專利名稱:兩性分子與單克隆或多克隆抗體結(jié)合用于放射顯影和治療的制作方法
總的說本發(fā)明是關于兩性分子的應用,尤其是涉及用諸如陰離子去污劑等兩性分子來增加毒素、放射性同位素和藥物的免疫結(jié)合物的溶解度和降低結(jié)合或未結(jié)合的單克隆抗體的非特異性吸收。
近年來應用單克隆抗體作為靶子或給藥載體促使各種新的抗癌辦法的出現(xiàn)。其中辦法之一是應用未結(jié)合抗體的血清治療,也就是抗體與放射性同位素,藥物或毒素結(jié)合,其結(jié)合物稱為“免疫結(jié)合物”。有各種將這些制劑與抗體偶聯(lián)的方法,例如通常用的毒素法。它是把二硫基團引入抗體而把硫氫基團引入毒素,接著,通過一個共價二硫鍵形成免疫毒素。這種改變通常增加結(jié)合物的疏水性和促進它們的凝聚,甚至沉淀。盡管人們努力控制抗體取代的程度,結(jié)合物在貯藏期間經(jīng)常不穩(wěn)定,并自發(fā)地沉淀,結(jié)果降低了效價、穩(wěn)定性和治療效果。按照慣例,控制免疫結(jié)合物溶解度的唯一方法是控制不同的雙功能配體的取代程度。可是,這種技術有一個最大缺點,即限制了毒素與抗體結(jié)合的數(shù)量,同時在抗體與毒素中取代像賴氨酸那樣的功能基團方面是互相矛盾的。此外,某些未結(jié)合的抗體如IgG亞族的抗體,每次從腹水或用過的培養(yǎng)基中提純時都很難溶解。像已分離出的抗體那樣,它們在4℃貯藏或在-70℃重建時能自發(fā)地沉淀。于是這些抗體亞族產(chǎn)生高度不溶解和不穩(wěn)定的免疫毒素。盡管有很多不同方法使藥物、同位素和毒素連結(jié)到抗體上,但大多數(shù)方法都有一個類似的溶解度的問題。
在制備免疫毒素結(jié)合物時,還存在進一步的問題。例如最常用的毒素是由兩條多肽鏈,即A鏈和B鏈組成,它們通過二硫鍵相連接。毒素通過B鏈上的識別部位結(jié)合到細胞表面的受體上,而A鏈則穿透(或是易穿過)細胞膜進入胞漿,它在那里抑制蛋白質(zhì)的合成。大多數(shù)免疫毒素是用A鏈單獨地連接到特異抗體上而形成的,但應用完整毒素有很多潛在的優(yōu)點。典型的完整毒素結(jié)合物比單獨用A鏈制備的結(jié)合物制劑具有更高的效價。這里因為B鏈在免疫毒素的內(nèi)部化中履行一個重要角色,它是免疫結(jié)合物限定效價的因素。實際上,內(nèi)部化的增加將轉(zhuǎn)變?yōu)樾r的增加。此外,如果在試圖制備結(jié)合物之前就必須把A鏈與B鏈分開的話,那么免疫毒素的制備就更加困難。這些涉及到的親合純化步驟和為把分子內(nèi)二硫鍵打開而降低A鏈與B鏈結(jié)合的步驟。這使制造完整毒素制劑,使其具有抗原性細胞的選擇性效價的方法存在著很多限制。Thorpe等人(見Immun.Rev.62119-159,1982)證實用完整毒素與抗體結(jié)合可以生成選擇性免疫結(jié)合物,它可簡單地將完整毒素通過N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP)與抗體結(jié)合,一定百分率的免疫毒素分子封鎖了不能與糖類結(jié)合的B鏈,從而不能調(diào)節(jié)對不攜帶抗原的腫瘤細胞或正常細胞的毒性。親和層析能夠除去與B鏈結(jié)合的分子,該分子仍保留與糖類結(jié)合的能力。可是,即使在完全除去之后,某些免疫毒素的制劑仍具有高水平的非特異性和毒性。其原因尚不清楚。
除免疫結(jié)合物的溶解度和毒素以外,當用于體內(nèi)時,單克隆抗體和它們的結(jié)合物非特異性攝入到網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)各器官如肺、肝、脾和骨髓中限制了它們的潛在效價,從而降低了治療指數(shù)。RES的成分同樣存在于許多其它組織,包括淋巴結(jié)、扁桃腺和小腸。FC受體可被考慮是單克隆抗體及其結(jié)合物被非特異性攝入RES器官的主要部分。另一些體體系如Cb或Cd受體,免疫復合受體和糖類或糖蛋白受體同樣可參于是抗體的非特異性吸收。已經(jīng)證實,糖類受體也結(jié)合毒素分子上的殘基,從而可加強免疫結(jié)合物的非特異性攝取。
目前,用酶破碎抗體是降低受體調(diào)節(jié)攝取的標準技術。然而,該方法無論對放射標記的抗體制備及免疫結(jié)合物的制備均有一些缺點。
首先,酶破碎抗體FC部分的方法從質(zhì)和量的控制上都很困難,因為必須要測定抗體制劑中殘留的酶。其次,已證實F(ab)2片段與完整抗體比較增加了降解率。第三,用F(ab)′或Fab(抗體單價片段)有一個附加的缺點,即由于抗體只通過一個結(jié)合點結(jié)合,對抗原的親合力大大地降低。此外,配位體取代到抗體片段中比到完整抗體中受到更多的限制,但增加了取代到抗原結(jié)合部位的可能性,從而將降低片段的免疫活性。還有一些研究證實了用片段比用完整抗體穩(wěn)定地增加了攝入腫瘤中的量,而降低了在RES器官中的積累。
在純化單克隆抗體時經(jīng)常遇到的另一個問題是內(nèi)毒素的污染。在某些情況下,內(nèi)毒素與抗體一起被純化,好像它被結(jié)合到單克隆抗體上了。在這種情況下,用常規(guī)方法將內(nèi)毒素與抗體分離是不成功的,因為除去內(nèi)毒素時也除去了抗體。由于內(nèi)毒素乙引起高燒甚至休克,所以這些污染的抗體制劑就不能用于病人。
綜如上述,需要一種技術(a)當抗體附加連接物或細胞毒素后,要有一個增加免疫結(jié)合物溶解度的有效手段;(b)一個實質(zhì)上抑制抗體和抗體結(jié)合物攝入FC和其它受體的方法,并抑制其攝入RES器官;(c)一個降低完整毒素免疫結(jié)合物的毒性的方法;和(d)在不影響抗體回收的情況下,一個降低抗體制劑中內(nèi)毒素污染水平的方法。本發(fā)明滿足了這些需要,還進而提供了其它有關的優(yōu)點。
簡言之,本發(fā)明關于應用諸如陰離子去污劑等兩性離子來增加免疫結(jié)合制劑的溶解度,降低抗體通過受體調(diào)節(jié)機制(結(jié)合或未結(jié)合的)攝入到RES器官的量。
本發(fā)明特別揭示了增加免疫結(jié)合物溶解度的方法,包括將免疫結(jié)合物制劑與足夠量的兩性分子溫育來增加制劑的熱解度。根據(jù)最佳實施例,所用的兩性分子為諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)的一種陰離子去污劑。本發(fā)明還涉及增加未結(jié)合免疫球蛋白溶解度的方法,將免疫球蛋白制劑與足夠量的諸如陰離子去污劑等兩性分子溫育來增加免疫球蛋白制劑的溶解度。在本發(fā)明的一個實施例中,所用免疫球蛋白制劑是一種鼠的亞族IgG。
本發(fā)明的第三個方面,是揭示了降低抗體與受體結(jié)合的方法,包括將抗體與足夠量的諸如陰離子去污劑的兩性離子溫育從而在不改變抗體對靶抗原結(jié)合的情況下降低了它與受體的結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面,揭示了降低完整毒素結(jié)合物毒性的方法,包括將毒素結(jié)合物與足夠量諸如陰離子去污劑等中兩性分子溫育以降低完整毒素結(jié)合物的毒性。
本發(fā)明再一方面指出了降低單克隆抗體制劑中內(nèi)毒素水平的方法,包括將單克隆抗體制劑與足夠量諸如陰離子去污劑的兩性分子溫育,從而降低制劑中內(nèi)毒素的水平。
基于下面的詳述及附圖,本發(fā)明的其它方面是顯而易見的。
附圖表示處理的、未處理的和單克隆抗體9.2.27的F(ab′)片段與一種人黑色素結(jié)合抗原及它們結(jié)合到人外周單核細胞上的FC受體的流動細胞計數(shù)。
在敘述本發(fā)明前,對下面所用術語明確定義一下是需要的。
免疫結(jié)合物單克隆抗體或多克隆抗體與植物、真菌、細菌毒素或它們的A鏈,核糖體失活蛋白,通過載體分子直接或間接結(jié)合到抗體上的藥物,放射性同位素的配位體,能直接或間接活化細胞毒素機制的生物反應效應物或其它細胞毒素制劑結(jié)合到一起形成的一種共價結(jié)合物。
陰離子去污劑帶有一個溶于油,脂或其它有機溶劑的非極性烴端和一個溶于水中的極性端帶負電荷的去污劑,或一個相似的兩性分子。
通過腫瘤抗體對特異性靶細胞溶胞進行被動免疫治療的設想,本世紀以來引起人們很大的興趣。然而抗體摧毀動物或人腫瘤的能力總是有限的。結(jié)果有一系列增加抗體效能的設想被提出來。首先是Mathe等人(C.R.Acad.Sci.<Paris>2461626,1958)提出將抗癌藥附在這些抗體上;Moolten和Cooperband(science16968,1970)提出用毒素加在抗體上;Ghose和Blair提出(Ann.NY.Acad.Sci.277671,1976;J.Nat1.Cancer Inst,61657,1978)用放射性同位素或酶結(jié)合在抗體上。然而,如果這種免疫結(jié)合物只是對靶組織特異的,那么高效能只有利于腫瘤治療,因為當結(jié)合抗體的毒素結(jié)合物運送到體內(nèi)時仍是隋性的,僅僅當抗體結(jié)合到靶細胞后才變得有活性。
通過應用共價連接在特異性抗體上的細胞毒素制劑殺傷腫瘤細胞取得了有意義的進展,(Jansen等人,Immun.Rev.62186,1982;Thorpe和Ross,Immun.Rev,62119,1982),然而將免疫結(jié)合物用于治療還一直是個問題。例如應用完整毒素需要較少的操作毒素分子和增加抗靶細胞效能,然而通過估計是疏水部分毒素B鏈的非特異性結(jié)合迄今為止使得體內(nèi)用完整的毒素結(jié)合物不是對所有抗體都是可行的。后一問題可能是結(jié)合用抗體的功能問題。一些研究者報道了有毒的毒素結(jié)合物,而另一些人報導了無毒的。本發(fā)明人所用的一個抗體9,2,27(r2a族)與完整abrin形成無毒的結(jié)合物,用抗L10肝細胞性癌的DMAb(rl族)與完整abrin結(jié)合形成對正常組織高度毒性的結(jié)合物。這種毒性可用SDS除去。B鏈可被除去,而A鏈單獨與單克隆抗體偶聯(lián)。沒有B鏈通常導致降低免疫毒素的效能。
如上所述,在體內(nèi)應用免疫結(jié)合物還有另一些問題,包括抗體通過諸如Fc受體等其它結(jié)合方式非特異性攝入RES器官及在貯存期間免疫結(jié)合物溶解度降低而自發(fā)沉淀,從而導致效價和治療效果降低。通過應用諸如陰離子去污劑等兩性分子則有效地改善了上述問題。
本發(fā)明中,諸如陰離子去污劑等兩性分子被用來(a)增加免疫結(jié)合物制劑的溶解度;(b)增加未結(jié)合的免疫球蛋白制劑的溶解度;(c)降低抗體對FC受體的結(jié)合;(d)降低完整毒素結(jié)合物的毒素性;和(e)降低單克隆抗體制劑中內(nèi)毒素水平。
本發(fā)明內(nèi)可用不同的陰離子去污劑,包括十二烷基硫酸鈉,十六烷基硫酸銨,?;悄懰帷?yōu)選的陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)。可用于本發(fā)明的其它陰離子去污劑可在“Mc Cutcheon氏乳化劑和去污劑”(MC Publishing,Glen Rock,New Jersey)中查到。陰離子去污劑的特征是通常具有一個大的非極性烴基端和一個極性端,如SDS,其通式為
一般認為陰離子去污劑如SDS即結(jié)合一個帶正電荷的基團(即,賴氨酸的r氨基)也結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水區(qū)。人們想像這些疏水區(qū)是負責B鏈非特異性結(jié)合到非抗原細胞或抗體結(jié)合到FC受體的區(qū)域。
進而,由于結(jié)合增加的疏水性使生成的免疫結(jié)合物易于凝集和沉淀。然而,SDS通過它與疏水區(qū)相互作用降低分子間自身結(jié)合,從而減少了沉淀凝集。
上述的每個方法中,都必須將抗體制劑與諸如陰離子去污劑的兩性分子溫育,從而達到預期效果。優(yōu)選的去污劑濃度為0.01%到1%(W/V)。此外,優(yōu)選的溫育條件約在室溫(25℃)或37℃下,30-60分鐘。最佳的時間與溫度組合為37℃下約30分鐘和25℃下約1小時。優(yōu)選的除去未與抗體結(jié)合的陰離子去污劑的方法是4℃下結(jié)晶,凝膠過濾或過清蛋白-Sepharose柱。后一方法是將游離SDS與結(jié)合在抗體上SDS分開的最有效方法,能回收90%以上的抗體。
增加免疫結(jié)合物溶解度和降低其非特異性攝入RES器官優(yōu)選的方法是在將抗體和細胞毒素偶聯(lián)后開始的。如上所述,這些方法包括將免疫結(jié)合物與濃度為0.01%到1%(W/V)的SDS一起溫育。雖然高或低的濃度均可用,但典型的免疫結(jié)合物制劑劑量為1mg/ml。更確切地說,免疫結(jié)合物制劑是以一個小的體積相對高的濃度被處理的,從而以后可作適當?shù)南♂尅H绻庖呓Y(jié)合物制劑為1mg/ml的溶液,那么就用10%的SDS溶液處理它?;旌虾?,將其放置37℃30分鐘或室溫下1小時。25℃下成功地處理時,所用免疫細胞毒素的最高濃度為10mg/ml。用上述濃度,在25℃用SDS處理時一般溶解度很低,而37℃下處理溶解度較高。這樣處理的重要特色是只需將其與去污劑短時間溫育。典型的溫育條件是37℃下或25℃下30分鐘-60分鐘。
處理后,未與抗體結(jié)合的SDS用下述方法除去。首先是結(jié)晶,在4℃下冷卻導致過量的SDS結(jié)晶出來。取出上清液,過G-25柱進一步將低分子量的SDS從免疫結(jié)合物中除去。還可將其過清蛋白-Sepharose柱,將未被吸附的抗體回收。愿意的話,還可用與吖啶橙結(jié)合方法和在甲苯中溶解的方法測定結(jié)合在蛋白上的殘存SDS或游離的SDS。
由于過清蛋白-Sepharose柱僅除去了游離SDS即未與抗體結(jié)合的SDS,SDS似乎穩(wěn)定地與抗體結(jié)合了,又因為抑制了體內(nèi)RES對抗體的攝取,即使在血清中循環(huán)后由于血清中各種其它蛋白對SDS的在競爭而抑制RES對抗體的攝取。
既可用SDS處理未結(jié)合的單克隆抗體制劑,也可處理結(jié)合的制劑,對后者既可用可溶性制劑即超過離心(100,000×g,60分鐘)步驟后的上清液,也可用已發(fā)生自發(fā)沉淀的免疫結(jié)合物制劑。在與SPDP或其它異雙功能連接劑結(jié)合時經(jīng)常發(fā)生自發(fā)沉淀,這是由于過多結(jié)合,即溫育時間太長或制劑濃度過高引起的。用SDS處理這些不溶的沉淀可使其再溶。更重要的是,SDS可使免疫結(jié)合物制劑可溶性穩(wěn)定,即在4℃下貯存時免疫結(jié)合物制劑仍可溶,并不隨時間加長而增加沉淀;而未處理的免疫結(jié)合物則有這些缺點。
進而,已證實用SDS還可使藥物結(jié)合物,衍生物的抗體或與如聚-L-賴氨酸的載體結(jié)合的抗體恢復可溶性。特別是對如亞德里亞霉素等對抗體-藥物結(jié)合物具高度疏水性的藥物更為有效。對毒素結(jié)合物和藥物結(jié)合物,用SDS處理后進行效價試驗發(fā)現(xiàn),似乎都沒失去活性,也沒失去殺傷抗原細胞的抗原特異性或抗原選擇性。
此外,還證實SDS可用來穩(wěn)定未結(jié)合抗體。例如從腹水或用過的培養(yǎng)液分離出的IgG亞族抗體溶解度很低。它在4℃或-70℃時自發(fā)沉淀,然而如上述用SDS處理后,加強了這個特別不穩(wěn)定的亞族的溶解度。另外,短時間將其暴露于SDS似乎對這種未結(jié)合的抗體亞族的免疫活性幾乎沒有什么影響。
總結(jié)下述的例子,例1說明適用的陰離子去污劑對免疫活性的影響。例2說明用陰離子去污劑抑制FC受體調(diào)節(jié)的結(jié)合和降低RES非特異性的攝取。例3說明應用陰離子去污劑在體內(nèi)降低完整毒素結(jié)合物的毒性。例4說明應用陰離子去污劑降低單克隆抗體制劑中內(nèi)毒素的水平。
下面的例子只是說明本發(fā)明,但不限制本發(fā)明。
例1陰離子去污劑對免疫反應活性的影響。
這個例子說明將陰離子去污劑與免疫結(jié)合物或免疫球蛋白溫育以改善其溶解度,本質(zhì)上沒有影響抗體與抗原結(jié)合的能力。如表Ⅰ所示,將SDS以特定時間,量,加入未結(jié)合的抗體(1毫克/毫升),然后在一個0.5毫升體積的小型G-25柱上離心除去游離的SDS。再測定0.1μg抗體結(jié)合105個黑色素瘤細胞。加入熒光標記的免疫球蛋白,再用流動細胞計數(shù)儀檢驗細胞。測定SDS處理和未用SDS處理的抗體制劑結(jié)合黑色素瘤細胞的平均熒光強度。比較平均熒光強度,以未經(jīng)SDS處理的抗體與黑色素瘤細胞結(jié)合數(shù)的百分數(shù)計算。在25℃溫育時結(jié)合數(shù)低于0.2%,37℃時低于0.1%,均無抑制意義。
表Ⅰ暴露時間百分數(shù) 5分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘1 72* 70 50 360.5 56 67 83 74 25℃0.2 79 78 84 890.1 88 88 84 860.05 95 98 94 N.T.
0.01 104 104 99 102暴露時間百分數(shù) 5分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘1 62 44及 39 230.5 72 79 38 28 37℃0.2 70 77 78 620.1 98 89 91 N.T.
0.05 100 96 101 970.01 101 102 101 102*對照百分數(shù)例2SDS調(diào)節(jié)抑制FC受體的結(jié)合和RES的攝取。
如圖1所示,將抗體與陰離子去污劑溫育,將抑制Fc受體與細胞的結(jié)合。如上所述,在非特異性的RES攝取中,F(xiàn)c受體的結(jié)合可能起重要的作用。如表2所示,用去污劑處理的抗體制劑降低了非特異性抗體攝入RES組織,如肝和脾中的量。
A.調(diào)節(jié)Fc受體結(jié)合減少
將去污劑處理的抗體,未處理的抗體和F(ab′)2片段與人單核白細胞溫育,再用流動細胞儀計數(shù)分析。培養(yǎng)的人單核白細胞表達出被證實為鼠單克隆抗體的Fc受體。用0.1%低濃度的SDS處理一種Ig G2a抗體的單克隆抗體9,2,27,有效地降低了它與Fc受體的結(jié)合能力,降低的水平與F(ab′)2制劑的對照比較,是可觀察到的(見圖1)。
將單克隆抗體9,2,27(小鼠抗-人黑色素瘤)與0.1%或1%(W/V)SDS在25℃溫育30分鐘。將該SDS處理過的抗體(0.1μg)與5×10個沖洗過的人單核白細胞(>95%純度),在4℃溫育30分鐘。未處理的9,2,27和F(ab′)2片段作為對照。將單核白細胞洗兩次,與FITC-標記的山羊抗小鼠F(ab′)2混勻,用流動細胞儀計數(shù)分析。圖1表明單克隆抗體9,2,27與0.1%或1%SDS溫育后得到的抗體結(jié)合曲線與9,2,27F(ab′)2片段的結(jié)合曲線非常相似。這些資料說明用SDS處理的抗體會對FC受體與人單核白細胞的結(jié)合產(chǎn)生實質(zhì)性地抑制。
B.降低RES非特異性的攝取檢驗上面(A)所述結(jié)合活性的降低,從而進一步測定體外結(jié)合的結(jié)果是否說明在經(jīng)人黑色素瘤異種移植的裸鼠中降低了非特異性攝取。如表Ⅱ所示,活體中的1%SDS處理過的抗體與未處理過的抗體比較,其非特異性攝取減少了。對腫瘤部位探測,兩種抗體攝取量是相等的,也許這是因為用SDS處理后失去了一些免疫反應活性(見表Ⅰ)。用濃度降低的SDS(0.1%)進一步試驗,表明加強了腫瘤部分的攝取。試驗表明,SDS降到0.01%足以抑制RES的攝取。
表2SDS對未結(jié)合抗體在活體中生物分布的影響抑制百分數(shù)%
組織 (用SDS)脾 52.5肝 50.0肺 -14.3腎 33.3肌肉 33.3甲狀腺 -48.1試驗程序如下將250μg的125I標記的(氯胺-T)抗體與1%(W/V)SDS在25℃溫育30分鐘。將SDS處理的放射性碘標記的抗體以50μg/每只動物的劑量給鼠靜脈注射。對照動物用未處理的I標記的抗體靜脈注射。去污劑處理與未處理的抗體制劑在血清中半衰期沒有區(qū)別(T=24小時)。免疫后48小時殺死小鼠,分析不同組織的放射性標記量。重獲放射劑量的百分數(shù)以每克所選組織重獲的CPM總數(shù)的百分數(shù)計。用SDS處理的抑制百分數(shù)根據(jù)下式計算(組織中未處理抗體重獲放射劑量百分數(shù))/(組織中用SDS處理抗體重獲放射劑量百分數(shù)) -1.00×100如表2所示,用SDS處理的抗體明顯地抑制抗體非特異性攝入到RES組織中。在肺和甲狀腺中脫碘的兩個部位沒觀察到抑制現(xiàn)象。這些組織中的CPM(每分鐘放射計數(shù))可能是游離的標記引起的,而不是結(jié)合在抗體上的。(表3表明處理的免疫毒素在活體中生物分布的結(jié)果),說明它是一個完整的abrin-9,2,27結(jié)合物,用9,2,27的美洲商陸(一種植物)抗病毒蛋白結(jié)合物所作試驗得到相似結(jié)果。這兩種情況下,在RES器官中免疫毒素制劑的攝入量比較未處理的免疫毒素制劑攝入量降低了。
被動治療前用SDS與結(jié)合物溫育(該結(jié)合物不能通過特異B-鏈受體與糖類結(jié)合)可以有效地降低完整的毒素結(jié)合物的非特異性攝取。簡言之,用SPDP將131I-標記的單克隆抗體9,2,27結(jié)合到125I-標記的完整abrin上。通過半乳糖/Sepharose(葡聚糖)上吸附除去完整的毒素結(jié)合物,該完整毒素結(jié)合物保留了通過糖類結(jié)合的B-鏈。將得到的完整毒素結(jié)合物與0.5%(W/V)SDS在25℃溫育30分鐘。將未經(jīng)處理和用SDS處理的完整毒素免疫結(jié)合物以50μg/動物的劑量給裸鼠靜脈注射。對照組與去污劑處理的完整毒素結(jié)合物的血清半衰期沒有區(qū)別(T=3.5小時)。免疫24小時后殺死小鼠,取出不同組織,測其結(jié)合上的放射標記,如表3所示,在活體給藥前,用SDS與完整毒素結(jié)合物溫育,將明顯降低其RES組織非特異性攝入。
表3活體中SDS對免疫毒素生物分布的影響抑制百分數(shù)%組織 (用SDS)脾 37肝 52肺 27腎 54肌肉 0
甲狀腺 -25例3完整毒素結(jié)合物在活體中毒性的降低。
如上述,通過SPDP將D3(豚鼠L10肝細胞癌的單克隆抗體)與完整的abrin結(jié)合。過半乳糖-葡聚糖柱后,將結(jié)合物在體外進行抗抗原性細胞和陰性細胞的試驗發(fā)現(xiàn)殺死抗原性細胞為陰性細胞的10000倍,(抗抗原性細胞的ID50=10-14M,而對陰性細胞的ID50=10-10M,)。D3的典型A-鏈結(jié)合物對抗原性(陽性)和陰性細胞的ID50分別為10-7和10-10M。用D3-完整毒素abrin結(jié)合物,以1μg和10μg/每只豚鼠的劑量,給體重350克的豚鼠注射。二種劑量均使動物在24小時內(nèi)死亡。用0.5%SDS處理以后,并清除游離的去污劑,結(jié)合物的給藥劑量為每次150μg,每天3次,間隔3天(七天內(nèi)累積給量為450μg)。觀察200天,全部豚鼠無明顯中毒表現(xiàn)。
假單胞桿菌外毒素A(PE)與單克隆抗體結(jié)合后,具有很高的效價[抗抗原(陽性)細胞的LD50為10-11到10-13m],并具有很好的選擇性(抗抗原陰性細胞的LD50為10-10到10-9m)。然而,在活體內(nèi),該結(jié)合物像其它完整毒素結(jié)合物一樣,具有明顯的肝臟致毒作用。這點可用各種肝細胞酶水平,如SGOT,SGPT,LDH的水平的檢測(見表中猴的資料)或死亡(小鼠)很容易的判定。對于小鼠,PE結(jié)合物的常規(guī)致死量為1μg/每只。假若先把結(jié)合物用SDS處理一下,給藥劑量可提高到50μg/每只小鼠,而無明顯的中毒(更高劑量的給藥沒有試驗)。對于猴,有相似的情況,給以未經(jīng)處理的結(jié)合物,在出現(xiàn)死亡或嚴重的癥狀之前,先有肝細胞各種酶水平的升高,給以用SDS處理過的結(jié)合物,則肝細胞酶水平將大大減低。更為重要的是如同體外試驗一樣,經(jīng)SDS處理以后,結(jié)合物的效價和選擇性實質(zhì)上不受影響。
因此,可總結(jié)如下SDS同樣可有效地減低完整毒素結(jié)合物的毒性。此完整毒素結(jié)合物由細菌外毒素,如假單胞桿菌外毒素A所制成。用Diptheria毒素也會得到同樣的結(jié)果。
表4給Cynomologous猴用假單胞桿菌外毒素免疫毒素結(jié)合物的解毒作用血中酶水平測定天數(shù)用量 監(jiān)測的肝酶 1 2 3 4 5 正常值2mg SGOT 35 62 56 41 ND 60(SDS處理的) SGPT 137 147 137 108 ND 60LDH ND 865 572 597 ND 350癥狀 沒有2mg SGOT 1297>5000 ND ND 死亡(未處理的) SGPT 750 2500 ND ND 死亡LDH 1725>6000 ND ND 死亡癥狀 惡心 腹瀉 不思飲食 第五天死亡1mg SGOT 58 386 1310 ND 76(未處理的) SGPT 36 525 1955 ND 500LDH 526 2090 4259 ND 715癥狀 惡心 腹瀉 不思飲食例4單克隆抗體制劑中內(nèi)毒素水平的降低。
為表5所示,將單克隆抗體與陰離子去污劑溫育降低了抗體制劑中內(nèi)毒素的污染。用QCL
屬溶胞產(chǎn)物試驗(whittake/MA生物產(chǎn)品)測定從蛋白A葡聚糖層析的組織培養(yǎng)上清液純化的單克隆抗體(有兩種蛋白)。用凝集試驗(Pyrotel Woods Hole.MA)得到同樣的結(jié)果,都表明含有內(nèi)毒素污染。然后將抗體制劑與0.1%SDS在37℃溫育30分鐘。通過在4℃冷卻2小時使過量SDS結(jié)晶出來,再以2000g離心10分鐘除去SDS結(jié)晶。用吖啶橙結(jié)合試驗測得每毫克抗體結(jié)合494微克SDS。用去污劑處理的抗體內(nèi)毒素水平降低95%以上。用從不含內(nèi)毒素的腹水提純的抗體制劑,將其用去污劑處理作為對照試驗。結(jié)果表明SDS處理不影響對內(nèi)毒素陽性對照的估計表5SDS對單克隆抗體9,2,27內(nèi)毒素水平的影響500μg處理的編號407033 處理前 處理后 百分數(shù)的降低500μg處理的編號411272 76 1.4 98.0240 11.0 95.4如上所述,本發(fā)明的實施例是為了說明本發(fā)明,不偏離本發(fā)明的構(gòu)思還可作很多修飾,因此,本發(fā)明不受實施例的限制,保護范圍根據(jù)權利要求
。
權利要求
1.增加免疫結(jié)合物制劑或未結(jié)合的免疫球蛋白溶解度的方法,包括將免疫結(jié)合物制劑或一種免疫球蛋白制劑與足夠量的兩性分子溫育以增加免疫結(jié)合物制劑或免疫球蛋白制劑的溶解度。
2.根據(jù)權利要求
1的方法,其中所述的兩性分子包括一種陰離子去污劑。
3.根據(jù)權利要求
2的方法,其中所述陰離子去污劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)
4.根據(jù)權利要求
2或3的方法,其中所述的去污劑存在的濃度為0.01%到1%(W/V)
5.根據(jù)權利要求
1到4任一項所述的方法,其中所述的免疫結(jié)合物制劑以約1毫克/毫升的濃度存在。
6.根據(jù)權利要求
1到5中任何一項所述的方法,其中所述的免疫結(jié)合物制劑或免疫球蛋白制劑溫育30-60分鐘。
7.根據(jù)權利要求
1到6中任何一項所述的方法,其中溫育的步驟是在25℃或37℃進行的。
8.根據(jù)權利要求
3的方法,溫育,然后通過結(jié)晶、凝膠過濾、或過清蛋白-葡聚糖柱,除去未與抗體結(jié)合的SDS。
9.根據(jù)權利要求
2的方法,其中所述免疫球蛋白制劑是一種亞族IgG3
10.降低抗體與受體非特異結(jié)合的方法,包括將單克隆抗體與足夠量的兩性分子溫育,從而降低抗體與受體的結(jié)合。
11.根據(jù)權利要求
10的方法,其中的兩性分子包括一種陰離子去污劑。
12.根據(jù)權利要求
10的方法,其中的受體選自下列一組FC受體,C3b受體,C3d受體,免疫復合物受體,糖類受體和糖蛋白受體。
13.降低完整毒素結(jié)合物毒性的方法,包括將毒素結(jié)合物與足夠量兩性分子溫育,從而降低完整毒素結(jié)合物的毒性。
14.根據(jù)權利要求
13的方法,其中所述的兩性分子包括一種陰離子去污劑。
15.降低生物制劑中內(nèi)毒素水平的方法,包括將生物制劑與足夠量的兩性分子溫育,從而降低制劑中內(nèi)毒素的水平。
16.根據(jù)權利要求
15的方法,其中所述的兩性分子包括一種陰離子去污劑。
17.根據(jù)權利要求
15的方法,其中所述的生物制劑是從BALB/C小鼠腹水中提純的一種單克隆抗體制劑或是從生長在大規(guī)模組織培養(yǎng)物中的單克隆抗體提純得到的。
專利摘要
本發(fā)明揭示一種增加抗體,放射性同位素標記的毒素或藥物免疫結(jié)合物溶解度;通過FC受體調(diào)節(jié)機制降低結(jié)合和或未結(jié)合的抗體非特異性地攝入到RES器官中的方法。該方法包括將反應成分與兩性分子如,一種陰離子去污劑保溫而達到目的。優(yōu)選的去污劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)。
文檔編號A61K39/395GK87100124SQ87100124
公開日1988年7月20日 申請日期1987年1月10日
發(fā)明者A·查理德·莫爾岡, 戈薩拉·帕瓦納薩瓦姆 申請人:尼奧爾克斯公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan