專利名稱：：細(xì)胞增殖相關(guān)的多核苷酸及其編碼多肽和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一類新的編碼具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白的多核苷酸，及其編碼的多肽，多肽的抗體。本發(fā)明還涉及這類新的多核苷酸在宿主細(xì)胞中外源表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述多肽、抗體在制備預(yù)防和治療與人體細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病，尤其在開發(fā)自身免疫疾病、腫瘤或疾病和外傷的損傷修復(fù)的藥物上的用途。
背景技術(shù)：
：人體屬于高等的多細(xì)胞生物，但同時人也是由一個受精卵生長、分裂、分化而來；人體每天大約有數(shù)千萬的細(xì)胞死亡，同時又有相應(yīng)數(shù)量的細(xì)胞分裂增殖來實現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目的平衡，所以細(xì)胞的分裂和增殖是存活細(xì)胞最基本的特征之一，對于生命體的存在起著決定性作用。細(xì)胞增殖可以分為細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂，其意義在于①生長發(fā)育為多細(xì)胞生物體；②創(chuàng)傷修復(fù)；③細(xì)胞補(bǔ)充。有絲(間接)分裂(mitosis)是高等生物細(xì)胞分裂的主要方式，其主要的特征是形成有絲分裂裝置，減數(shù)分裂(meiosis)是特殊的有絲分裂。細(xì)胞增殖的快慢由細(xì)胞增殖周期(celldivisioncycle)決定，簡稱細(xì)胞周期，是指親代細(xì)胞分裂結(jié)束到子代細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的連續(xù)過程。細(xì)胞周期分為間期和分裂期，根據(jù)細(xì)胞周期的差別，可以把細(xì)胞分為連續(xù)分裂的細(xì)胞、休眠細(xì)胞和不分裂細(xì)胞。在連續(xù)分裂的細(xì)胞中，生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、表皮細(xì)胞具有高度的分裂活性，而在各種疾病中，腫瘤細(xì)胞具有惡性增殖的活性。細(xì)胞增殖的調(diào)控在生物和醫(yī)藥研究領(lǐng)域位于核心地位，增殖調(diào)控紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞染色體異常。簡言之，增殖調(diào)控可以分為以下六類①基因水平的調(diào)控包括細(xì)胞分裂周期基因cdc家族、癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期的檢驗點調(diào)節(jié)；②蛋白質(zhì)水平的調(diào)控包括周期蛋白cyclin、周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK、周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白CDKI等；③細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)包括S期活化因子SPF和成熟促進(jìn)因子MPF等；④生長因子及其受體的調(diào)節(jié)通過與細(xì)胞膜上的專一受體結(jié)合，激活一系列信號傳導(dǎo)通路，最終將增殖信號傳遞到核內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞增殖，現(xiàn)在已經(jīng)分離的生長因子包括表皮生長因子EGF、血小板源生長因子PDGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF、神經(jīng)生長因子NGF、胰島素樣生長因子IGF等；⑤激素的調(diào)節(jié)體內(nèi)的許多激素都對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，如生長激素、性激素等⑥Ca2+-鈣調(diào)素的調(diào)節(jié)該系統(tǒng)對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)位點為啟動DNA合成、誘導(dǎo)核膜解體、參與染色體運動等。細(xì)胞的增殖涉及到機(jī)體的多種生理和病理過程的發(fā)生，有關(guān)細(xì)胞增殖的研究，一直是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個熱點?，F(xiàn)在已知的是，不同細(xì)胞的增殖過程具有不同的病生理意義，細(xì)胞的增殖過程及其意義具有時間和空間的特異性，細(xì)胞增殖異常參與了機(jī)體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。研究細(xì)胞增殖調(diào)控及其與疾病的關(guān)系，必將對多種疾病的預(yù)防和臨床治療、預(yù)后起到指導(dǎo)作用，現(xiàn)舉例如下1)從細(xì)胞增殖角度看，腫瘤的發(fā)生是由于細(xì)胞的惡性增殖所致一般認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞是因為失控生長，過度增殖，從細(xì)胞凋亡的角度看認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是腫瘤的凋亡機(jī)制受到抑制而不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果，但現(xiàn)在普遍認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞失控生長，過度增殖乃是各種腫瘤發(fā)生的主因。上文已經(jīng)提到，機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞增殖受到多種途徑的調(diào)控，形成的一個復(fù)雜而精妙的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由此正常的機(jī)體細(xì)胞增殖具有了接觸抑制性、細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的依賴性；而一旦該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的某個環(huán)節(jié)失調(diào)，就有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如多種腫瘤細(xì)胞系中都存在與增殖相關(guān)的MAPK通路的持續(xù)性活化的現(xiàn)象。因此，從細(xì)胞增殖角度來設(shè)計對腫瘤的治療方法就是修正腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使其重新獲得接觸抑制性、細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的依賴性。2)細(xì)胞增殖的研究將給某些自身免疫病的治療帶來真正的突破自身免疫病包括一大類難治性的免疫紊亂而造成的細(xì)胞異常增殖的疾病，如鱗屑病、紅細(xì)胞增多癥等。廣義上講，自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞及產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞的異常增殖是引起自身免疫病的主要免疫病理機(jī)制，正常情況下，免疫細(xì)胞的活化增殖及凋亡受到極其復(fù)雜而精確的調(diào)控，但在病理過程中，在自身抗原的刺激作用下，識別自身抗原的免疫細(xì)胞被活化增殖而不發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。3)細(xì)胞增殖的研究將為各種疾病和外傷后的損傷修復(fù)帶來突破性進(jìn)展好多疾病和外傷在治愈后損傷組織和器官的功能的恢復(fù)一直是困繞臨床醫(yī)療界的難題。如溶血型鏈球菌引起的風(fēng)濕性心臟病，在控制炎癥后瓣膜已經(jīng)發(fā)生了正常機(jī)體不能修復(fù)的不可逆轉(zhuǎn)性的損傷，此外其他多種病毒和細(xì)菌也可以引起機(jī)體不能修復(fù)的瓣膜??；又如各種類型的關(guān)節(jié)炎、尿毒癥等慢性疾病，都不同程度的存在機(jī)體損傷代償失調(diào)導(dǎo)致不可逆的預(yù)后；再如現(xiàn)在對于二度以上的燒傷所形成的疤痕愈合只能采取皮膚移植的替代療法等等。對于細(xì)胞增殖及其調(diào)控的研究將有助于揭示啟動相關(guān)正常細(xì)胞的增殖，必將為各種疾病和外傷后的損傷修復(fù)帶來突破性進(jìn)展，如現(xiàn)在已經(jīng)有嘗試用fox-3A基因治療風(fēng)濕性心臟瓣膜病的報導(dǎo)。4)細(xì)胞增殖的研究將有助于解決一系列的醫(yī)療難題隨著生活水平的提高，新出現(xiàn)了心腦血管病、老年性癡呆、神經(jīng)損傷致植物人等眾多醫(yī)療難題，這些疾病的治療在相當(dāng)程度上也依賴于相關(guān)細(xì)胞的增殖，如血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖研究對于心腦血管病人治療過程中的血管構(gòu)型重建起著不可替代的作用。5)細(xì)胞增殖調(diào)控的研究進(jìn)展將有助于進(jìn)一步的闡述生命的本質(zhì)，揭示生物體運行的規(guī)律既然很多疾病的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞增殖及其調(diào)控異常相關(guān)，那么對某些疾病進(jìn)行治療性細(xì)胞增殖干預(yù)是合乎邏輯的。許多基因與促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，因此通過各種途徑的基因轉(zhuǎn)移，信號傳導(dǎo)通路干預(yù)等來關(guān)閉體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是研究腫瘤治療的新嘗試，治療價值是不可估量的。相反，可以用促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖來進(jìn)行各種疾病及外傷后的損傷修復(fù)，因此，增殖相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控機(jī)理研究對于進(jìn)一步探討細(xì)胞增殖及其調(diào)控機(jī)制對于今后很多疾病的治療具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容人基因組學(xué)研究目前是國際上的熱點，除大規(guī)模測序的方法外，還缺少從功能研究開始的高通量篩選具有一定功能的基因的方法。針對這種現(xiàn)狀及現(xiàn)有藥物或試劑的不足，本發(fā)明的目的是提供一類新的編碼具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的人蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽。本發(fā)明的另一目的是提供含有這類多核苷酸的載體，和這類多核苷酸及其載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽的抗體和用于檢測的核酸分子。本發(fā)明的另一目的是提供這類新的多核苷酸在宿主細(xì)胞中外源表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多核苷酸和其編碼的多肽的方法以及該多核苷酸及其編碼的多肽的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離的多核苷酸，它包含編碼具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列選自(a)與編碼含有SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)編碼含有與SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14的氨基酸序列有至少70％相似性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14。較佳地，該多核苷酸的序列與選自下組的核苷酸序列有至少85％相似性(a)SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13的編碼區(qū)序列或全長序列；(b)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于(a)中提到的序列的至少一個序列；(c)與(a)或(b)中提到的序列互補(bǔ)的序列雜交的至少一個序列。更佳地，該多核苷酸的序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13的編碼區(qū)序列或全長序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了上述核苷酸所編碼的多肽，它包含具有選自下組中的氨基酸序列的多肽SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14；或與以上任一氨基酸序列具有至少90％以上相似性的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，還提供了被上述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了與上述多肽特異性結(jié)合的抗體，還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100個連續(xù)的核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主細(xì)胞中外源表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖的應(yīng)用。在本發(fā)明的第六方面，提供了上述多核苷酸和多肽在制備預(yù)防和/或治療與人體細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病的藥物中的用途。較佳地，在制備預(yù)防和/或治療與人體細(xì)胞增殖有關(guān)的自身免疫疾病、腫瘤或疾病和外傷的損傷修復(fù)的藥物中的用途。在本發(fā)明地第七方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明中的具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的多肽及藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種自身免疫疾病或腫瘤的體外檢測方法，利用上述抗體或核酸片段來檢測宿主樣品中的多肽的存在或水平。本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如果從天然狀態(tài)中與共同存在的其他物質(zhì)分開，則為分離純化的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分，既然載體或組合物不是它們的天然環(huán)境的成分，這些多核苷酸或多肽仍然是分離的。如本文所用，“相似性”是指核苷酸或多肽序列比對過程中用來描述檢測序列和目標(biāo)序列之間相同DNA堿基或氨基酸殘基順序所占比例的高低，是一種直接的數(shù)量關(guān)系，通過部分相同或相似的百分比來度量核苷酸序列或者多肽序列之間相似的程度，此相似性百分比可以通過本領(lǐng)域已有的比對方法來計算，例子有兩兩序列間的比對方法FASTA程序(Pearson，W.R.andLipman，D.J.1988.Improvedtoolsforbiologicalsequencecomparison.Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，etal.1990Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215403-410)等，或多序列比對方法CLUSTALW(CORPET，F(xiàn).1998Multiplesequencealignmentwithhierarchicalclustering.NucleicAcidsRes.，1610881-10890)等。同源序列是指從某一共同祖先經(jīng)趨異進(jìn)化而形成的不同序列，根據(jù)相似性百分比可以判斷比對序列間的同源性。當(dāng)基因或蛋白質(zhì)間相似程度很高時，表示它們具有一段共同的進(jìn)化歷程，從而判斷它們會具有相似的生物學(xué)功能。當(dāng)具有至少50％的相似程度時，比較容易推測檢測序列和目標(biāo)序列可能是同源序列。較佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度；最佳地，具有至少90％的相似程度。而當(dāng)相似性程度低于20％時，就難以確定或者根本無法確定其是否具有同源性。本發(fā)明的多核苷酸包括其互補(bǔ)鏈可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。如本文所用，“編碼具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。以基因TRAF3IP3所編碼的多肽為例，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是遺傳密碼簡并的變異體。如本文所用，“遺傳密碼簡并”是指一個氨基酸有幾個密碼子的現(xiàn)象。例如在本發(fā)明中TRAF3IP3所編碼的多肽的遺傳密碼簡并的變異體指編碼具有SEQIDNO2的多肽的核苷酸，且此核苷酸與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列有差別。對于其他具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的多肽，可依此類推。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，它編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。該多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明所述多核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交且兩個序列間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與此多核苷酸序列的互補(bǔ)序列可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與本發(fā)明所述的多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明的多核苷酸序列能用本領(lǐng)域已有的方法獲得。這些技術(shù)包括但不局限于(1)通過雜交技術(shù)分離DNA序列；(2)人工化學(xué)合成DNA序列；(3)通過構(gòu)建cDNA文庫大規(guī)模獲得所需的多核苷酸；(4)PCR擴(kuò)增技術(shù)。第一種方法是先構(gòu)建基因組文庫或者cDNA文庫，然后通過分子雜交等技術(shù)從基因組文庫或cDNA文庫中篩選出目的基因或序列。當(dāng)生物基因組比較小時，此方法較易成功；當(dāng)生物基因組很大時，構(gòu)建其完整的基因組文庫較困難，再從龐大的文庫中去克隆目的基因的工程量也很大。第二種方法是按設(shè)計好的序列一次合成100-200bp長的DNA片段，再用這些合成的片段組合連接成完整的基因。這種合成長的基因序列的方法的價格十分昂貴。此方法主要用于合成作為引物、接頭等的核酸片段。第三種方法是用本領(lǐng)域通常的方法構(gòu)建cDNA文庫，多次測序后，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)(Otaetal.NatGenet.2004Jan；36(1)40-5)，大規(guī)模獲得目的cDNA克隆。生物信息學(xué)分析技術(shù)包括但不限于用BLAST或BLAT與已有的公共數(shù)據(jù)庫比對，如refseq數(shù)據(jù)庫等；用Phred算法評估測序質(zhì)量；用計算轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG的出現(xiàn)概率的ATGpr算法篩選全長cDNA序列等。第四種方法用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，etal.Science1985；2301350-1354)。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用的方法是兩步法通量化RT-PCR技術(shù)在混合cDNA文庫中擴(kuò)增得到大量的cDNA克隆?；旌蟘DNA文庫包括現(xiàn)有的cDNA文庫和腫瘤文庫。本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸序列的測定可用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法(Sangeretal.PNAS，1977，745463-5467)；也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需要反復(fù)進(jìn)行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的多核苷酸編碼的人蛋白多肽的片段、衍生物和類似物。術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持與本發(fā)明的天然具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的人蛋白多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物和類似物可以是(a)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)先保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(b)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(c)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。本發(fā)明的多肽可以通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的蛋白多肽(Science，1984；2241431)。包括以下步驟(1)用本發(fā)明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(1)得到的宿主細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化所需的蛋白多肽。本發(fā)明中的多核苷酸和多肽優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明所述多核苷酸的載體。本發(fā)明中，編碼具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒，如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者其他載體。在本發(fā)明中適用的載體可以是原核表達(dá)載體，也可以是真核表達(dá)載體，如在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，etal.Gene，1987，56125)，在哺乳動物細(xì)胞中高表達(dá)的真核表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)，pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下縮寫為pcDT)。本發(fā)明優(yōu)選pcDT，它可以直接與PCR產(chǎn)物連接來構(gòu)建真核表達(dá)載體，大大提高了規(guī)?；a(chǎn)的效率。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以應(yīng)用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含有本發(fā)明所述多核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體即可。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組DNA技術(shù)等(Sambrook，etal.MolecularCloning，aLaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory.NewYork，1989)。本發(fā)明的多核苷酸序列可有效地連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)?shù)膯幼由蟻碇笇?dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)載體優(yōu)選的包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性、或真核細(xì)胞培養(yǎng)用的綠色熒光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氫葉酸還原酶。本發(fā)明還涉及用上述載體或者本發(fā)明的多核苷酸經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體和多核苷酸可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞；293T、Hela細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常有10-300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。例子有在復(fù)制起始點下游的100-270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點下游的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都知道如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收集，用CaCl2法處理，所用步驟是本領(lǐng)域眾所周知的?？晒┻x擇的是MgCl2處理，也可用電穿孔的方法處理。當(dāng)宿主是真核細(xì)胞時，可選擇以下轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法、常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，來表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸所編碼的多肽。根據(jù)所選的宿主細(xì)胞選擇合適的常規(guī)培養(yǎng)基，在適于宿主細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ鐪囟绒D(zhuǎn)化或化學(xué)誘導(dǎo)，來誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。上述方法中的重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過各種分離方法分離和純化重組多肽。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如常規(guī)的復(fù)性處理，用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種液相層析技術(shù)或這些方法的結(jié)合。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含有15個核苷酸，較好的是至少30個核苷酸，更好的是至少50個核苷酸，最好的是至少100個核苷酸。此核酸片段通常是在本發(fā)明的核苷酸序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR擴(kuò)增技術(shù)(如作為引物)以確定和/或分離編碼具有促進(jìn)人體細(xì)胞增殖功能的多核苷酸；也可以作為雜交所用的探針。也可以用于RNA干擾技術(shù)。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部也可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)和基因診斷。探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。本發(fā)明的多肽可以直接作為藥物治療疾病，如自身免疫疾病、腫瘤或疾病和外傷的損傷修復(fù)等；還可用于篩選促進(jìn)或?qū)咕哂写龠M(jìn)細(xì)胞增殖的功能的蛋白的抗體、多肽或其它配體，例如，篩選可用于促進(jìn)或抑制本發(fā)明的蛋白的功能的抗體。用表達(dá)的重組的本發(fā)明的蛋白來篩選多肽庫，用于尋找有治療價值的能夠促進(jìn)或抑制本發(fā)明的蛋白的功能的多肽分子。本發(fā)明的多肽可以單獨使用或者與合適的藥物載體組合后使用。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑及不影響藥物效果的載體和賦型劑。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油及它們的組合。藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。給藥于患者的用量取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。本發(fā)明的多肽也可以通過在活體表達(dá)這些多肽來使用。例如患者的細(xì)胞可以通過在體外用編碼本發(fā)明多肽的基因進(jìn)行基因工程操作，然后將工程細(xì)胞提供給患者，使工程細(xì)胞在體內(nèi)高表達(dá)這種多肽，從而達(dá)到治療的目的。具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白的多核苷酸也可用于多種治療目的。可用在基因治療技術(shù)中來治療由于具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能的人蛋白表達(dá)異?；蚧钚援惓?dǎo)致的疾病。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白，來抑制內(nèi)源性的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白的活性。重組的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白基因也可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。抑制本發(fā)明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。反義RNA和DNA以及核酸可用本領(lǐng)域已有的方法合成。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷間的連接用磷酸硫酯鍵或肽鍵。本發(fā)明的多肽及其片段、衍生物、類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞可以作為抗原來生產(chǎn)抗體。這些抗體包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的多肽的抗體可用本領(lǐng)域公知的抗體制備方法來生產(chǎn)。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(KohlerandMilstein.Nature，1975，256495-497)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)產(chǎn)生(Morrisonetal.PNAS，1985，816851)。單鏈抗體也可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(U.S.PatNo.4946778)。本發(fā)明的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活體標(biāo)本中的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白。還可以在臨床上用于與具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白相關(guān)的疾病的臨床診斷、治療、療效評價等。例如用放射性同位素標(biāo)記與本發(fā)明的多肽結(jié)合的單克隆抗體，然后注入體內(nèi)跟蹤其位置和分布，可以作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法來定位腫瘤細(xì)胞，或判斷腫瘤細(xì)胞是否轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中的抗體還可以用于治療或預(yù)防與具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的人蛋白的產(chǎn)生或活性。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。實驗中檢測的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白水平，可以用作解釋具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白起作用的疾病。具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的多核苷酸可用于具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的多核苷酸可用于檢測具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的表達(dá)與否，或在疾病狀態(tài)下具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的異常表達(dá)。如具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域已公開的成熟技術(shù)，包括Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交等，相關(guān)的試劑盒可以從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)和基因診斷。用具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可以檢測具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白基因的突變也可用于診斷具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白相關(guān)的疾病。具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白基因的突變形式包括與正常野生型的具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的蛋白的DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎帽绢I(lǐng)域已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Westen印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明中的基因在實驗中所有用到的正常組織、胎兒組織、腫瘤組織中都有表達(dá)，說明其為人體自身重要的增殖相關(guān)基因；在不同的組織中表達(dá)量高低有差別，說明其在不同的組織中發(fā)揮功能的程度不同。以下對本發(fā)明的實施方案進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明通過對NCBI的refseq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行人功能未知預(yù)測基因檢索，獲得人未知功能基因序列，進(jìn)一步利用Human_est數(shù)據(jù)庫通過BLASTn方法進(jìn)行序列校正，根據(jù)校正后得到的序列設(shè)計基因特異引物，從混合人組織cDNA文庫中通過兩步法通量化RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到目的基因的編碼區(qū)cDNA片段。此編碼區(qū)cDNA片段與pcDT重組構(gòu)建真核表達(dá)載體。采用pRL家族海腎熒光素酶報告基因法檢測本發(fā)明中的基因促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。pRL載體組成性地表達(dá)海腎熒光素酶，在其它轉(zhuǎn)染條件相同的情況下，海腎熒光素酶活性的強(qiáng)弱可以反映出待檢基因?qū)τ诩?xì)胞狀態(tài)的影響，如細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞存活率等。將與pcDB空質(zhì)粒相比海腎熒光素酶活性明顯降低的基因挑選出來。將這些基因單獨轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit(L-3224)染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，進(jìn)一步觀察并驗證細(xì)胞存活狀態(tài)。該試劑盒中的試驗證明，Calcein-AM是一種胞漿熒光標(biāo)記物，本身無熒光，滲入細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)酯酶催化生成的水溶性綠色熒光物質(zhì)不易透出細(xì)胞，用于活細(xì)胞染色。進(jìn)而通過MTT法檢測本發(fā)明的基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的活性，流式細(xì)胞實驗檢測所選基因?qū)?xì)胞周期的影響，均獲得陽性結(jié)果，均程度不同的對所轉(zhuǎn)染細(xì)胞有誘導(dǎo)增殖的效果。實驗表明本發(fā)明的多肽具有顯著、穩(wěn)定的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、提供了規(guī)?；寺『秃Y選新基因的技術(shù)平臺。2、提供了人類新功能基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2的cDNA序列及其編碼多肽；3、首次發(fā)現(xiàn)人類新功能基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，并且高效、穩(wěn)定；4、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2在機(jī)體多數(shù)正常細(xì)胞表達(dá)，說明其為自身重要的細(xì)胞增殖相關(guān)調(diào)控分子；5、基于上述的4個優(yōu)點，本發(fā)明為進(jìn)一步研究細(xì)胞增殖機(jī)制，以及開發(fā)治療自身免疫疾病、腫瘤或疾病和外傷的損傷修復(fù)等的新藥物，為開創(chuàng)新的臨床診斷、療效評價及預(yù)后指標(biāo)奠定必要的基礎(chǔ)。圖1、真核表達(dá)載體pcDT-X的構(gòu)建示意圖(X選自TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2之一)。圖2、pRL家族海腎熒光素酶基因報告質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖3、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2外源表達(dá)對pRL熒光素酶表達(dá)的影響圖4、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2外源表達(dá)對細(xì)胞存活的影響(明場10×)圖5、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2外源表達(dá)對細(xì)胞存活的影響(CalceinAM染色10×)圖6、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2外源表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖(MTT實驗)圖7、TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SG0L1、ELF3、URP2外源表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖(流式細(xì)胞計數(shù)實驗)具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等箸，科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、兩步法通量化RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)對NCBI的refseq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行人功能未知預(yù)測基因檢索，獲得人未知功能基因序列，并利用Human_est數(shù)據(jù)庫通過BLASTn方法進(jìn)行序列校正，最終得到的序列設(shè)定為下組序列SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13，分別命名為TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2。根據(jù)此類序列設(shè)計這些基因的特異引物(2)用上述引物，按目的基因的表達(dá)譜在現(xiàn)有的cDNA文庫和腫瘤文庫中選擇模板，進(jìn)行初擴(kuò)?，F(xiàn)有的文庫包括12種人體正常組織(心、胰、睪丸、卵巢、前列腺、結(jié)腸、小腸、骨骼肌、胸腺、淋巴結(jié)、扁桃體、白細(xì)胞)；6種人腫瘤組織(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌)；和8種胎兒組積(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎腎、胎腦、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文庫(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初擴(kuò)反應(yīng)條件如下50μlPCR反應(yīng)<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="591">cDNA混合庫5’，3’引物10×Pyrobestbuffer2.5mMdNTPsPyrobest雙蒸水各1.0μl終濃度為2pmol/μl5μl4μl1μl補(bǔ)足至50μl</table></tables>PCR延伸時間根據(jù)所擴(kuò)目的基因的最長片段，按50sec/Kb的原則進(jìn)行擴(kuò)增初擴(kuò)產(chǎn)物純化到30μl，以去除PCR反應(yīng)體系中大量的引物及dNTPs等，并濃縮整個體系，得到對應(yīng)目的基因序列的二級擴(kuò)增庫，作為二擴(kuò)(大擴(kuò))的模板。(3)將(2)中的純化產(chǎn)物作為模板，分別對每個目的基因進(jìn)行二擴(kuò)，反應(yīng)條件如下50μlPCR(每個基因)反應(yīng)<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="573">一擴(kuò)純化產(chǎn)物5’，3’引物10×Ex-Taqbuffer2.5mMdNTPEx-Taq雙蒸水1.6μl終濃度為2pmol/μl5μl4μl0.5μl補(bǔ)足至50μl</table></tables>PCR延伸時間根據(jù)所擴(kuò)目的基因的最長片段，按50sec/Kb的原則進(jìn)行擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物取10μl上樣電泳，挑選有擴(kuò)增條帶的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行等體積純化(40μl)。通過兩步PCR反應(yīng)擴(kuò)增出非單一條帶的基因用Qiagen膠回收試劑盒切膠回收目的片段。擴(kuò)增的結(jié)果表明，這些組織的細(xì)胞中都存在基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2的cDNA，說明TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2在這些組織的細(xì)胞中都產(chǎn)生了基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有較廣的表達(dá)圖譜，在多種組織中參與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。實施例2、目的基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建將二擴(kuò)純化產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，縮寫為pcDT)，按照試劑盒制造廠商建議的條件進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的固體LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選生長的單一克隆菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，挑選有插入片段的陽性克隆，通過測序(ABIPRISM3700DNA分析儀)選出正確的正向插入克隆，各自命名為pcDT-TRAF3IP3、pcDT-ZNF306、pcDT-MGC4368、pcDT-TINP1、pcDT-SGOL1、pcDT-ELF3、pcDT-URP2。同時收集培養(yǎng)液，用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，獲得TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2多肽。TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2蛋白分析結(jié)果顯示TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2蛋白序列如下組序列SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14所示。實施例3、海腎熒光素酶報告基因法測定目的基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的作用用目的基因和pRL家族海腎熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染人胚胎腎293T細(xì)胞，通過檢測海腎熒光素酶的活性來測定目的基因?qū)τ诩?xì)胞狀態(tài)的影響，如細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞活性等。將與pcDB空質(zhì)粒相比海腎熒光素酶活性明顯降低的基因篩選出來。具體操作步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)將1.2×104個293T細(xì)胞(ATCCNumberCRL-11268)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium)培養(yǎng)基(Hyclone，SH0022.02)鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3599)上(100μl培養(yǎng)液/孔)，在5％CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-15AC)中培養(yǎng)24小時。(2)制備轉(zhuǎn)染工作液用2.5μl生理鹽水稀釋20ngpRL家族海腎熒光素酶報告基因載體和80ng待檢基因，輕輕混勻，室溫放置；同樣用2.5μl生理鹽水稀釋0.04μlVigoFect轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入稀釋的待檢基因與報告基因混合液中，輕輕混勻，是為轉(zhuǎn)染工作液，室溫放置15分鐘。(3)轉(zhuǎn)染將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入至(1)中鋪好細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(4)檢測轉(zhuǎn)染24小時后，將96孔板的細(xì)胞以800轉(zhuǎn)/分鐘(EppendorfCentrifuge，5810R)離心5分鐘，棄上清。每孔加入40μl細(xì)胞裂解液，混勻后將96孔板置于-80℃冰箱1小時以上。將96孔板從-80℃解凍后恢復(fù)至室溫，每孔吸取10μl細(xì)胞裂解液移至白色酶標(biāo)板，用微孔板酶標(biāo)儀(GeniosPro，Tecan)檢測海腎熒光素酶活性。海腎熒光素酶底物用量為每孔25μl。pRL載體是將海腎熒光素酶基因與基礎(chǔ)性表達(dá)的啟動子偶聯(lián)，提供組成性表達(dá)的海腎熒光素酶。實驗過程中條件的改變會影響海腎熒光素酶的表達(dá)，這些因素包括細(xì)胞存活狀況(細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞健康狀況等)、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞裂解效率及檢測效率等。在實驗系統(tǒng)誤差的前提下，同一塊96孔板的轉(zhuǎn)染及檢測效率基本近似，因此，海腎熒光素酶活性的明顯升高可以反映出細(xì)胞數(shù)量的增加或者細(xì)胞活性的增強(qiáng)，我們以pcDB質(zhì)粒作為對照，將與pRL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后引起海腎熒光素酶活性明顯降低的基因篩選出來。結(jié)果如圖3所示基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2與pcDB比較，明顯上調(diào)了海腎熒光素酶活性。表明基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2可改變轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活狀況。實施例4、利用染料觀察細(xì)胞增殖狀況用實施例3中篩選出的基因單獨轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，利用LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit(MolecularProbe，L-3224)對細(xì)胞進(jìn)行染色，按產(chǎn)品說明書所述進(jìn)行操作，于倒置熒光顯微鏡(Zeiss，Axiovert200M)下觀察細(xì)胞存活狀況(包括明場及熒光激發(fā)狀態(tài))。具體操作步驟如下本實驗用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3599)操作，每個待檢基因設(shè)置3個平行重復(fù)孔，分別以pcDB空質(zhì)粒和K-ras質(zhì)粒做為空載體和陽性對照。下述步驟中的用量均為單孔用量。(1)細(xì)胞培養(yǎng)將1.2×103個293T細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(100μl培養(yǎng)液/孔)，置37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(2)制備轉(zhuǎn)染工作液用2.5μl生理鹽水稀釋100ng待檢基因，輕輕混勻，室溫放置；同樣用2.5μl生理鹽水稀釋0.04μlVigoFect轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入至稀釋的待檢基因溶液中，輕輕混勻，是為轉(zhuǎn)染工作液，室溫放置15分鐘。(3)轉(zhuǎn)染將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入至(1)中鋪好細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻，置37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。(4)鏡檢轉(zhuǎn)染48小時后，用Zeiss顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。待檢質(zhì)粒分別與pcDB和K-ras比較。結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2基因24小時后，所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞數(shù)目明顯增加。(5)染色用5mlPBS溶液稀釋2.5μl4mMCalceinAM(活細(xì)胞染料)儲存液，充分混勻；終濃度為1μMCalceinAM。棄去轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液，用溫育的PBS(37℃)洗滌兩遍。加入50μl稀釋好的染料，置37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至1小時。(6)鏡檢棄去染料，用PBS洗滌一遍，加入100μlPBS，用Zeiss倒置熒光顯微鏡觀察。CalceinAM激發(fā)光波長為485±10nm，發(fā)射光為530±12.5nm。結(jié)果如圖5所示，基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2與空載體比較，相同視野中所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基礎(chǔ)存活狀態(tài)良好，而綠染細(xì)胞(CalceinAM染色細(xì)胞，發(fā)綠色熒光)較空載體pcDB明顯增多，與陽性對照K-ras效果接近，說明TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2可在不同程度上誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖。實施例5、MTT檢測細(xì)胞增殖活性用實施例3中篩選出的基因單獨轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，利用CellTiter96Non-radioactiveCellProliferationAssayKit(Promega，G-4100)對細(xì)胞進(jìn)行處理，按產(chǎn)品說明書所述進(jìn)行操作，于MCROPLATEREADER(BIO-RAD，Model550)下檢測細(xì)胞在570nm的吸收峰做增殖曲線。具體操作步驟如下本實驗用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3599)操作，每個待檢基因設(shè)置6個平行重復(fù)孔，同時平行做6塊板以繪制增殖曲線。分別以pcDB空質(zhì)粒和K-ras質(zhì)粒做為空載體和陽性對照。下述步驟中的用量均為單孔用量。(1)細(xì)胞培養(yǎng)將1.2×103個293T細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(100μl培養(yǎng)液/孔)，置37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(2)制備轉(zhuǎn)染工作液用2.5μl生理鹽水稀釋100ng待檢基因，輕輕混勻，室溫放置；同樣用2.5μl生理鹽水稀釋0.04μlVigoFect轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入至稀釋的待檢基因溶液中，輕輕混勻，是為轉(zhuǎn)染工作液，室溫放置15分鐘。(3)轉(zhuǎn)染將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入至(1)中鋪好細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻，置37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)加入MTT轉(zhuǎn)染后每24小時，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。然后每孔加入15ulMTT溶液(5mM，Promega，Madison，WI，USA)，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時，然后加入100ulSolubilization/StopSolution在37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中再孵育1小時。(5)檢測孵育1小時后，把板放入MCROPLATEREADER(BIO-RAD，Model550)中，檢測每孔細(xì)胞在570nm的吸收峰，同時扣除作為本底的620nm的吸收峰。(6)繪制增殖曲線每個基因均以六天的測量結(jié)果OD570為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果如圖6所示，基因TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2與空載體比較，其增殖曲線斜率均明顯增大，與陽性對照K-ras效果接近，說明TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2可在不同程度上誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖。實施例6、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期用實施例3中篩選出的基因單獨轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀檢測待檢質(zhì)粒的細(xì)胞周期以反映相應(yīng)基因誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的功能。具體操作步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)將293T細(xì)胞(1×105)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3599)上，置37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(2)制備轉(zhuǎn)染工作液用8μl生理鹽水稀釋500ng待檢質(zhì)粒，輕輕混勻，室溫放置；同樣用8μl生理鹽水稀釋0.16μlVigoFect轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋的VigoFect轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入至稀釋的待檢質(zhì)粒溶液中，輕輕混勻，室溫放置15分鐘。(3)轉(zhuǎn)染將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入至細(xì)胞培養(yǎng)板(500μl培養(yǎng)液/孔)中，輕輕混勻，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(4)收獲待測細(xì)胞，每個樣品大約5×105到1×106，用預(yù)冷的PBS洗3次，1,500rpm，5min；(5)用最后一次洗細(xì)胞棄上清后的回流液將細(xì)胞懸起，在Vortex上逐滴加入預(yù)冷的70％乙醇3ml，輕輕混勻細(xì)胞，4℃固定過夜；(6)固定的細(xì)胞用PBS洗一次，1,500rpm，5min，加入500ulPBS混勻，加入10ul(10mg/ml)Rnase，37℃消化30min；(7)用尼龍膜把細(xì)胞過濾到FACS測定管(FALCON，352052)中，每管加入一滴500ug/ml的PI-Triton-X100(北京寶賽生物技術(shù)有限公司，CX1001-2)染液，混勻，10min后上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD，USA)測細(xì)胞周期。分析細(xì)胞周期中M+G2/S占活細(xì)胞的比例，其高低就代表的細(xì)胞增殖活性的強(qiáng)弱。結(jié)果如圖7所示，TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SG0L1、ELF3、URP2與空載體比較均有陽性結(jié)果，與陽性對照K-ras作用相似，只是各個基因作用程度不一。說明TRAF3IP3、ZNF306、MGC4368、TINP1、SGOL1、ELF3、URP2可以不同程度上誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。序列表<110>北京諾賽基因組研究中心有限公司<120>細(xì)胞增殖相關(guān)的多核苷酸及其編碼多肽和用途<130><160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2058<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(291)..(1886)<400>1gcccagacctatggattgaaagcgtgtgctttacccatctgctgtcttgctccatctgag60accagagccaagatctgcccaggactggaatgctttcccgagtggcttgagttggagcct120gggactaggagcagccttattgaggtacaattcatgtgcttgtgggtttggatggcacaa180tctgtgtctgggctaaggaaagcagacttggcaccaacattaaccctgacagatccaggc240atctattccaggaactggaagccaagcgcaacaggtgcttggaggtcatcatgatc296MetIle1agcccagaccccaggccctcccctggcttggcccggtgggctgagagc344SerProAspProArgProSerProGlyLeuAlaArgTrpAlaGluSet51015tatgaggccaagtgtgagcgcaggcaagagatccgtgaaagccgccgc392TyrGluAlaLysCysGluArgArgGlnGluIleArgGluSerArgArg202530tgccgtcccaatgtgaccacttgccgccaggtggggaagacgctgagg440CysArgProAsnValThrThrCysArgGlnValGlyLysThrLeuArg35404550atccaacagagagagcagctccagagagctcgactgcagcagttcttc488IleGlnGlnArgGluGlnLeuGlnArgAlaArgLeuGlnGlnPhePhe556065aggaggaggaacctggagctagaggagaagggcaaagcgcagcatccc536ArgArgArgAsnLeuGluLeuGluGluLysGlyLysAlaGlnHisPro707580caggccagggagcaagggccctccaggcggccaggacaggtgacaggc584GlnAlaArgGluGlnGlyProSerArgArgProGlyGlnValThrGly859095accagctctgaagtctttccagcccagcatcctcctccctcaggcatc632ThrSerSerGluValPheProAlaGlnHisProProProSerGlyIle100105110tgcagggatctgtctgaccacctctcctcacaggctgggggccttcct680CysArgAspLeuSerAspHisLeuSerSerGlnAlaGlyGlyLeuPro115120125130ccacaggacactcccatcaagaagccacccaaacaccaccgtggtact728ProGlnAspThrProIleLysLysProProLysHisHisArgGlyThr135140145cagacaaaggcagaaggaccaacaattaagaacgatgccagtcagcaa776GlnThrLysAlaGluGlyProThrIleLysAsnAspAlaSerGlnGln150155160accaattacggagttgcagttctggataaggaaatcatccagctttct824ThrAsnTyrGlyValAlaValLeuAspLysGluIleIleGlnLeuSer165170175gattacctcaaagaggccctacaaagggagctggtcctaaaacagaaa872AspTyrLeuLysGluAlaLeuGlnArgGluLeuValLeuLysGlnLys180185190atggtgattctccaagacctactgtccactctgattcaggcctctgac920MetValIleLeuGlnAspLeuLeuSerThrLeuIleGlnAlaSerAsp195200205210agctcttggaagggacagcttaatgaagacaaactgaaggggaaactg968SerSerTrpLysGlyGlnLeuAsnGluAspLysLeuLysGlyLysLeu215220225agatccttagaaaaccagctatacacctgtacccagaaatactcccct1016ArgSerLeuGluAsnGlnLeuTyrThrCysThrGlnLysTyrSerPro230235240tggggaatgaaaaaagtactactggagatggaagaccagaaaaacagc1064TrpGlyMetLysLysValLeuLeuGluMetGluAspGlnLysAsnSer245250255tatgagcagaaggccaaggagtcactgcagaaagtgctggaggagaaa1112TyrGluGlnLysAlaLysGluSerLeuGlnLysValLeuGluGluLys260265270atgaatgcagagcagcaactacagagcacacagcgatccctggccctg1160MetAsnAlaGluGlnGlnLeuGlnSerThrGlnArgSerLeuAlaLeu275280285290gcagagcagaagtgtgaagagtggaggagccagtatgaggctctgaag1208AlaGluGlnLysCysGluGluTrpArgSerGlnTyrGluAlaLeuLys295300305gaggactggaggacccttgggacccagcacagggagctggagagccaa1256GluAspTrpArgThrLeuGlyThrGlnHisArgGluLeuGluSerGln310315320ctccacgtgcttcagtccaaactgcagggagcagatagcagggactta1304LeuHisValLeuGlnSerLysLeuGlnGlyAlaAspSerArgAspLeu325330335cagatgaaccaggccctgcgatttttggaaaatgagcaccaggaactg1352GlnMetAsnGlnAlaLeuArgPheLeuGluAsnGluHisGlnGluLeu340345350caggccaagattgaatgcctgcaaggggacagagacctgtgcagcttg1400GlnAlaLysIleGluCysLeuGlnGlyAspArgAspLeuCysSerLeu355360365370gatacccaggacctacaagatcaactaaaaaggtcagaggcagagaaa1448AspThrGlnAspLeuGlnAspGlnLeuLysArgSerGluAlaGluLys375380385ctcaccctggtgaccagagtacagcagttgcagggtttgcttcaaaat1496LeuThrLeuValThrArgValGlnGlnLeuGlnGlyLeuLeuGlnAsn390395400caatccttacagcttcaagaacaggagaaactcttaacaaagaaagat1544GlnSerLeuGlnLeuGlnGluGlnGluLysLeuLeuThrLysLysAsp405410415caggctttgcccgtgtggagtccaaagtccttccctaacgaagtggag1592GlnAlaLeuProValTrpSerProLysSerPheProAsnGluValGlu420425430cctgagggtacagggaaggagaaa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