-X4TM(吡啶鎓)樹(shù)脂(17ml)柱制得)中加入三丁胺(0.24ml,1mmol)。真空濃縮溶液，然后通過(guò)連續(xù)加入并蒸發(fā)無(wú)水吡啶而干燥殘留物，接著再加入并蒸發(fā)兩份10mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
核苷三磷酸酯的合成是通過(guò)下述方法完成的。向于1ml DMF中的作為無(wú)水三丁銨鹽的單低聚核苷酸(0.1mmol)溶液或懸浮液中加入于1mlDMF中的1,1＇-羰基二咪唑(80mg,0.5mmol)?；旌辖M合物30分鐘，然后將其置入室溫下的干燥器中4-12小時(shí)，接著用33μl(0.8mmol)甲醇處理并在室溫下反應(yīng)30分鐘。加入于5ml DMF中的焦磷酸三丁銨(0.5mmol)，劇烈攪拌，然后將混合物置入室溫下的干燥器中大約24小時(shí)，使焦磷酸咪唑鎓沉淀。分離沉淀物；通過(guò)離心和在DMF中再懸浮，利用4份1ml DMF洗滌，得到大約80-100％的純度。利用等體積的甲醇處理上清液，真空蒸發(fā)至干。殘留物在2×20cm含線性梯度碳酸氫三丁銨(梯度為約0至0.4M、pH 5-7.5的3L溶液)的DEAE-纖維素柱上色譜純化，收集餾分，通過(guò)分光光度測(cè)定來(lái)鑒定含核苷三磷酸酯的餾分。真空蒸發(fā)適當(dāng)?shù)酿s分，將核苷三磷酸酯三乙銨溶解在甲醇中，至約0.05M的濃度，加入5體積的高氯酸鈉丙酮溶液(15當(dāng)量)，形成核苷三磷酸酯的鈉鹽沉淀。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，利用適當(dāng)?shù)某恋矸磻?yīng)，可制得核苷三磷酸酯的其它鹽。通過(guò)離心收集沉淀的鹽，用4份1ml丙酮洗滌，用五氧化磷在真空下干燥。
合成核苷三磷酸酯的其它方法是可以得到的，包括下列實(shí)施例中所述的方法。實(shí)施例2利用2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物合成核苷一-、二-和三磷酸酯基本上利用van Boom等人的方法(Trtrehedron Lett 32:2779-2782,1975)，由單個(gè)中間體制備核糖核苷及其衍生物的一-、二-和三磷酸酯。一般地，該反應(yīng)包括將單官能團(tuán)試劑(2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物)與核糖核苷(或其衍生物)反應(yīng)，生成具有與核糖核苷相連的2,2,2-三溴乙基保護(hù)基團(tuán)的磷酸三酯衍生物(即制備核糖核苷5＇-磷酸嗎啉酯(phosphomorpholidate)或核糖核苷5＇-磷酸嗎啉酯衍生物)。利用酸性解封和中和，由Cu/Zn偶合反應(yīng)除去保護(hù)基團(tuán)，根據(jù)解封步驟中所使用的酸以及在中和步驟中所使用的銨鹽，生成一-、二-和三磷酸酯。也就是說(shuō)，為了獲得一磷酸酯核糖核苷，可使用HCl和氨；為了獲得二磷酸酯核糖核苷，可使用磷酸的一(三正丁基銨)鹽；為了獲得三磷酸酯核糖核苷，可使用雙(三正丁基銨)焦磷酸鹽。
一般的反應(yīng)如下列所示
單官能團(tuán)試劑(Ⅰ)2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物可由下列步驟制得在無(wú)水乙醚中將2,2,2-三溴乙基偶磷二氯化物與嗎啉反應(yīng)；利用本領(lǐng)域眾所周知的方法，分離所得反應(yīng)產(chǎn)物并使用環(huán)己烷/正戊烷重結(jié)晶。晶體2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物的熔點(diǎn)為79℃。
在20℃下，于無(wú)水吡啶中將單官能團(tuán)試劑(2mmol)與1mmol核苷或其衍生物混合48小時(shí)；然后通過(guò)色譜純化級(jí)分反應(yīng)混合物(B.JHunt & W.Rigby,Chem&Ind.1868,1967)，得到無(wú)色核苷固體(Ⅲ)。于20℃，在無(wú)水DMF中利用Cu/Zn電偶處理核苷酸10分鐘，接著過(guò)濾以除去過(guò)量的Cu/Zn，得到核苷磷酸嗎啉酯(phosphoromorphlidate)。
然后利用不同的酸和氨源處理核苷磷酸嗎啉酯，得到一-、二-或三磷酸酯。對(duì)于一磷酸酯，可利用0.01N HCl、pH2在20℃下處理磷酸嗎啉酯2小時(shí)，然后用氨水(pH9)中和并在Sephadex G-25TM柱上純化。
類似地，核苷5＇-三磷酸酯可通過(guò)下列方法獲得在沒(méi)有水分的條件下，將于2ml無(wú)水DMF中的磷酸嗎啉酯(0.1mmol)與于2ml無(wú)水DMF中的0.5mmol雙(三正丁銨)焦磷酸在20℃下反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)產(chǎn)物在真空下濃縮，利用Dowex 50TM(銨形式)處理；利用3L線性梯度0.0至0.3M Et2NH2CO3溶液，在2×25cm DEAE纖維素柱上純化。
核苷5＇-二磷酸酯可通過(guò)下列方法獲得在沒(méi)有水分的條件下，于4ml無(wú)水吡啶中，將磷酸嗎啉酯(0.1mmol)與0.6mmol一(三正丁銨)磷酸在20℃下反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行類似的濃縮和純化。另外，在含一(三正丁銨)磷酸的吡啶溶液中，利用Zn粉處理，可將磷酸三酯衍生物(Ⅲ)直接轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷二磷酸酯。也就是，在沒(méi)有水分的條件下，將1nmol試劑Ⅲ加入到攪拌著的含0.1g細(xì)分散Zn粉和12mmol一(三正丁銨)磷酸的15ml無(wú)水吡啶溶液中，在20℃下反應(yīng)48小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物離心使Zn成丸狀，利用每步15ml水共蒸上清液三次，然后在DEAE纖維素上純化。實(shí)施例3合成7-脫氮嘌呤2＇-脫氧核糖核苷三磷酸酯(1)合成7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。將7-脫氮-2＇-脫氧肌苷(25mg,0.1mmol)溶解在磷酸三甲酯(250μl,1.07mmol)中，加入POCl3(18.5μl,0.2mmol)。將混合物在0℃下攪拌1.5小時(shí)，然后加入于1ml無(wú)水DMF和1ml三-正丁胺中的0.5M雙(三正丁銨)焦磷酸混合物，劇烈攪拌1分鐘；利用1M Et2NH2CO3水溶液中和至pH7，真空蒸發(fā)至干。利用線性梯度Et2NH2CO3、pH7(11H2O/110.7MTBK)溶液，在2.6×30cm DEAE-Sephadex柱上純化殘留物，得到無(wú)色固體，UV(H2O)λmax為258nm。
(2)合成7-脫氮-2＇-脫氧腺苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。由7-脫氮-2＇-脫氧腺苷，可類似地制得該化合物，得到無(wú)色固體，UV(H2O)λmax為270nm。
(3)合成7-脫氮-2＇-脫氧鳥(niǎo)苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。由7-脫氮-2＇-脫氧鳥(niǎo)苷，可類似地制得該化合物，得到無(wú)色固體，UV(H2O)λmax為259nm。實(shí)施例4合成2-氯脫氧-3腺苷二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdAPMDP)核苷多磷酸酯已經(jīng)被合成過(guò)，其中核苷三磷酸酯如脫氧腺苷三磷酸酯中β,γ-磷原子之間的原子被不是氧原子的原子替代(T.C.Myers等人，Phosphonic analogues of nncleoside phosphate.I.The synthesis of 5＇-adenylyl methylene diphosphoaate,a phosphonic analogue of ATP.J.Am.Chem.Soc.85:3292-3295,1963；R.G.Yount,ATP analogues Adv Enzymol43:1-56,1975)。這種替代得到了存在于核苷磷酸酯分子中的比P-O鍵更強(qiáng)的鍵。
合成基本上是按照Myers等人描述的方法1或方法2進(jìn)行的(J.Am.Chem.Soc.85:3292-3295,1963)。在方法1中，2-氯脫氧腺苷5＇-氨基磷酸酯與亞甲基二膦酸反應(yīng)，生成核苷多磷酸酯的膦酸類似物。另外，利用方法2，使用二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)為縮合劑，使2-氯脫氧腺苷一磷酸酯與亞甲基二膦酸反應(yīng)。
根據(jù)方法1，亞甲基二膦酸是通過(guò)在濃HCl中水解其四乙酯獲得的，其中四乙酯是通過(guò)二碘甲烷與過(guò)量的亞磷酸三乙酯反應(yīng)制得的。利用54ml新蒸鄰氯苯酚處理1,3-二環(huán)己基鈲腺苷5＇-氨基磷酸酯(3.6mmol)和亞甲基二膦酸(10.8mmol)；用冰冷卻混合物，加入36ml無(wú)水吡啶。在不時(shí)振蕩下，將所得溶液在室溫下放置48小時(shí)，在冰冷下加入300ml水。利用乙醚提取溶液6次(共850ml)。用1N HCl調(diào)節(jié)水溶液至pH2，然后用30g酸洗木炭(Norit A)處理并攪拌30分鐘；然后過(guò)濾收集木炭，用水(共5L)徹底地洗滌。核苷衍生物由50％水合乙醇-5％的濃縮氫氧化銨(共3L)洗脫，通過(guò)在35℃下蒸發(fā)，將洗脫液濃縮至400ml體積。濃縮的洗脫液應(yīng)用于2.7cm×31cm Dowex-2TM(氯化物；8％交聯(lián))柱上；用由混合2L 0.003N HCl(在混合器中)和2L 0.003N HCl和0.45N LiCl(在儲(chǔ)存器中)制得的線性梯度溶液洗脫；收集10ml的餾分；用本領(lǐng)域熟知的方法，利用紙色譜或紫外吸收，鑒定含有2-氯脫氧腺苷-二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdAPMDP)的餾分。利用1N LiOH中和含2CdATMDP的餾分并在30℃下蒸發(fā)濃縮；用250ml丙酮-10％甲醇處理濃縮的溶液，沉淀出固體；通過(guò)離心分離該固體，用丙酮-10％甲醇混合物洗滌，直至在洗滌液中檢測(cè)不出氯化物為止。2CdATMDP鋰鹽可進(jìn)一步純化將鹽溶解在100ml用LiOH調(diào)節(jié)至pH8的水中，利用上述的方法，通過(guò)Dowex-2TM柱色譜純化該溶液，在混合室中利用1.5L0.003N HCl梯度溶液洗脫，而在儲(chǔ)存器中利用由1.5L0.003N HCl和0.45N LiCl組成的溶液洗脫；如上述方法處理洗脫液，接著將沉淀溶解在6ml水中，用40ml甲醇將其沉淀。將最終的沉淀物溶解在15ml水中并凍干，得到2CdATMDP四鋰鹽粉末。
利用方法2，將亞甲基二膦酸(11.4mmol)和2-氯脫氧腺苷膦酸酯(2.6mmol)溶解在吡啶(30ml)和水(4ml)中，生成兩相混合物；于室溫劇烈攪拌下在3份等分試樣(反應(yīng)開(kāi)始時(shí)為29mmol,4小時(shí)后為48mmol，以及12小時(shí)后為19mmol)加入DCC。24小時(shí)后反應(yīng)完成，濾出沉淀的二環(huán)己基脲，用水洗滌。用水將濾液和洗滌液的體積調(diào)節(jié)至總體積150ml，用乙醚提取5次(共300ml)。將溶液調(diào)節(jié)至pH 8，在2.5cm×17.5cm Dowex-lTM(甲酸鹽，2％交聯(lián))柱上色譜純化；用1.5 L水洗滌該柱以除去吡啶。通過(guò)不斷向混合室中加入含500ml水的下列溶液獲得的梯度溶液洗脫該柱4N甲酸(500ml)、4N甲酸加上0.1M甲酸銨(500ml)和4N甲酸加上0.2M甲酸銨(1500ml)，收集15ml餾分。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法，利用紫外吸收鑒定含有2CdATMDP(大約在試管115-134中)的餾分。將合并的含2CdATMDP的餾分凍干至體積大約為200ml，然后用7g酸洗木炭(Norit A)處理并攪拌15分鐘；過(guò)濾收集木炭，用水(共800ml)洗滌。產(chǎn)物用50％水合乙醇-5％濃縮氫氧化銨(共600ml)冼脫，通過(guò)在20℃下蒸發(fā)將洗脫液濃縮至200ml的體積，過(guò)濾除去痕量木炭并凍干成粉末。將粉末溶解在4ml水中，利用過(guò)量的1M乙酸鋇處理溶液；通過(guò)離心收集所得沉淀，用水洗滌并在0℃下溶解于0.1N HBr中。利用1N NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH6.5，通過(guò)離心收集所得沉淀，各用2×2ml水、乙醇和乙醚順序地洗滌。在室溫下用P2O4干燥樣品12小時(shí)，得到二鋇2CdATMDP水合物。本發(fā)明的其它核苷類似物二氧磷基亞甲基二膦酸酯可類似地制得。實(shí)施例5利用EFAD小鼠模型，應(yīng)用具有抗增生作用的磷酸酯基本上根據(jù)實(shí)施例2描述的方法制備抗增生核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯。正如上文描述，這些化合物各自可形成局部用聚乙烯膏，所述膏含有在丙二醇膏中的0.001gm％至10gm％活性成分、聚乙二醇400和聚乙二醇3350，從而形成膏劑混合物。也可制得含有增強(qiáng)皮膚滲透性成分(如二甲基亞砜或AzoneTM)的類似制劑。
在6小時(shí)至5天時(shí)間內(nèi)，以6小時(shí)時(shí)間間隔，將10μl等分試樣的組合物應(yīng)用于EFAD無(wú)毛小鼠的背側(cè)。在每次時(shí)間間隔結(jié)束時(shí)，殺死一只小鼠并切除治療過(guò)的組織，將其置于含3H-胸苷脫氧核糖的組織培養(yǎng)基中，進(jìn)行2小時(shí)脈沖標(biāo)記，從而測(cè)定一-、二-和三磷酸酯對(duì)皮膚細(xì)胞增生的作用。然后利用常規(guī)方法從組織中分離出DNA，通過(guò)確定所分離的DNA中的放射性(cpm/μgDNA)測(cè)定3H-胸苷脫氧核糖向DNA中的摻入。
用于抑制增生的治療牛皮癬組合物的一-、二-和三磷酸酯的效力是通過(guò)比較向未治療組織的DNA中放射性摻入與向經(jīng)不同治牛皮癬藥的制劑治療過(guò)的組織的DNA中放射性的摻入而確定的。
用于各試驗(yàn)皮膚活組織檢查的活性成分的總量是通過(guò)所應(yīng)用的膏劑中活性成分的gm％和小鼠皮膚測(cè)定前的給藥次數(shù)確定的。對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)使用相同小鼠的腹側(cè)皮膚測(cè)定相應(yīng)未治療的時(shí)間點(diǎn)。3H-胸苷脫氧核糖向背側(cè)皮膚DNA和對(duì)照腹側(cè)皮膚中的摻入的差異被用來(lái)計(jì)算作為各次給藥的磷酸酯總量函數(shù)的細(xì)胞增生的總抑制(百分?jǐn)?shù))。
3H-摻入的結(jié)果也可用于確定作為各單個(gè)試驗(yàn)組合物的時(shí)間的函數(shù)的抑制百分?jǐn)?shù)(比較背側(cè)皮膚和腹側(cè)皮膚的摻入)。
作為時(shí)間的函數(shù)和作為給藥活性成分總量的函數(shù)，向相應(yīng)于用磷酸酯治療的背側(cè)皮膚的DNA中的3H-摻入遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于向相應(yīng)未治療腹側(cè)皮膚的DNA中的3H-摻入。實(shí)施例6應(yīng)用二脫氧胞苷三磷酸酯抑制小鼠模型中的多胺生物合成多胺生物合成抑制測(cè)定是通過(guò)測(cè)定在利用佛波醇酯12-O-十四?；鸩ù?13-乙酸酯(TPA；用于增加ODC活性)進(jìn)行治療之前對(duì)小鼠皮膚局部應(yīng)用二脫氧胞苷三磷酸酯后存在于表皮細(xì)胞中的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的量而進(jìn)行的。
簡(jiǎn)言之，無(wú)胸腺光禿小鼠或EFAD小鼠可利用TPA溶液局部治療，所述TPA溶液可增加表皮組織中的ODC水平并模擬通常存在于與牛皮癬有關(guān)的增生中的這種酶的水平升高。在TPA治療后30分鐘至1小時(shí)內(nèi)，將含有作為活性成分的二脫氧胞苷三磷酸酯和用于增強(qiáng)皮膚滲透性的0.01％DMSO的膏劑應(yīng)用于TPA處理過(guò)的皮膚區(qū)域。膏劑含有基本上根據(jù)實(shí)施例2中的方法制得的二脫氧胞苷三磷酸酯，該膏劑是在濃度為5gm％、于可藥用膏中制備的，以20μl的等分試樣應(yīng)用于皮膚；另外的等分試樣在6小時(shí)內(nèi)每小時(shí)應(yīng)用一次，共應(yīng)用6次。在6小時(shí)之后，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)測(cè)定皮膚中的ODC水平(J.Lesiewicz等人，Modelsin Dermatology,vol.2(H.I.Maibach&N.J.Lowe,eds.),1985,pp112-116)。作為對(duì)照，測(cè)驗(yàn)無(wú)胸腺光禿小鼠的未治療皮膚，以確定正常的ODC水平；測(cè)驗(yàn)利用TPA治療過(guò)的無(wú)胸腺光禿小鼠的皮膚，以確定施用TPA后ODC水平的升高。為了進(jìn)一步對(duì)照，正常和TPA治療過(guò)的皮膚同時(shí)利用含有DMSO但不含有二脫氧胞苷三磷酸酯的膏劑進(jìn)行治療。
將利用TPA和含二脫氧胞苷三磷酸酯膏劑治療的皮膚中的ODC水平與正常皮膚的ODC水平以及與利用TPA治療過(guò)的皮膚中的ODC水平進(jìn)行比較。二脫氧胞苷三磷酸酯治療的效力是通過(guò)相對(duì)于TPA治療皮膚的ODC水平的降低以及通過(guò)相對(duì)于正常皮膚中的ODC水平而確定的。在利用含二脫氧胞苷三磷酸酯的膏劑進(jìn)行治療之后，其ODC水平相對(duì)于只經(jīng)過(guò)TPA治療而沒(méi)有接受膏劑治療或接受不含二脫氧胞苷三磷酸酯活性成分的膏劑治療的ODC水平顯著地降低了。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，類似的治療以及利用其它二脫氧核苷磷酸酯進(jìn)行治療的效力分析可被類似地確定。這些二脫氧核苷磷酸酯包括二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷和包括疊氮二脫氧胸苷(AZT)和二脫氧二脫水胸苷的二脫氧核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯。實(shí)施例7利用移植有牛皮癬人皮膚的小鼠，應(yīng)用具有治療增生作用的5-氟脫氧尿苷和5-氟尿苷的磷酸酯當(dāng)局部應(yīng)用于移植到無(wú)胸腺小鼠上的人牛皮癬皮膚時(shí)，將皮膚活組織檢查用于檢測(cè)5-氟脫氧尿苷三磷酸酯和5-氟尿苷三磷酸酯的抗增生作用。利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，將直徑大約為1-10mm的人牛皮癬皮膚移植到無(wú)胸腺小鼠的背側(cè)。在移植物充分愈合后，利用含有活性成分為5-氟脫氧尿苷三磷酸酯、5-氟尿苷三磷酸酯或其一-或二磷酸酯的治牛皮癬藥治療患有牛皮癬的人皮膚。這些化合物基本上是根據(jù)實(shí)施例1描述的方法制得的。藥物組合物是通過(guò)包括存在于如早期文獻(xiàn)公開(kāi)的局部用聚乙烯膏中的活性成分且活性成分的濃度為0.1gm％至10gm％而制得的。在1-15天內(nèi)、以6小時(shí)時(shí)間間隔，將含有活性成分的膏劑以20μl等分試樣應(yīng)用于移植的皮膚部分。在每隔24小時(shí)治療階段后，檢查治療的皮膚以確定牛皮癬的粗略標(biāo)記(皮膚的剝落和炎癥的紅腫)。在15天后，將皮膚從小鼠中分離開(kāi)來(lái)；利用常規(guī)的組織學(xué)技術(shù)，通過(guò)顯微觀測(cè)，由活組織檢查確定表皮細(xì)胞層的數(shù)量和皮膚內(nèi)的毛細(xì)管膨脹的相對(duì)程度。
將表皮細(xì)胞層的數(shù)量與已移植到無(wú)胸腺光禿小鼠上的類似檢測(cè)的正常和未治療人牛皮癬皮膚進(jìn)行比較，確定利用含5-氟脫氧尿苷三磷酸酯和5-氟尿苷三磷酸酯的藥物組合物進(jìn)行治療的效果。通過(guò)在適當(dāng)染色條件下確定表皮毛細(xì)管中中性白細(xì)胞和單核白細(xì)胞的數(shù)量，可進(jìn)行組織中炎癥相對(duì)程度的定量。相對(duì)于未治療牛皮癬皮膚和正常對(duì)照皮膚的毛細(xì)管相對(duì)膨脹程度是可以察覺(jué)的。
表皮中細(xì)胞層的數(shù)量、炎癥的程度和毛細(xì)管膨脹程度是與治療的天數(shù)以及由組合物濃度和給藥量確定的活性成分的量相對(duì)應(yīng)的。相對(duì)于未治療的牛皮癬皮膚，含有5-氟脫氧尿苷三磷酸酯、5-氟尿苷三磷酸酯或其一-或二磷酸酯的組合物均顯示出牛皮癬癥狀的顯著降低。實(shí)施例8在患有牛皮癬的人皮膚上應(yīng)用具有治療增生作用的7-脫氮嘌呤2＇-脫氧核糖核苷三磷酸酯利用包括基本上如實(shí)施例3所述合成的7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯的三乙基銨鹽作為活性成分的膏組合物，對(duì)在兩個(gè)前臂上具有牛皮癬剝落皮膚斑的自愿者進(jìn)行治療。在可藥用膏劑如早期文獻(xiàn)中公開(kāi)的聚乙二醇膏劑中的活性成分的濃度為50gm％。
肉眼檢查兩臂皮膚上的剝落和炎癥，在利用含7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯的膏進(jìn)行治療之前記錄結(jié)果(書(shū)面觀察報(bào)告和照片)。在14天的時(shí)間內(nèi)、以6小時(shí)間隔，將一或兩滴膏劑應(yīng)用于其中一個(gè)前臂上的大約直徑為3cm的牛皮癬皮膚區(qū)域。另一個(gè)前臂在14天期間內(nèi)保持不治療。
在14天內(nèi)，每天用肉眼檢查兩臂上皮膚的剝落和炎癥，記錄結(jié)果進(jìn)行兩側(cè)成對(duì)比較。如果自愿者具有足夠量的牛皮癬斑，可同時(shí)測(cè)驗(yàn)含有濃度為50gm％的7-脫氮-2＇-脫氧腺苷5＇-三磷酸酯和7-脫氮-2＇-脫氧鳥(niǎo)苷5＇-三磷酸酯的三乙基銨鹽的類似組合物治療牛皮癬的活性。
在14天的最后，如實(shí)施例7中描述的方法，使用常規(guī)組織學(xué)方法取出1-2mm直徑的真皮和表皮部分進(jìn)行活組織檢查和顯微檢查(確定表皮中細(xì)胞層的數(shù)量、真皮中的炎癥程度和毛細(xì)管膨脹程度)。從未治療手臂的牛皮癬皮膚中取出皮膚作為負(fù)面對(duì)照，從未治療手臂中取出正常皮膚作為正面對(duì)照，從利用含有7-脫氮嘌呤-2′-脫氧核糖核苷三磷酸酯的膏劑治療過(guò)的區(qū)域取出皮膚作為確定相對(duì)于對(duì)照樣品的活性成分的效力。
在相同自愿者上進(jìn)行的治療牛皮癬皮膚和未治療牛皮癬皮膚的兩側(cè)成對(duì)區(qū)域的肉眼觀測(cè)表明在14天內(nèi)，利用7-脫氮嘌呤-2′-脫氧核糖核苷三磷酸酯治療的皮膚中的牛皮癬癥狀顯著降低。肉眼觀測(cè)的結(jié)果得到了由治療和未治療區(qū)域取出的皮膚的顯微檢查的支持。類似地，一-和二磷酸酯也顯示出了活性。實(shí)施例9在剝落皮膚小鼠的皮膚上應(yīng)用具有治療增生作用的2-氯脫氧腺苷磷酸酯利用含有基本上是如實(shí)施例2所述的方法制得的作為活性成分的2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯的藥物組合物治療顯示出具有炎癥性表皮牛皮癬的年齡為35-42天的近交fsn/fsn小鼠。該組合物含有濃度為5gm％的一-、二-或三磷酸酯活性成分。將組合物以5μl等分試樣、以12小時(shí)時(shí)間間隔應(yīng)用于fsn/fsn小鼠的腹側(cè)皮膚的1-5mm部分；對(duì)照f(shuō)sn/fsn小鼠也類似地用不含活性成分的組合物治療。在第一次給藥12小時(shí)后開(kāi)始每天粗略地和顯微地觀測(cè)皮膚，延續(xù)至15天之后。利用常規(guī)的皮膚學(xué)和組織學(xué)方法，將觀測(cè)結(jié)果用于確定牛皮癬皮膚出現(xiàn)的表皮增生程度和炎癥特征。
對(duì)于治療后的每個(gè)觀測(cè)點(diǎn)，治療皮膚與未治療相同小鼠的類似部分以及與僅用載體成分而不用2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯進(jìn)行治療的皮膚進(jìn)行比較。數(shù)日后可觀測(cè)到與未治療的皮膚或經(jīng)不含活性成分的組合物進(jìn)行治療的皮膚相比，利用含有2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯的組合物進(jìn)行治療的皮膚部分的炎癥和剝落顯著改善。
通過(guò)利用含有2-氯-2′-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯作為活性成分的組合物進(jìn)行治療的fsn/fsn小鼠，可進(jìn)行類似的分析。在14天內(nèi)使用這些組合物，可觀測(cè)到類似的牛皮癬癥狀減少。實(shí)施例10在牛皮癬人皮膚上應(yīng)用具有治療增生作用的6-氮雜尿苷三磷酸酯利用包括基本上如實(shí)施例1所述合成的6-氮雜尿苷三磷酸酯作為活性成分的膏劑，對(duì)在手臂和腿上具有牛皮癬皮膚斑的自愿者進(jìn)行治療。在可藥用膏劑如聚乙二醇基膏劑中的活性成分的濃度為25gm％。
肉眼檢查手臂和腿皮膚上的剝落和炎癥，在利用含6-氮雜尿苷三磷酸酯的膏劑進(jìn)行治療之前記錄觀察結(jié)果(書(shū)面觀察報(bào)告和照片)。在14天的時(shí)間內(nèi)、以3小時(shí)間隔，將各為50μl的定量等分試樣應(yīng)用于其中一個(gè)手臂上和其中一條腿上的直徑約為5-10cm的牛皮癬皮膚區(qū)域。作為負(fù)面對(duì)照，另一個(gè)手臂和腿在14天期間內(nèi)保持不治療。
在14天內(nèi)，每天用肉眼檢查兩臂和兩腿上皮膚的剝落和炎癥，記錄結(jié)果進(jìn)行兩側(cè)成對(duì)比較。
在14天的最后，如實(shí)施例7中描述的方法，利用常規(guī)組織學(xué)方法取出1-2mm直徑的皮膚(真皮和表皮)部分進(jìn)行活組織檢查和顯微檢查，確定表皮中的細(xì)胞層數(shù)量、真皮中的炎癥程度和毛細(xì)管膨脹程度。從未治療區(qū)域和/或腿的牛皮癬皮膚中取出皮膚作為負(fù)面對(duì)照，從未治療區(qū)域中取出正常皮膚作為正面對(duì)照，從利用含有6-氮雜尿苷三磷酸酯的膏劑治療過(guò)的區(qū)域取出皮膚以確定相對(duì)于對(duì)照樣品的活性成分的效力。
在相同自愿者上進(jìn)行的治療牛皮癬皮膚和未治療牛皮癬皮膚的兩側(cè)成對(duì)區(qū)域的肉眼觀測(cè)表明在14天內(nèi)，利用6-氮雜尿苷三磷酸酯治療的皮膚中的牛皮癬癥狀顯著降低。肉眼觀測(cè)的結(jié)果得到了由治療和未治療區(qū)域取出的皮膚的顯微檢查的支持。6-氮雜尿苷的一-和二磷酸酯也可獲得類似的結(jié)果。實(shí)施例11利用2-氯脫氧腺苷二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdATMDP)治療人牛皮癬皮膚將移植到無(wú)胸腺光禿小鼠上的人牛皮癬皮膚用于檢測(cè)局部應(yīng)用時(shí)的2CdATMDP的治療增生的作用。將肉眼觀測(cè)和顯微鏡皮膚活組織檢查分析用于檢測(cè)治療牛皮癬組合物的效力。
利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，將直徑大約為1-10mm的人牛皮癬皮膚移植到無(wú)胸腺小鼠的背側(cè)上。在移植物充分愈合后，利用含有活性成分核苷類似物2CdATMDP(基本上由實(shí)施例4描述的方法制得)的治療牛皮癬藥物治療患有牛皮癬的人皮膚。藥物組合物包括存在于基本上如早期文獻(xiàn)公開(kāi)的局部用聚乙烯膏中的活性成分且活性成分的濃度為約0.5gm％至5gm％。在1-30天內(nèi)、以12小時(shí)時(shí)間間隔，將含有活性成分的膏劑以10μl等分試樣應(yīng)用于移植的皮膚部分。在每隔24小時(shí)治療階段中，檢查治療的皮膚以確定牛皮癬的粗略指示(如剝落和炎癥)。在15天和30天時(shí)，將皮膚從小鼠的移植區(qū)域分離開(kāi)來(lái)；利用常規(guī)的組織學(xué)分析確定表皮細(xì)胞層的數(shù)量和皮膚真皮內(nèi)的毛細(xì)管膨脹的相對(duì)程度。
將表皮細(xì)胞層的數(shù)量與已移植到無(wú)胸腺光禿小鼠上的類似檢測(cè)的正常和未治療人牛皮癬皮膚進(jìn)行比較，確定利用含2CdATMDP的藥物組合物進(jìn)行治療的效果。除了毛細(xì)管膨脹的相對(duì)程度，通過(guò)確定相對(duì)于未治療牛皮癬皮膚和正常對(duì)照皮膚的真皮毛細(xì)管中中性白細(xì)胞和單核白細(xì)胞的數(shù)量，可進(jìn)行組織中炎癥的定量。
表皮中細(xì)胞層的數(shù)量、炎癥的程度和毛細(xì)管膨脹程度與治療的天數(shù)以及(由組合物濃度和給藥量確定的)活性成分的量相關(guān)。在整個(gè)治療階段以后，與移植到無(wú)胸腺光禿小鼠中的未治療對(duì)照牛皮癬皮膚相比，在治療的移植牛皮癬皮膚中可觀測(cè)到炎癥和剝落的顯著降低。
利用包含核苷類似物2CdATMDP的藥物組合物，對(duì)在兩個(gè)前臂上具有牛皮癬皮膚斑的自愿者的一個(gè)前臂類似地進(jìn)行治療，每天兩次(每次治療使用50μl)。每天觀測(cè)與另一個(gè)前臂對(duì)照區(qū)域(未治療皮膚或利用不合活性成分的膏狀制劑進(jìn)行治療的皮膚)相比的治療牛皮癬皮膚的病情，在第15天和第30天取出直徑為約1-3mm的皮膚活組織，按照上文描述的用于小鼠模型的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分析進(jìn)行檢測(cè)。15天后，與未治療皮膚或利用只是制劑的惰性混合物而無(wú)活性成分進(jìn)行治療的皮膚相比，利用含2CdATMDP的組合物進(jìn)行治療過(guò)的皮膚上觀測(cè)到的炎癥減輕。30天后，與另一前臂的皮膚對(duì)照斑相比，利用含活性成分的組合物治療的皮膚中觀測(cè)到的炎癥和剝落顯著地改變。實(shí)施例12利用2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷磷酸酯治療人的局部皮炎基本上如實(shí)施例2所述的方法合成2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯。利用含有各濃度為5gm％的2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-和三磷酸酯的混合物的洗液組合物治療患有局部皮炎的青春期患者；該局部皮炎未知原因，以在拳頭和脖子上極度瘙癢和濕疹損傷為特征。該洗液應(yīng)用于皮膚的感染區(qū)域，每天可應(yīng)用多達(dá)12次，每次約1-3cc。經(jīng)1-4周治療后，相對(duì)于患者開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)，隨皮炎的皮膚瘙癢和炎癥顯著降低。進(jìn)一步地，在治療之后，治療皮膚上的濕疹損傷正將愈合或已經(jīng)愈合。由此，該洗液只有在瘙癢復(fù)發(fā)時(shí)才需使用。實(shí)施例13利用二脫氧核苷磷酸酯治療扁平苔癬基本上如實(shí)施例2所述的方法合成二脫氧胞苷的一-、二-或三磷酸酯。將各二脫氧胞苷的磷酸酯配制成濃度為0.5gm％的基于聚乙二醇的膏劑組合物。將患有以其手臂和腿上具有丘疹炎癥和瘙癢性皮疹為特征的慢性扁平苔癬的自愿者分成三組，每組用一種組合物治療二脫氧胞苷的一-、二-或三磷酸酯。每組使用膏劑僅在一個(gè)手臂或腿上應(yīng)用，留下另一個(gè)手臂或腿不進(jìn)行治療，以進(jìn)行與治療皮膚的兩側(cè)對(duì)照。在7天至3個(gè)月期間，每約6小時(shí)間隔應(yīng)用大約1cc體積的膏劑。每天用肉眼檢查治療和未治療的區(qū)域兩周，之后至少每周檢查一次或根據(jù)需要檢查(由治療的醫(yī)生確定)。當(dāng)炎癥和/或丘疹形成似乎減少時(shí)，治療醫(yī)生還可根據(jù)需要減少每天的應(yīng)用次數(shù)，以維持控制疾病。
當(dāng)治療區(qū)域的炎癥似乎減少且瘙癢性皮疹似乎減少時(shí)，從自愿者的感染區(qū)域的治療肢體和未治療肢體中取出皮膚活組織(大約1-3mm)進(jìn)行炎癥(如真皮毛細(xì)管膨脹)和丘疹特征(如表皮層的數(shù)量以及與丘疹有關(guān)的帶白色的線或點(diǎn)的跡象)的組織學(xué)檢查。
對(duì)于這三組中的每一組，與對(duì)應(yīng)未治療肢體的皮膚相比，該組的一些成員在其治療手臂或腿的皮膚上的扁平苔癬的炎癥和瘙癢性皮疹中顯示出了顯著的改善。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的其它核苷磷酸酯類似物以及包括二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷和二脫氧核苷類似物(包括ATZ和d4T)的二脫氧化合物的類似磷酸酯可類似地用于藥物組合物中。實(shí)施例14利用阿昔洛韋磷酸酯治療光化性角化病基本上如實(shí)施例1所述合成阿昔洛韋三磷酸酯。利用本領(lǐng)域熟知的方法制備膏劑組合物，該組合物含有0.1-0.5gm％阿昔洛韋三磷酸酯及能夠增強(qiáng)皮膚滲透性的約0.01gm％AzoneTM。
將一組在暴露在太陽(yáng)下的皮膚(如在鼻、手、臂或腿上)上具有光化性角化病斑的中年人自愿者分成三組一組利用液氮冷凍光化性角化病而殺死細(xì)胞；一組利用阿昔洛韋三磷酸酯組合物進(jìn)行治療；一組為對(duì)照組，利用含有惰性成分和AzoneTM而不含有阿昔洛韋三磷酸酯的組合物進(jìn)行治療。
在多達(dá)一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，利用含有或不含有阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑組合物治療的組每天涂敷膏劑兩次(早晨和晚上)，給藥體積足以覆蓋感染區(qū)域(大約0.01-0.5cc)。由臨床醫(yī)生每隔一天用肉眼檢查每組治療的皮膚并記錄觀測(cè)結(jié)果(書(shū)面和照片)。治療后，自愿者每隔6個(gè)月被檢查治療區(qū)域光化性角化病的復(fù)發(fā)情況。
對(duì)于利用含阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑治療的組而言，大量患者顯示出角化生長(zhǎng)的降低，在治療一個(gè)月后感染區(qū)域的紅腫減弱。臨床醫(yī)生可根據(jù)6個(gè)月的檢查確定是否需要繼續(xù)治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，阿昔洛韋的一-和二磷酸酯也可用于類似的藥物制劑中，而且更昔洛韋或本發(fā)明的其它抗增生核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯也可用于治療與增生過(guò)度有關(guān)的皮膚病的具有抗增生活性的組合物中。
對(duì)于利用不含阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑治療的組而言，1個(gè)月后觀測(cè)光化性角化病無(wú)任何變化，然后將感染區(qū)域利用臨床可接受的方法除去。
對(duì)于利用液氮冷凍光化性角化病的組而言，所有治療區(qū)域的細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)全部死亡，接著形成了死亡細(xì)胞的腐肉，而且在愈合過(guò)程中伴隨疼痛。在有些情況下，在治療區(qū)域見(jiàn)到疤痕。
權(quán)利要求
1．一種治療以皮膚細(xì)胞增生過(guò)度為特征的疾病的方法，該方法包括對(duì)疾病的皮膚或粘膜損害局部施用含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。
2．一種治療以皮膚細(xì)胞增生過(guò)度為特征的疾病的方法，該方法包括對(duì)疾病的皮膚或粘膜損害局部施用含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為1或2。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述核苷或核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥(niǎo)苷(guanosine arabinoside)、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結(jié)核菌素、2＇-脫氧間型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋。
4．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述疾病選自牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、扁平苔癬、光化性角化病、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。
5．權(quán)利要求4的方法，其中所述疾病為牛皮癬。
6．權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.001gm％至100gm％。
7．權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.01gm％至10gm％。
8．權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.1gm％至5gm％。
9．根權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物被應(yīng)用于皮膚區(qū)域，每天應(yīng)用1至10次，每次劑量為0 001gm％至100gm％。
10．權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物被應(yīng)用于皮膚區(qū)域，每天應(yīng)用1至10次，每次劑量為0.01gm％至10gm％。
11．權(quán)利要求1或2的方法，其中組合物被應(yīng)用于皮膚區(qū)域，每天應(yīng)用1至10次，每次劑量為0.1gm％至5gm％。
12．一種藥物組合物，該組合物含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。
13．一種藥物組合物，該組合物含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為1或2。
14．權(quán)利要求10或11的藥物組合物，該組合物還含有丙二醇、聚乙二醇400和聚乙二醇3350。
15．權(quán)利要求10或11的藥物組合物，該組合物還含有在局部給藥期間增強(qiáng)皮膚滲透性的成分。
16．權(quán)利要求10或11的藥物組合物，其中所述核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥(niǎo)苷、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥(niǎo)苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結(jié)核菌素、2＇-脫氧間型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋。
17．權(quán)利要求10-14中任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.001gm％至50gm％。
18．權(quán)利要求10-14中任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.01gm％至10gm％。
19．權(quán)利要求10-14中任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.1gm％至5gm％。
20．一種下式的抗增生核苷類似物磷酸酯
其中N為抗增生核苷類似物；Z為S或NH；X為C或S；以及n為1或2。
21．權(quán)利要求18的化合物，其中N為2-氯-脫氧腺苷。
22．權(quán)利要求19的化合物，其中Z為NH,X為CH2和n=2。
全文摘要
藥物組合物,該組合物含有抗增生核苷類似物、DNA鏈封端的二脫氧核苷類似物及用于局部治療皮膚細(xì)胞增生過(guò)度疾病包括牛皮癬的其它核苷類似物的一－、二－和三磷酸酯。核苷類似物的有用磷酸酯包括氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(phosphothiorate),以及具有C和S橋原子的多磷酸酯。
文檔編號(hào)A61K9/06GK1220605SQ96195944
公開(kāi)日1999年6月23日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者卡爾Y·霍斯泰特勒 申請(qǐng)人:卡爾Y·霍斯泰特勒