專利名稱：治療與呼吸失調(diào)和肺部炎癥相關(guān)的疾病和癥狀的藥劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)應(yīng)于有關(guān)某些類型的肺疾病或癥狀的基因的mRNA的反義寡核苷酸藥劑。本發(fā)明的藥劑在如哮喘等與肺炎，支氣管狹窄，通過肺部氣道的受阻空氣流，和通常的呼吸困難相關(guān)的肺疾病和癥狀的治療中是有效的。特別重要的是本發(fā)明的藥劑含有腺苷A1，A2b，和A3和緩激肽B2受體的反義寡核苷酸。
背景說明與各種疾病和癥狀相關(guān)的呼吸失調(diào)在一般的群體中是特別普遍的，在一些少數(shù)民族群體中更加如此，如美國(guó)黑人。在一些情況中，“這些失調(diào)”伴隨著炎癥，加重了肺的癥狀。例如，哮喘是工業(yè)化國(guó)家中最通常的疾病之一。在美國(guó)，它占所有健康護(hù)理費(fèi)用的1％。已經(jīng)報(bào)道在過去的十年中哮喘的流行和死亡率驚人地提高。并且推測(cè)哮喘在下十年中將是突出的肺職業(yè)病。哮喘的死亡率在工業(yè)化國(guó)家中提高可以歸因于在這種疾病的治療中對(duì)β-拮抗劑的依賴增加，而哮喘的潛在原因仍然了解很少。
腺苷可能是支氣管哮喘的重要的天然介導(dǎo)物。它在人哮喘中的潛在作用已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的支持，即與正常個(gè)體相反，哮喘個(gè)體對(duì)氣霧劑化的腺苷的反應(yīng)是明顯的支氣管狹窄。有人報(bào)道在實(shí)驗(yàn)的兔的人哮喘模型(“變應(yīng)性兔”)中經(jīng)給予塵埃螨產(chǎn)生了類似的反應(yīng)。利用變應(yīng)性兔的最近的工作已經(jīng)表明哮喘中支氣管狹窄和支氣管超反應(yīng)性至少可以部分通過刺激腺苷受體介導(dǎo)。
腺苷A1受體似乎是在幾乎每個(gè)哮喘病人的肺中過度表達(dá)，已經(jīng)表明對(duì)腺苷的敏感性可能是比本領(lǐng)域的目前的標(biāo)準(zhǔn)，醋甲膽堿測(cè)試更好的哮喘指示物。腺苷和它的受體在哮喘中起重要作用的另外的跡象從下列觀察中得到，在哮喘的肺中的支氣管灌洗液中腺苷的水平大大升高。這一觀察表明過度表達(dá)的腺苷A1受體可以用于連續(xù)刺激哮喘的肺，從而減輕哮喘的肺中的支氣管狹窄/炎癥。所以，過度表達(dá)的腺苷A1的受體可能是哮喘和其它支氣管狹窄和炎癥起作用的呼吸疾病的基礎(chǔ)介導(dǎo)物。
已經(jīng)有一些治療呼吸疾病和癥狀的藥劑，但是總的來說它們均具有局限性。茶堿，治療哮喘的重要藥物，是已知的腺苷受體拮抗劑，據(jù)報(bào)道它在哮喘的兔中能夠消除腺苷介導(dǎo)的支氣管狹窄。還報(bào)道了選擇性腺苷A1受體拮抗劑8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(DPCPX)能夠在變應(yīng)性兔中抑制腺苷介導(dǎo)的支氣管狹窄和支氣管超反應(yīng)性。目前可得的腺苷A1受體特異性拮抗劑的治療和預(yù)防應(yīng)用由于它們的毒性而受限制。例如，茶堿在治療哮喘中具有廣泛的用途，但伴有其狹窄劑量范圍導(dǎo)致的經(jīng)常的明顯的毒性。DPCPX由于毒性太大而不能臨床使用。盡管十年的廣泛研究，仍沒有獲得特異的腺苷受體拮抗劑用于臨床這一事實(shí)證實(shí)了這些藥劑的一般毒性。
其它腺苷受體和緩激肽B2受體是已知與呼吸和炎癥癥狀相關(guān)的。在這些中有A2a，A2b，和A3腺苷受體。腺苷A1，A2a，A2b，和A3受體是具有7-跨膜區(qū)段的細(xì)胞表面受體的G蛋白質(zhì)偶聯(lián)家族的成員。在A2a和A2b受體之間具有廣泛的同源性，變化主要出現(xiàn)在它們的羧基末端區(qū)。據(jù)信腺苷A2a受體是高親和受體，腺苷A2b是低親和受體。盡管腺苷A1受體據(jù)報(bào)道是抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的，但據(jù)報(bào)道A2a和A2b受體是刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性的。
在人疾病中，反義寡核苷酸用作藥劑的潛在用途已經(jīng)討論得相當(dāng)多。但是在人疾病的真正模型中，發(fā)現(xiàn)這些藥劑的實(shí)際和有效應(yīng)用是少和遙遠(yuǎn)的，特別是因?yàn)樗鼈儾坏貌淮髣┝拷o藥。這些分子在藥學(xué)用途中的另一個(gè)重要的討論是它們的給藥途徑。許多體內(nèi)應(yīng)用涉及反義寡核苷酸直接給藥于限制的腦部區(qū)域。但是，因?yàn)樗鼈兊那秩氲奶匦赃@樣的應(yīng)用的臨床用途有限。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸作為藥劑的系統(tǒng)給藥也具有明顯的問題，重要的是難于靶擊涉及疾病的組織。也即在循環(huán)系統(tǒng)中反義寡核苷酸的必要稀釋使它在靶組織中特別難于通過靜脈或口服給藥獲得治療劑量?？诜o藥反義寡核苷酸的生物可利用性非常低，小于約5％。
因此，仍然需要能有效地治療與炎癥和氣道阻塞有關(guān)的肺部疾病和癥狀的新的藥劑。對(duì)于長(zhǎng)期的預(yù)防和治療應(yīng)用特別重要的是足夠特異于和/或直接給藥它們的作用位點(diǎn)的藥劑，可以避免不希望的副作用，或副作用很低能長(zhǎng)期給藥。
本發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及適于減輕支氣管狹窄和/或肺部炎癥的藥劑，該藥劑包括一個(gè)寡核苷酸，其是一個(gè)或多個(gè)腺苷受體、緩激肽受體和肺中相關(guān)受體的反義寡核苷酸。與這些癥狀相關(guān)的腺苷受體和緩激肽受體是腺苷A1，A2a，A2b和A3受體和緩激肽B2受體。本發(fā)明藥劑可以安全地給藥用于長(zhǎng)期預(yù)防，控制和治療所有類型的與肺部炎癥，支氣管狹窄，氣道阻塞和呼吸失調(diào)有關(guān)的疾病和癥狀。本發(fā)明的藥劑也以含有載體，優(yōu)選地藥學(xué)可接受載體，和一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸的藥物組合物形式提供，所述寡核苷酸是與支氣管狹窄，呼吸問題如受阻呼吸，氣道阻塞，粘液堆集和/或肺部炎癥等相關(guān)的受體的反義寡核苷酸。本發(fā)明藥劑也以各種藥物配方形式提供，用于減輕支氣管狹窄和/或炎癥，以及治療與如哮喘等癥狀相關(guān)的疾病和癥狀，或以試劑盒形式提供，附帶它的給藥指導(dǎo)。
本發(fā)明藥劑也用于治療與所述的癥狀包括哮喘，成人呼吸窘迫癥狀(ARDS)，慢性阻塞性肺病(COPD)，肺動(dòng)脈高血壓，囊性纖維化，變應(yīng)性，肺氣腫等相關(guān)的疾病。本發(fā)明藥劑可以抗支氣管狹窄和/或抗炎癥和/或呼吸窘迫減輕有效量給藥用于預(yù)防，維持或治療應(yīng)用。通常指明它們可用于急性和慢性癥狀，因?yàn)樗鼈兪前踩突緹o副作用。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1示出了A1腺苷受體反義寡核苷酸和錯(cuò)配對(duì)照反義寡核苷酸對(duì)兔模型中的支氣管氣道的動(dòng)態(tài)貼合性的影響。兩個(gè)星號(hào)代表了斯氏t檢驗(yàn)中p＜0.01的顯著差異。
圖2示出了以存在于用A1腺苷受體反義寡核苷酸治療的氣道組織中的A1和A2腺苷受體數(shù)目表示的A1腺苷受體反義寡核苷酸的特異性。
優(yōu)選的實(shí)施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明是產(chǎn)生于發(fā)明人希望改善用于預(yù)防，控制及急性和慢性治療有關(guān)呼吸困難，如支氣管狹窄，氣道阻塞，粘液堆集，變應(yīng)性，炎癥應(yīng)答等疾病和癥狀的現(xiàn)有技術(shù)的愿望。對(duì)能夠選擇性地靶擊與觀察到的癥狀相關(guān)的特異受體并且同時(shí)給藥到作用位點(diǎn)的藥劑進(jìn)行了尋找。本發(fā)明人推測(cè)這兩個(gè)方案的結(jié)合將提供一類高度有效的藥物，它產(chǎn)生的其它目前可得的藥劑中可以看到的不需要的副作用是可忽略的。本發(fā)明人推測(cè)反義寡核苷酸(寡聚物)將滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。但是，如上所述，大多數(shù)這樣的反義寡聚物直接給藥到腦或全身，前者在人中應(yīng)用有限，后者需要大劑量而產(chǎn)生不希望的毒性和/或副作用。這些類別的藥物的用途受限制的情況大多數(shù)在急性的情況中，而它們長(zhǎng)期給藥是禁忌的。相反，本發(fā)明人推測(cè)肺是藥劑直接給藥的良好的靶，以這種方式，本發(fā)明人將防止藥物與其它組織和/或體液相互作用的極大的可能性，這種相互作用可能有理由預(yù)期導(dǎo)致各種不希望的影響。另外，本發(fā)明人注意到特異于與靶擊的癥狀和疾病相關(guān)的基因和/或信使RNA(mRNA)的序列的反義寡核苷酸的應(yīng)用。所以，他決定研究尋找具有特異于預(yù)定的靶的序列的寡核苷酸，這些靶如果與寡聚物雜交，將減少參與不希望的作用的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且局部地給藥反義寡聚物，從而能夠避免通過受體的體液擴(kuò)散。這些應(yīng)用代表了非侵入的和組織特異性的途徑，是過去對(duì)于反義寡核苷酸未報(bào)道的。
本文僅僅通過單鏈，5’到3’方向，從左至右表示了核苷酸序列。本文以IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的方法，或(對(duì)于氨基酸)采用三字母密碼，根據(jù)37CFR§1.822和已經(jīng)確定的使用規(guī)則表示核苷酸和氨基酸。參見例如，PatentIN應(yīng)用手冊(cè)，99-102(Nov.1990)；美國(guó)專利和商標(biāo)局，專利副局長(zhǎng)辦公室，華盛頓，DC20231；授予Hudson等人的美國(guó)專利號(hào)4,871,670，第3欄，20-43行，該公開物的相關(guān)部分和該專利所引用的所有其它專利的相關(guān)部分引入本文作為參考。
本發(fā)明的方法可以用于減少受試者的肺的支氣管狹窄和/或炎癥，特別是腺苷介導(dǎo)的支氣管狹窄和/或炎癥，這些癥狀產(chǎn)生于各種原因，包括但不限于哮喘，COPD，肺動(dòng)脈高血壓，變應(yīng)性，肺氣腫和其它。本發(fā)明人已經(jīng)證明腺苷A1，A2a，A2b和A3受體和緩激肽B2受體的mRNA的反義寡核苷酸分別對(duì)細(xì)胞中腺苷A1，A2a，A2b和A3和緩激肽B2受體分子的下調(diào)有效。當(dāng)與更傳統(tǒng)的支氣管狹窄和炎癥的治療比較，特別是腺苷介導(dǎo)和/或緩激肽介導(dǎo)的呼吸困難，支氣管狹窄和/或炎癥，本發(fā)明藥劑的一個(gè)新特征是通過設(shè)計(jì)是編碼需要的產(chǎn)物的mRNA的反義寡聚物而使它們能特異地靶擊需要的基因產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過吸入或進(jìn)入呼吸氣道，本發(fā)明的藥劑可直接給藥到呼吸道，優(yōu)選地直接給藥到肺。所以，本發(fā)明藥劑減少了例如受體蛋白質(zhì)本身的量，而不是僅僅如現(xiàn)有技術(shù)的藥劑那樣與它相互作用。以這樣的方式，僅僅減少需要的中間蛋白質(zhì)減少了不需要的癥狀，例如，支氣管狹窄，氣道阻礙，粘液堆集，明顯地減少呼吸能力和/或炎癥。本發(fā)明藥劑特異地靶擊而不是一般地作用這一事實(shí)減少了藥物與各種組織和受體一般化地相互作用產(chǎn)生的毒性。
如本文所用，術(shù)語“治療”與支氣管狹窄，降低的呼吸能力和/或炎癥的疾病或癥狀，如哮喘，是指將本發(fā)明藥劑給藥給個(gè)體，優(yōu)選地或通過呼吸或通過吸入直接給藥到肺，以減輕個(gè)體支氣管狹窄，降低的呼吸能力和/或炎癥的癥狀。術(shù)語“下調(diào)”指在誘導(dǎo)腺苷A1，A2a，A2b和/或A3和/或緩激肽B2受體的產(chǎn)生，分泌和/或可利用性中誘導(dǎo)下降，從而減少細(xì)胞內(nèi)水平的濃度。也包括了其它蛋白質(zhì)和/或受體通過吸入反義寡核苷酸的下調(diào)。
雖然本發(fā)明主要涉及治療人類個(gè)體，它也意在治療其它脊椎動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物個(gè)體，如野生和家養(yǎng)的動(dòng)物，農(nóng)場(chǎng)的和海產(chǎn)的動(dòng)物，包括馬，動(dòng)物園動(dòng)物，和寵物，例如，狗，和貓，和其它動(dòng)物。特別感興趣的是獸醫(yī)在治療大和小的動(dòng)物中的應(yīng)用。
術(shù)語“反義”通常指利用小的，合成的寡核苷酸，組裝成單鏈DNA的應(yīng)用，它們被設(shè)計(jì)成通過抑制相應(yīng)的靶信使RNA(mRNA)的功能而抑制特異的靶基因的表達(dá)，如Milligan等人所述，參見Milligan，J.F.等人，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，36(14)，1923-1937(1993)。本發(fā)明通常打算達(dá)到與支氣管狹窄，炎癥，降低的呼吸能力，和相關(guān)癥狀的基因如腺苷A1，A2a，A2b和A3受體和緩激肽B2受體的表達(dá)的抑制。本發(fā)明藥劑通過與存在于對(duì)應(yīng)靶基因的信使RNA(mRNA)中的編碼(有義)、調(diào)節(jié)和/或內(nèi)含子序列雜交而抑制基因表達(dá)。據(jù)信根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則經(jīng)氫鍵結(jié)合發(fā)生本發(fā)明藥劑與mRNA靶的片段的雜交或結(jié)合。雖然，對(duì)于本發(fā)明藥劑的作用的特異機(jī)制沒有要求保護(hù)，但目前認(rèn)為外源地給予反義寡核苷酸減少了可用于翻譯的靶mRNA的量，因此，降低了編碼蛋白質(zhì)的水平和/或引起細(xì)胞的生長(zhǎng)特性或形狀的變化。參見，Helene，C.和Toulme，J.，生物化學(xué)生物物理雜志1049，99-125(1990)；Cohen，J.S.D.編輯，寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)反義抑制劑；CRC出版Boca Raton，F(xiàn)L(1987)。
在本專利內(nèi)，“腺苷受體反義寡核苷酸”定義為一個(gè)短核苷酸序列，大多數(shù)是合成的，其(1)與mRNA的至少一部分，包括對(duì)應(yīng)于5’和3’末端的內(nèi)含子和外顯子邊界以及編碼和非編碼區(qū)之間的內(nèi)含子/外顯子接界互補(bǔ)，以及與編碼基因產(chǎn)物包括腺苷A1，A2a，A2b和A3受體和緩激肽B2受體的mRNA和/或基因的編碼和調(diào)節(jié)區(qū)的所有區(qū)段互補(bǔ)，并且(2)在雜交時(shí)，引起靶mRNA模板或模板功能的減少或喪失和/或減少靶mRNA編碼的蛋白質(zhì)的量。
對(duì)應(yīng)于靶基因，例如腺苷A1，A2a，A2b或A3或緩激肽B2受體基因的mRNA序列通常起源于表達(dá)靶蛋白質(zhì)的基因的DNA堿基序列，靶蛋白質(zhì)在待治療的疾病或癥狀中起有害的作用。本專利中舉例的所有基因組靶的序列均是公開的，技術(shù)是通?？傻玫?，并且廣泛用于確定任何靶基因的序列或它對(duì)應(yīng)的mRNA的序列以致該技術(shù)可以容易地用于其它靶。人A1腺苷受體例如是已知的，并且公開在授予Stiles等人的美國(guó)專利號(hào)5,320,962中。大鼠和人腺苷A3受體已經(jīng)被克隆，測(cè)序和表達(dá)。參見，Zhou等人，P.N.A.S.USA，897432(1992)；Jacobson等人，英國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?304582.1(1993)。腺苷A2b基因的序列也是已知的，參見Pierce，K.D.等人，生物化學(xué)，生物物理研究通訊187(1)86-93(1992)；還已知的是緩激肽B2基因的序列。參見Eggerickx，D.等人，生物化學(xué)生物物理研究通訊187(3)1306-1313(1992)。所以，可以根據(jù)本文提供的發(fā)明人教導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)設(shè)計(jì)和生產(chǎn)與對(duì)應(yīng)于腺苷A1，A2a，A2b和A3和緩激肽B2基因的mRNA雜交，并且下調(diào)A1，A2b，和/或A3受體的生成的反義寡核苷酸。
所以，本發(fā)明提供了具有與任何靶mRNA可選擇地結(jié)合或雜交的序列的反義寡核苷酸。優(yōu)選的是那些與編碼腺苷A1，A2b，和A3受體的mRNA的任何區(qū)段雜交，以致能夠防止它的翻譯的那些寡聚物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸具有選自SEQ ID NO7和其約8到約40個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選地約15到25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，和更優(yōu)選地約18到22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段的序列，這些核苷酸起自每個(gè)編碼靶基因序列的不同位點(diǎn)。下面提供了各個(gè)片段的例子，其中每個(gè)片段均給出了特定的片段號(hào)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的序列用括號(hào)括出了人腺苷A1受體的起始密碼。這樣的反義寡核苷酸可以具有下面本文所公開的序列5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(SEQ.ID NO7)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 1)(SEQ.ID NO11)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 2)(SEQ.ID NO12)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 3)(SEQ.ID NO13)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 4)(SEQ.ID NO14)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 5)(SEQ. IDNO15)5′-CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 6) (SEQ.ID NO16)5′-TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 7)(SEQ.ID NO17)5′-G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 8)(SEQ.ID NO18)5′-GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 9)(SEQ.ID NO19)5′-AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 10)(SEQ.ID NO20)5′-A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 11)(SEQ.ID NO21)5′-AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 12)(SEQ.ID NO22)5′-GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 13)(SEQ.ID NO23)5′-C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 14)(SEQ.ID NO24)5′-TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 15)(SEQ.ID NO25)5′-GA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 16)(SEQ.ID NO26)5′-A GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 17)(SEQ.ID NO27)5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 18)(SEQ. ID NO28)5′-AT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 19)(SEQ. ID NO29)5′-T GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 20)(SEQ.ID NO30)5′-GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 21)(SEQ.ID NO31)5′-GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 22)(SEQ.ID NO32)5′-A GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 23)(SEQ.ID NO33)5′-GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 24)(SEQ.ID NO34)5′-GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 25)(SEQ.ID NO35)5′-G CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 26)(SEQ.ID NO36)5′-CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 27)(SEQ.ID NO37)5′-GG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 28)(SEQ.ID NO38)5′-G CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 29)(SEQ.ID NO39)5′-CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 30)(SEQ.ID NO40)5′-AT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 31)(SEQ.ID NO41)5′-T GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 32)(SEQ.ID NO42)5′-GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 33)(SEQ.ID NO43)5′-GC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 34)(SEQ.ID NO44)5′-C GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 35)(SEQ.ID NO45)5′-GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 36)(SEQ.ID NO46)5′-GG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 37)(SEQ.ID NO47)5′-G CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 38)(SEQ.ID NO48)5′-CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 39)(SEQ.ID NO49)5′-AC AGG CTG GGC-3′(FRAG 40)(SEQ.ID NO50)5′-C AGG CTG GGC-3′(FRAG 41)(SEQ.ID NO51)5′-AGG CTG GGC-3′(FRAG 42)(SEQ.ID NO52)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 43)(SEQ.ID NO53)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 44)(SEQ.ID NO54)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 45)(SEQ.ID NO55)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 46)(SEQ.ID NO56)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 47)(SEQ.ID NO57)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 48)(SEQ.ID NO58)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 49)(SEQ.IDNO59)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 50)(SEQ.ID NO60)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 51)(SEQ.ID NO61)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 52)(SEQ.ID NO62)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 53)(SEQ.ID NO63)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 54)(SEQ.ID NO64)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 55)(SEQ.ID NO65)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 56)(SEQ.ID NO66)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 57)(SEQ.ID NO67)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 58)(SEQ.ID NO68)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 59)(SEQ.ID NO69)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 60)(SEQ.ID NO70)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 61)(SEQ.ID NO71)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 62)(SEQ. ID NO72)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 63)(SEQ.ID NO73)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 64)(SEQ.ID NO74)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 65)(SEQ.ID NO75)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 66)(SEQ.ID NO76)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 67)(SEQ.ID NO77)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 68)(SEQ.ID NO78)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 69)(SEQ.ID NO79)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 70)(SEQ.ID NO80)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 71)(SEQ.ID NO81)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 72)(SEQ.ID NO82)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 73)(SEQ.ID NO83)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 74)(SEQ.ID NO84)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 75)(SEQ.ID NO85)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 76)(SEQ.ID NO86)5′-GGC GGC CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 77)(SEQ.ID NO87)5′-GGC GGC CTG GAA AGC T-3′(FRAG 78)(SEQ.ID NO88)5′-GGC GGC CTG GAA AGC-3′(FRAG 79)(SEQ.ID NO89)5′-GGC GGC CTG GAA AG-3′(FRAG 80)(SEQ.ID NO90)5′-GGC GGC CTG GAA A-3′(FRAG 81)(SEQ.ID NO91)5′-GGC GGC CTG GAA-3′(FRAG 82)(SEQ.ID NO92)5′-GGC GGC CTG GA-3′(FRAG 83)(SEQ.ID NO93)5′-GGC GGC CTG G-3′(FRAG 84)(SEQ.ID NO94)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 85)(SEQ.ID NO95)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 86)(SEQ.ID NO96)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 87)(SEQ.ID NO97)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 88)(SEQ.ID NO98)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 89)(SEQ.ID NO99)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 90)(SEQ.IDNO100)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 91)(SEQ.ID NO101)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 92)(SEQ.ID NO102)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 93)(SEQ.ID NO103)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 94)(SEQ.ID NO104)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 95)(SEQ.ID NO105)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 96)(SEQ.ID NO106)5′-GC GGC CIG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 97)(SEQ.ID NO107)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 98)(SEQ.ID NO108)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 99)(SEQ.ID NO109)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 100)(SEQ.ID NO110)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 101)(SEQ.ID NO111)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 102)(SEQ.ID NO112)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 103)(SEQ.ID NO113)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 104)(SEQ.ID NO114)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 105)(SEQ.ID NO115)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 106)(SEQ.ID NO116)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 107)(SEQ.ID NO117)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 108)(SEQ.ID NO118)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 109)(SEQ.ID NO119)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 110)(SEQ.ID NO120)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 111)(SEQ.ID NO121)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 112)(SEQ.ID NO122)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 113)(SEQ.ID NO123)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 114)(SEQ.ID NO124)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 115)(SEQ.ID NO125)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 116)(SEQ.ID NO126)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 117)(SEQ.ID NO127)5′-GC GGC CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 118)(SEQ.ID NO128)5′-GC GGC CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 119)(SEQ.ID NO129)5′-GC GGC CTG GAA AGC T-3′(FRAG 120)(SEQ.ID NO130)5′-GC GGC CTG GAA AGC-3′(FRAG 121)(SEQ.ID NO131)5′-GC GGC CTG GAA AG-3′(FRAG 122)(SEQ.ID NO132)5′-GC GGC CTG GAA A-3′(FRAG 123)(SEQ.ID NO133)5′-GC GGC CTG GAA-3′(FRAG 124)(SEQ.ID NO134)5′-GC GGC CTG GA-3′(FRAG 125)(SEQ.ID NO135)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′ (FRAG 126)(SEQ.ID NO136)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 127)(SEQ.ID NO137)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 128)(SEQ.ID NO138)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 129)(SEQ.ID NO139)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 130)(SEQ.ID NO140)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 131)(SEQ.ID NO141)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 132)(SEQ.ID NO142)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 133)(SEQ.ID NO143)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 134)(SEQ.ID NO144)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 135)(SEQ.ID NO145)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 136)(SEQ.ID NO146)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 137)(SEQ.ID NO147)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 138)(SEQ.ID NO148)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 139)(SEQ.ID NO149)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 140)(SEQ.ID NO150)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 141)(SEQ.ID NO151)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 142)(SEQ.ID NO152)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRA 143)(SEQ.ID NO153)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 144)(SEQ.ID NO154)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 145)(SEQ.ID NO155)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 146)(SEQ.ID NO156)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 147)(SEQ.ID NO157)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 148)(SEQ.ID NO158)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 148)(SEQ.ID NO159)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 150)(SEQ.ID NO160)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 151)(SEQ.ID NO161)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 152)(SEQ.ID NO162)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 153)(SEQ.ID NO163)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 154)(SEQ.ID NO164)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 155)(SEQ.ID NO165)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 156)(SEQ.ID NO166)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 157)(SEQ.ID NO167)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 158)(SEQ.ID NO168)5′-C GGC CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 159)(SEQ.ID NO169)5′-C GGC CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 160)(SEQ.ID NO170)5′-C GGC CTG GAA AGC T-3′(FRAG 161)(SEQ.ID NO171)5′-C GGC CTG GAA AGC-3′(FRAG 162)(SEQ.ID NO172)5′-C GGC CTG GAA AG-3′(FRAG 163)(SEQ.ID NO173)5′-C GGC CTG GAA A-3′(FRAG 164)(SEQ.ID NO174)5′-C GGC CTG GAA-3′(FRAG 165)(SEQ.ID NO175)5′- GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 166)(SEQ.ID NO176)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 167)(SEQ.ID NO177)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 168)(SEQ.ID NO178)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 169)(SEQ.ID NO179)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 170)(SEQ.ID NO180)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 171)(SEQ. ID NO181)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 172)(SEQ.ID NO182)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 173)(SEQ.ID NO183)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 174)(SEQ.ID NO184)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 175)(SEQ.ID NO185)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 176)(SEQ.ID NO186)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 177)(SEQ.ID NO187)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 178)(SEQ.ID NO188)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 179)(SEQ.ID NO189)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 180)(SEQ.ID NO190)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 181)(SEQ.ID NO191)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 182)(SEQ.ID NO192)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 183)(SEQ.ID NO193)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 184)(SEQ.ID NO194)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 185)(SEQ.ID NO195)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 186)(SEQ.ID NO196)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 187)(SEQ.ID NO197)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 188)(SEQ.ID NO198)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 189)(SEQ.ID NO199)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 190)(SEQ.ID NO200)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 191)(SEQ.ID NO201)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 192)(SEQ.ID NO202)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 193)(SEQ.ID NO203)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 194)(SEQ.ID NO204)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 195)(SEQ.ID NO205)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 196)(SEQ.ID NO206)5′-GGC CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 197)(SEQ.ID NO207)5′-GGC CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 198)(SEQ.ID NO208)5′-GGC CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 199)(SEQ.ID NO209)5′-GGC CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 200 (SEQ.ID NO210)5′-GGC CTG GAA AGC T-3′(FRAG 201)(SEQ.ID NO211)5′-GGC CTG GAA AGC-3′(FRAG 202)(SEQ.ID NO212)5′-GGC CTG GAA AG-3′(FRAG 203)(SEQ.ID NO213)5′-GGC CTG GAA A-3′(FRAG 204)(SEQ.ID NO214)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 205)(SEQ.ID NO215)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 206)(SEQ.ID NO216)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 207)(SEQ.ID NO217)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 208)(SEQ.IDNO218)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 209)(SEQ.ID NO219)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 210)(SEQ.ID NO220)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 211)(SEQ.ID NO221)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 212)(SEQ.ID NO222)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 213)(SEQ.ID NO223)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 214)(SEQ.ID NO224)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 215)(SEQ.ID NO225)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 216)(SEQ.ID NO226)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 217)(SEQ.ID NO227)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 218)(SEQ.ID NO228)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 219)(SEQ.ID NO229)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 220)(SEQ.ID NO230)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 221)(SEQ.ID NO231)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 222)(SEQ.ID NO232)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 223)(SEQ.ID NO233)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 224)(SEQ.ID NO234)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 225)(SEQ.ID NO235)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 226)(SEQ.ID NO236)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 227)(SEQ.ID NO237)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 228)(SEQ.ID NO238)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 229)(SEQ.ID NO239)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 230)(SEQ.ID NO240)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 231)(SEQ.ID NO241)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 232)(SEQ.ID NO242)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 233)(SEQ.ID NO243)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 234)(SEQ.ID NO244)5′-GC CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 235)(SEQ.ID NO245)5′-GC CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 236)(SEQ.ID NO246)5′-GC CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 237)(SEQ.ID NO247)5′-GC CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 238)(SEQ.ID NO248)5′-GC CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 239)(SEQ.ID NO249)5′-GC CTG GAA AGC T-3′(FRAG 240)(SEQ.ID NO250)5′-GC CTG GAA AGC-3′(FRAG 241)(SEQ.ID NO251)5′-GC CTG GAA AG-3′(FRAG 242)(SEQ.ID NO252)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GG A GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 243)(SEQ.ID NO253)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 244)(SEQ.ID NO254)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 245) (SEQ.IDNO255)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 246)(SEQ.ID NO256)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 247)(SEQ.ID NO257)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 248)(SEQ.ID NO258)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 249)(SEQ.ID NO259)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 250)(SEQ.ID NO260)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 251)(SEQ.ID NO261)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FR AG 252)(SEQ.ID NO262)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 253)(SEQ.ID NO263)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 254)(SEQ.ID NO264)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 255)(SEQ.ID NO265)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 256)(SEQ.ID NO266)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 257)(SEQ.ID NO267)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 258)(SEQ.ID NO268)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 259)(SEQ.ID NO269)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 260)(SEQ.ID NO270)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 261)(SEQ.ID NO271)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 262)(SEQ.ID NO272)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 263)(SEQ.ID NO273)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 264)(SEQ.ID NO274)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 265)(SEQ.ID NO275)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 266)(SEQ.ID NO276)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 267)(SEQ.ID NO277)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 268)(SEQ.ID NO278)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 269)(SEQ.ID NO279)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 270)(SEQ.ID NO280)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 271)(SEQ.ID NO281)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 272)(SEQ.ID NO282)5′-C CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 273)(SEQ.ID NO283)5′-C CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 274)(SEQ.ID NO284)5′-C CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 275)(SEQ.ID NO285)5′-C CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 276)(SEQ.ID NO286)5′-C CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 277)(SEQ.ID NO287)5′-C CTG GAA AGC T-3′(FRAG 278)(SEQ.ID NO288)5′-C CTG GAA AGC-3′(FRAG 279)(SEQ.ID NO289)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 280)(SEQ.IDNO290)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 281)(SEQ.IDNO291)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 282)(SEQ.ID NO292)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 283)(SEQ.ID NO293)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 284)(SEQ.ID NO294)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 285)(SEQ.ID NO295)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 286)(SEQ.ID NO296)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 287)(SEQ.ID NO297)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 288)(SEQ.ID NO298)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 289)(SEQ.ID NO299)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 290)(SEQ.ID NO300)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 291)(SEQ.ID NO301)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 292)(SEQ.ID NO302)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 293)(SEQ.ID NO303)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 294)(SEQ.ID NO304)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 295)(SEQ.ID NO305)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 296)(SEQ.ID NO306)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 297)(SEQ.ID NO307)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 298)(SEQ.ID NO308)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 299)(SEQ.ID NO309)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 300)(SEQ.ID NO310)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 301)(SEQ.ID NO311)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 302)(SEQ.ID NO312)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 303)(SEQ.ID NO313)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 304)(SEQ.ID NO314)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 305)(SEQ.ID NO315)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 306)(SEQ.ID NO316)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 307)(SEQ.ID NO317)5′- CTG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 308)(SEQ.ID NO318)5′- CTG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 309)(SEQ.ID NO319)5′- CTG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 310)(SEQ.ID NO320)5′- CTG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 311)(SEQ.ID NO321)5′- CTG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 312)(SEQ.ID NO322)5′- CTG GAA AGC TGA-3′(FRAG 313)(SEQ.ID NO323)5′- CTG GAA AGC TG-3′(FRAG 314)(SEQ.ID NO324)5′- CTG GAA AGC T-3′(FRAG 315)(SEQ.ID NO325)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 316)(SEQ.IDNO326)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 317)(SEQ.ID NO327)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 318)(SEQ.ID NO328)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 319)(SEQ.ID NO329)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 320)(SEQ.ID NO330)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 321)(SEQ.ID NO331)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 322)(SEQ.ID NO332)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 323)(SEQ.ID NO333)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 324)(SEQ.ID NO334)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 325)(SEQ.ID NO335)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 326)(SEQ.ID NO336)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 327)(SEQ.ID NO337)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 328)(SEQ.ID NO338)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 329)(SEQ.ID NO339)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 330)(SEQ.ID NO340)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 331)(SEQ.ID NO341)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 332)(SEQ.ID NO342)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 333)(SEQ.ID NO343)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 334)(SEQ.ID NO344)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 335)(SEQ.ID NO345)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 336)(SEQ.ID NO346)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 337)(SEQ.ID NO347)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 338)(SEQ.ID NO348)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 339)(SEQ.ID NO349)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 340)(SEQ.ID NO350)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 341)(SEQ.ID NO351)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 342)(SEQ.ID NO352)5′- TG GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 343)(SEQ.ID NO353)5′- TG GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 344)(SEQ.ID NO354)5′- TG GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 345)(SEQ.ID NO355)5′- TG GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 346)(SEQ.ID NO356)5′- TG GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 347)(SEQ.ID NO357)5′- TG GAA AGC TGA G-3′(FRAG 348)(SEQ.ID NO358)5′- TG GAA AGC TGA-3′(FRAG 349)(SEQ.ID NO359)5′- TG GAA AGC TG-3′(FRAG 350)(SEQ.ID NO360)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 351)(SEQ.ID NO361)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 352)(SEQ.ID NO362)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 353)(SEQ.ID NO363)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 354)(SEQ.ID NO364)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 355)(SEQ.ID NO365)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 356)(SEQ.ID NO366)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 357)(SEQ.ID NO367)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 358)(SEQ.ID NO368)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 359)(SEQ.ID NO369)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 360)(SEQ.ID NO370)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 361)(SEQ.ID NO371)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 362)(SEQ.ID NO372)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 363)(SEQ.ID NO373)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 364)(SEQ.ID NO374)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 365)(SEQ.ID NO375)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 366)(SEQ.ID NO376)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 367)(SEQ.ID NO377)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 368)(SEQ.ID NO378)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 369)(SEQ.ID NO379)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 370)(SEQ.ID NO380)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 371)(SEQ.ID NO381)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 372)(SEQ.ID NO382)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 373)(SEQ.ID NO383)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 374)(SEQ.ID NO384)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 375)(SEQ.ID NO385)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 376)(SEQ.ID NO386)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 377)(SEQ.ID NO387)5′- G GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 378)(SEQ.ID NO388)5′- G GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 379)(SEQ.ID NO389)5′- G GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 380)(SEQ.ID NO390)5′- G GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 381)(SEQ.ID NO391)5′- G GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 382)(SEQ.ID NO392)5′- G GAA AGC TGA G-3′(FRAG 383)(SEQ.ID NO393)5′- G GAA AGC TGA-3′(FRAG 384)(SEQ.ID NO394)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 385)(SEQ.IDNO395)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 386)(SEQ.ID NO396)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 387)(SEQ.ID NO397)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 388)(SEQ.ID NO398)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 389)(SEQ.ID NO399)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 390)(SEQ.ID NO400)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 391)(SEQ.ID NO401)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 392)(SEQ.ID NO402)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 393)(SEQ.ID NO403)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 394)(SEQ.ID NO404)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 395)(SEQ.ID NO405)5′- GAA AGC TGA GAT GGA ~ CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 396)(SEQ.ID NO406)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 397)(SEQ.ID NO407)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 398)(SEQ.ID NO408)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 399)(SEQ.ID NO409)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 400)(SEQ.ID NO410)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 401)(SEQ.ID NO411)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 402)(SEQ.ID NO412)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 403)(SEQ.ID NO413)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 404)(SEQ.ID NO 414)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 405)(SEQ.ID NO415)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 406)(SEQ.ID NO416)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 407)(SEQ.ID NO417)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 408)(SEQ.ID NO418)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 409)(SEQ.ID NO419)5′- GAA AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 410)(SEQ.ID NO420)5′- GAA AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 411)(SEQ.ID NO421)5′- GAA AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 412)(SEQ.ID NO422)5′- GAA AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 413)(SEQ.ID NO423)5′- GAA AGC TGA GAT G -3′(FRAG 414)(SEQ.ID NO424)5′- GAA AGC TGA GAT -3′(FRAG 415)(SEQ.ID NO425)5′- GAA AGC TGA GA-3′(FRAG 416)(SEQ.ID NO426)5′- GAA AGC TGA G-3′(FRAG 417)(SEQ.ID NO427)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 418)(SEQ.ID NO428)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 419) (SEQ.ID NO429)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 420)(SEQ.ID NO430)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 421)(SEQ.ID NO431)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 422)(SEQ.ID NO432)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 423)(SEQ.ID NO433)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 424)(SEQ.ID NO434)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 425)(SEQ.ID NO435)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 426)(SEQ.ID NO436)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 427)(SEQ.ID NO437)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 428)(SEQ.ID NO438)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 429)(SEQ.ID NO439)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 430)(SEQ.ID NO440)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 431)(SEQ.ID NO441)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 432)(SEQ.ID NO442)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 433)(SEQ.ID NO443)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 434)(SEQ.ID NO444)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 435)(SEQ.ID NO445)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 436)(SEQ.ID NO446)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 437)(SEQ.ID NO447)5′- AA AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 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A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 455)(SEQ.ID NO465)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 456)(SEQ.II NO466)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 457)(SEQ.ID NO467)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 458)(SEQ.ID NO468)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 459)(SEQ.ID NO469)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 460)(SEQ.ID NO470)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 461)(SEQ.ID NO471)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 462)(SEQ.ID NO472)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 463)(SEQ.ID NO473)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 464)(SEQ.ID NO474)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 465)(SEQ.ID NO475)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 466)(SEQ.ID NO476)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 467)(SEQ.ID NO477)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 468)(SEQ.ID NO478)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 469)(SEQ.ID NO479)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 470)(SEQ.ID NO480)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 471)(SEQ.ID NO481)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 472)(SEQ.ID NO482)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 473)(SEQ.ID NO483)5′- A AGC TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 474)(SEQ.ID NO484)5′- A AGC TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 475)(SEQ.ID NO485)5′- A AGC TGA GAT GGA G -3′(FRAG 476)(SEQ.ID NO486)5′- A AGC TGA GAT GGA -3′(FRAG 477)(SEQ.ID NO487)5′- A AGC TGA GAT GG -3′(FRAG 478)(SEQ.ID NO488)5′- A AGC TGA GAT G -3′(FRAG 479)(SEQ.ID NO489)5′- A AGC TGA GAT -3′(FRAG 480)(SEQ.ID NO490)5′- AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 481)(SEQ.ID NO491)5′- AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 482)(SEQ.ID NO492)5′- AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 483)(SEQ.ID NO493)5′- AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 484)(SEQ.ID NO494)5′- AGC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 485)(SEQ.ID 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GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 517)(SEQ.ID NO527)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 518)(SEQ.ID NO528)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 519)(SEQ.ID NO529)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 520)(SEQ.ID NO530)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 521)(SEQ.ID NO531)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 522)(SEQ.ID NO532)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 523)(SEQ.ID NO533)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 524)(SEQ.ID NO534)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 525)(SEQ.ID NO535)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 526)(SEQ.ID NO536)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 527)(SEQ.ID NO537)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 528)(SEQ.ID NO538)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 529)(SEQ.ID NO539)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 530)(SEQ.ID NO540)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 531)(SEQ.ID NO541)5′- GC TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 532)(SEQ.ID 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A-3′(FRAG 548)(SEQ.ID NO558)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 549)(SEQ.ID NO559)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 550)(SEQ.ID NO560)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 551)(SEQ.ID NO561)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 552)(SEQ.ID NO562)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 553)(SEQ.ID NO563)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 554)(SEQ.ID NO564)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 555)(SEQ.ID NO565)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 556)(SEQ.ID NO566)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 557)(SEQ.ID NO567)5′- C TGA GAT G-GA GGG CGG CAT -3′(FRAG 558)(SEQ.ID NO568)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 559)(SEQ.ID NO569)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 560)(SEQ.ID NO570)5′- C TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 561)(SEQ.ID NO571)5′- C TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 562)(SEQ.ID NO572)5′- C TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 563)(SEQ.ID NO573)5′- C TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 564)(SEQ.ID NO574)5′- C TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 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-3′(FRAG 580)(SEQ.ID NO590)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 581)(SEQ.ID NO591)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 582)(SEQ.ID NO592)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 583)(SEQ.ID NO593)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 584)(SEQ.ID NO594)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT G -3′(FRAG 585)(SEQ.ID NO595)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CAT -3′(FRAG 586)(SEQ.ID NO596)5′- TGA GAT GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 587)(SEQ.ID NO597)5′- TGA GAT GGA GGG CGG C-3′(FRAG 588)(SEQ.ID NO598)5′- TGA GAT GGA GGG CGG -3′(FRAG 589)(SEQ.ID NO599)5′- TGA GAT GGA GGG CG -3′(FRAG 590)(SEQ.ID NO600)5′- TGA GAT GGA GGG C -3′(FRAG 591)(SEQ.ID NO601)5′- TGA GAT GGA GGG -3′(FRAG 592)(SEQ.ID NO602)5′- TGA GAT GGA GG -3′(FRAG 593)(SEQ.ID NO603)5′- TGA GAT GGA G -3′(FRAG 594)(SEQ.ID NO604)5′- GA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 595)(SEQ.ID NO605)5′- GA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 596)(SEQ.ID NO606)5′- GA GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 597)(SEQ.ID 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-3′(FRAG 733)(SEQ.ID NO743)5′- GGA GGG CGG CA-3′(FRAG 734)(SEQ.ID NO744)5′- GGA GGG CGG C-3′(FRAG 735)(SEQ.ID NO745)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 736)(SEQ.ID NO746)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 737)(SEQ.ID NO747)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 738)(SEQ.ID NO748)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 739)(SEQ.ID NO749)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 740)(SEQ.ID NO750)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 741)(SEQ.ID NO751)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 742)(SEQ.ID NO752)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 743)(SEQ.ID NO753)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 744)(SEQ.ID NO754)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 745)(SEQ.ID NO755)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 746)(SEQ.ID NO756)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 747)(SEQ.ID NO757)5′- GA GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 748)(SEQ.ID NO758)5′- GA GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 749)(SEQ.ID NO759)5′- GA GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 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GGG -3′(FRAG 768)(SEQ.ID NO778)5′-A GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 769)(SEQ.ID NO779)5′-A GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 770)(SEQ.ID NO780)5′-A GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 771)(SEQ.ID NO781)5′-A GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 772)(SEQ.ID NO782)5′-A GGG CGG CAT G -3′(FRAG 773)(SEQ.ID NO783)5′-A GGG CGG CAT -3′(FRAG 774)(SEQ.ID NO784)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 775)(SEQ.ID NO785)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 776)(SEQ.ID NO786)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 777)(SEQ.ID NO787)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 778)(SEQ.ID NO788)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 779)(SEQ.ID NO789)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 780)(SEQ.ID NO790)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 781)(SEQ.ID NO791)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 782)(SEQ.ID NO792)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 783)(SEQ.ID NO793)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 784)(SEQ.ID NO794)5′- GGG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 785)(SEQ.ID NO795)5′- GGG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 786)(SEQ.ID NO796)5′- GGG CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 787)(SEQ.ID NO797)5′- GGG CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 788)(SEQ.ID NO798)5′- GGG CGG CAT GGC G-3′(FRAG 789)(SEQ.ID NO799)5′- GGG CGG CAT GGC -3′(FRAG 790)(SEQ.ID NO800)5′- GGG CGG CAT GG -3′(FRAG 791)(SEQ.ID NO801)5′- GGG CGG CAT G -3′(FRAG 792)(SEQ.ID NO802)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AG G CTG GGC-3′(FRAG 793)(SEQ.ID NO803)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 794)(SEQ.ID NO804)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 795)(SEQ.ID NO805)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 796)(SEQ.ID NO806)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 797)(SEQ.ID NO807)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 798)(SEQ.ID NO808)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 799)(SEQ.ID NO809)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 800)(SEQ.ID NO810)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 801)(SEQ.ID NO811)5′- GG CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 802)(SEQ.ID NO812)5′- GG CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 803)(SEQ.ID NO813)5′- GG CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 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CAT GGC GG-3′(FRAG 823)(SEQ.ID NO833)5′- G CGG CAT GGC G-3′(FRAG 824)(SEQ.ID NO834)5′- G CGG CAT GGC -3′(FRAG 825)(SEQ.ID NO835)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 826)(SEQ.ID NO836)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 827)(SEQ.ID NO837)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 828)(SEQ.ID NO838)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 829)(SEQ.ID NO839)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 830)(SEQ.ID NO840)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 831)(SEQ.ID NO841)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 832)(SEQ.ID NO842)5′- CGG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 833)(SEQ.ID NO843)5′- CGG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 834)(SEQ.ID NO844)5′- CGG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 835)(SEQ.ID NO845)5′- CGG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 836)(SEQ.ID NO846)5′- CGG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 837)(SEQ.ID NO847)5′- CGG CAT GGC GGG -3′(FRAG 838)(SEQ.ID NO848)5′- CGG CAT GGC GG-3′(FRAG 839)(SEQ.ID NO849)5′- CGG CAT GGC G-3′(FRAG 840)(SEQ.ID NO850)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG C TG GGC-3′(FRAG 841)(SEQ.ID NO851)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 842)(SEQ.ID NO852)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 843)(SEQ.ID NO853)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 844)(SEQ.ID NO854)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 845)(SEQ.ID NO855)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 846)(SEQ.ID NO856)5′- GG CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 847)(SEQ.ID NO857)5′- GG CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 848)(SEQ.ID NO858)5′- GG CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 849)(SEQ.ID NO859)5′- GG CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 850)(SEQ.ID NO860)5′- GG CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 851)(SEQ.ID NO861)5′- GG CAT GGC GGG C-3′(FRAG 852)(SEQ.ID NO862)5′- GG CAT GGC GGG -3′(FRAG 853)(SEQ.ID NO863)5′- GG CAT GGC GG-3′(FRAG 854)(SEQ.ID NO864)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 855)(SEQ.ID NO865)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 856)(SEQ.ID NO866)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 857)(SEQ.ID NO867)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 858)(SEQ.ID NO868)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 859)(SEQ.ID NO869)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 860)(SEQ.ID NO870)5′- G CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 861)(SEQ.ID NO871)5′- G CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 862)(SEQ.ID NO872)5′- G CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 863)(SEQ.ID NO873)5′- G CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 864)(SEQ.ID NO874)5′- G CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 865)(SEQ.ID NO875)5′- G CAT GGC GGG C-3′(FRAG 866)(SEQ.ID NO876)5′- G CAT GGC GGG -3′(FRAG 867)(SEQ.ID NO877)5′- CAT GGC GGG CAC AGG CIG GGC-3′(FRAG 868)(SEQ.ID NO878)5′- CAT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 869)(SEQ.ID NO879)5′- CAT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 870)(SEQ.ID NO880)5′- CAT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 871)(SEQ.ID NO881)5′- CAT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 872)(SEQ.ID NO882)5′- CAT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 873)(SEQ.ID NO883)5′- CAT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 874)(SEQ. ID NO884)5′- CAT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 875)(SEQ.ID NO885)5′- CAT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 876)(SEQ.ID NO886)5′- CAT GGC GGG CAC-3′(FRAG 877)(SEQ.ID NO887)5′- CAT GGC GGG CA-3′(FRAG 878)(SEQ.ID NO888)5′- CAT GGC GGG C-3′(FRAG 879)(SEQ.ID NO889)5′- AT GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 880)(SEQ.ID NO890)5′- AT GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 881)(SEQ.ID NO891)5′- AT GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 882)(SEQ.ID NO892)5′- AT GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 883)(SEQ.ID NO893)5′- AT GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 884)(SEQ.ID NO894)5′- AT GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 885)(SEQ.ID NO895)5′- AT GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 886)(SEQ.ID NO896)5′- AT GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 887)(SEQ.ID NO897)5′- AT GGC GGG CAC A-3′(FRAG 888)(SEQ.ID NO898)5′- AT GGC GGG CAC-3′(FRAG 889)(SEQ.ID NO899)5′- AT GGC GGG CA-3′(FRAG 890)(SEQ.ID NO900)5′- T GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 891)(SEQ.ID NO901)5′- T GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 892)(SEQ.ID NO902)5′- T GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 893)(SEQ.ID NO903)5′- T GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 894)(SEQ.ID NO904)5′- T GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 895)(SEQ.ID NO905)5′- T GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 896)(SEQ.ID NO906)5′- T GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 897)(SEQ.ID NO907)5′- T GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 898)(SEQ.ID NO908)5′- T GGC GGG CAC A-3′(FRAG 899)(SEQ.ID NO909)5′- T GGC GGG CAC-3′(FRAG 900)(SEQ.ID NO910)5′-GGC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 901)(SEQ.ID NO911)5′-GGC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 902)(SEQ.ID NO912)5′-GGC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 903)(SEQ.ID NO913)5′-GGC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 904)(SEQ.ID NO914)5′-GGC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 905)(SEQ.ID NO915)5′-GGC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 906)(SEQ.ID NO916)5′- GGC GGG CAC AGG -3′(FRAG 907)(SEQ.ID NO917)5′- GGC GGG CAC AG-3′(FRAG 908)(SEQ.ID NO918)5′- GGC GGG CAC A-3′(FRAG 909)(SEQ.ID NO919)5′- GC GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 910)(SEQ.ID NO920)5′- GC GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 911)(SEQ.ID NO921)5′- GC GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 912)(SEQ.ID NO922)5′- GC GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 913)(SEQ.ID NO923)5′- GC GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 914)(SEQ.ID NO924)5′- GC GGG CAC AGG C-3′(FRAG 915)(SEQ.ID NO925)5′- GC GGG CAC AGG -3′(FRAG 916)(SEQ.ID NO926)5′- GC GGG CAC AG-3′(FRAG 917) (SEQ.ID NO927)5′- C GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 918)(SEQ.ID NO928)5′- C GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 919)(SEQ.ID NO929)5′- C GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 920)(SEQ.ID NO930)5′- C GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 921)(SEQ.ID NO931)5′- C GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 922)(SEQ.ID NO932)5′- C GGG CAC AGG C-3′(FRAG 923)(SEQ.ID NO933)5′- C GGG CAC AGG -3′(FRAG 924)(SEQ.ID NO934)5′- GGG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 925)(SEQ.ID NO935)5′- GGG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 926)(SEQ.ID NO936)5′- GGG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 927)(SEQ.ID NO937)5′- GGG CAC AGG CTG -3′(FRAG 928)(SEQ.ID NO938)5′- GGG CAC AGG CT-3′(FRAG 929)(SEQ.ID NO939)5′- GGG CAC AGG C-3′(FRAG 930)(SEQ.ID NO940)5′- GG CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 931)(SEQ.ID NO941)5′- GG CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 932)(SEQ.ID NO942)5′- GG CAC AGG CTG G-3′(FRAG 933)(SEQ.ID NO943)5′- GG CAC AGG CTG -3′(FRAG 934)(SEQ.ID NO944)5′- GG CAC AGG CT-3′(FRAG 935)(SEQ.ID NO945)5′- G CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 936)(SEQ.ID NO946)5′- G CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 937)(SEQ.ID NO947)5′- G CAC AGG CTG G-3′(FRAG 938)(SEQ.ID NO948)5′- G CAC AGG CTG -3′(FRAG 939)(SEQ.ID NO949)5′-CAC AGG CTG GGC-3′(FRAG 940)(SEQ.ID NO950)5′-CAC AGG CTG GG-3′(FRAG 941)(SEQ.ID NO951)5′-CAC AGG CTG G-3′(FRAG 942)(SEQ.ID NO952)5′-AC AGG CTG GGC-3′(FRAG 943)(SEQ.ID NO953)5′-AC AGG CTG GG-3′(FRAG 944)(SEQ.ID NO954)5′-C AGG CTG GGC-3′(FRAG 945)(SEQ.ID NO955)
在前述序列舉例的本發(fā)明的反義寡核苷酸中，可利用適當(dāng)?shù)摹伴g隔”或通用堿基(例如，1[β-D-2’-脫氧核糖呋喃基]-5-硝基吲哚]，或利用不刺激腺苷A1，A2a，A2b或A3受體或緩激肽B2受體的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑替代腺苷堿基。
靶擊腺苷A2b受體的反義寡聚物序列的例子如下GGC CGG GCC AGC TGG GCC CCG GGC GCC C(SEQ ID NO8)GGC CGG GCC AGC TGG GCC CCG G(FRAG 1)CTC CAG CAG CAT GGC CGG GCC(FRAG 2)CGC CGT GCC CAC CGC GGC GC(FRAG 3)GCC CCA CGG CCA CGT CGG CCG C(FRAG 4)除了舉例示出的，也包括并且優(yōu)選是上面顯示的SEQ ID NO7和8的約為7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。特別優(yōu)選的是3’末端最好是保守的片段。
下面舉例示出了特異于人腺苷A2a受體的反義寡聚物。對(duì)于基因序列，參見Salvatore，C.A.，等人，基因組(1997)。也包括并且優(yōu)選是下面顯示的兩個(gè)序列的約為7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。特別優(yōu)選的是那些3’末端最好是保守的片段。GGA GCC CAT GAT GGG CAT GCC(FRAG 1)CCC ACT GCG ATG TCG GCC GCC GCC(FRAG 2)GGC CCTCCC CGC AGC CCT GGG(FRAG 3)CTT CAG CTG TCG TCG GCG CGC C(FRAG 4)(SEQ.ID NO9)GGA CCG TGC CCG CTC CCC CGG C(FRAG 1)TGC AGT GTG GAC CGT GCC CGC(FRAG 2)GGG CGTGGC TGC AGT CGG GGC(FRAG 3)GGC CCA CAC TCC TGG CGG GTG GCC G(FRAG 4)GCC GTT GGCCCA CAC TCC TGG CGG G(FRAG 5)(SEQ.ID NO10)寡核苷酸的化學(xué)類似物，例如，其中磷酸二酯鍵已被修飾，例如修飾成甲基膦酸酯，磷酸三酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，或氨基磷酸酯，以使寡核苷酸在體內(nèi)更加穩(wěn)定的寡核苷酸，也是本發(fā)明的一個(gè)方面。寡核苷酸中天然存在的磷酸二酯鍵對(duì)內(nèi)源存在的細(xì)胞核酸酶降解是敏感的，而許多類似鍵是高度抗核酸酶降解的。參見Milligan等人，出處同上，Cohen，J.S.D.，出處同上。利用“3’末端加帽”方案可以防止降解，在這一方案中，抗核酸酶的鍵在寡核苷酸的3’末端替代了磷酸二酯鍵。參見，Tidd，D.M.和Warenius，H.M.，英國(guó)癌癥雜志60343-350(1989)；Shaw，J.P.等人，核酸研究，19，747-750(1991)。氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，和甲基膦酸酯鍵都適當(dāng)?shù)匾赃@種方式起作用。已經(jīng)顯示磷酸二酯骨架的更廣泛的修飾能夠給予穩(wěn)定性，并且可能增強(qiáng)寡核苷酸的親和力和增強(qiáng)寡核苷酸的細(xì)胞滲透性。參見Milligan等人，出處同上。許多不同的化學(xué)方案已經(jīng)用于用新鍵替代整個(gè)磷酸二酯骨架。同上，骨架類似物包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，磷酸三酯，硫代甲縮醛(thioformacetal)，二硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲縮醛(formacetal)，硼磷酸酯(boranophosphate)，3’-硫代甲縮醛，2’-O-甲基，5’-硫醚，碳酸酯，5’-N-氨基甲酸酯，硫酸酯，磺酸酯，氨基磺酸酯，氨磺酰，砜，亞硫酸酯，亞砜，硫化物，羥胺，亞甲基(甲基亞氨基)(MMI)或亞甲氧基(甲基亞氨基)(MOMI)鍵。硫代磷酸酯和甲基膦酸酯修飾的寡核苷酸特別優(yōu)選，因?yàn)樗鼈兛赏ㄟ^自動(dòng)寡核苷酸合成獲得。同上，含有核苷酸堿基本身的修飾，例如，C-5-丙炔，或C-5-甲基，或糖基的修飾例如碳水化合物的修飾的反義寡核苷酸也是本發(fā)明的一個(gè)方面。適當(dāng)?shù)?，反義寡核苷酸可以它們的藥學(xué)可接受鹽形式給藥。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可以是任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，優(yōu)選地約7到60，更優(yōu)選地約10到36，還更優(yōu)選地是12到21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，取決于待結(jié)合的特定的靶和其輸送的方式。優(yōu)選地，反義寡核苷酸靶向含有內(nèi)含子和外顯子之間的接界的mRNA區(qū)。當(dāng)反義寡核苷酸靶向內(nèi)含子/外顯子接界時(shí)，可以全部位于接界，或可以與接界足夠接近以抑制前體mRNA加工成成熟mRNA過程中將間插外顯子剪接掉，例如，反義寡核苷酸的3’或5’末端定位于約例如內(nèi)含子/外顯子接界的10，5，3，或2個(gè)核苷酸內(nèi)。還優(yōu)選的是重疊起始密碼的反義寡核苷酸。當(dāng)本發(fā)明的反義寡核苷酸給藥時(shí)，它們的序列可以從給藥的物種起源相關(guān)的基因或RNA序列中得出。當(dāng)治療人類時(shí)，如果需要可以利用人反義序列。
本發(fā)明的藥劑也以含有如上所述能夠通過細(xì)胞膜和可選擇地結(jié)合細(xì)胞中的編碼受體mRNA的mRNA以防止它的翻譯，從而有效地減弱腺苷和/或緩激肽受體基因，特別是腺苷A1，A2a，A2b和/或A3受體和緩激肽B2受體的表達(dá)的反義寡核苷酸的藥物組合物的形式提供。這樣的組合物以適當(dāng)?shù)呐浞教峁殡S著載體，優(yōu)選地藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受載體，例如無菌無熱原鹽溶液?？梢岳媚軌蛲ㄟ^細(xì)胞膜的疏水載體(例如，在脂質(zhì)體中，藥學(xué)可接受水性載體攜帶的脂質(zhì)體)配制反義寡核苷酸。序列特異性寡核苷酸也可以構(gòu)建成能直接失活mRNA的實(shí)體，例如核酶。這樣的寡核苷酸可以給予需要治療的個(gè)體以便抑制腺苷受體如腺苷A1，A2a，A2b和/或A3和緩激肽B2受體的活化。另外，藥物制劑也可以含有嵌合分子，所述嵌合分子包括與已知是細(xì)胞內(nèi)在化的和/或由溶解細(xì)胞提取的物質(zhì)附著的反義寡核苷酸。這些寡核苷酸綴合物利用細(xì)胞吸收途徑以增強(qiáng)寡核苷酸的細(xì)胞濃度。以這一方式利用的大分子的例子包括運(yùn)鐵蛋白，脫唾液酸糖蛋白(通過聚賴氨酸結(jié)合寡核苷酸)和鏈霉抗生物素。
在藥物制劑中，反義寡聚物可以包含在脂顆?；蚰抑?，如脂質(zhì)體或微晶體中。這些顆?？梢允侨魏芜m當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)，如單層或多層，只要反義寡核苷酸包含在其中即可。帶正電脂類，如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲銨乙基硫酸鹽或“DOTAP”是特別優(yōu)選的這樣的顆粒和囊。這樣的脂類顆粒的制備是已知的，參見例如，授予Janoff等人的美國(guó)專利號(hào)4,880,635；授予Kurono等人的4,906,477；授予Wallach的4,911,928；授予Wallach的4,917,951；授予Allen等人的4,920,016；授予Wheatley等人的4,921,757；等等。
本發(fā)明的組合物可以通過任何輸送手段對(duì)個(gè)體給藥，這些方法將輸送反義核苷酸組合物到肺。本發(fā)明的反義寡聚物可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄谓o予病人的肺部，但優(yōu)選地通過產(chǎn)生含有可呼吸的顆粒的氣霧劑給藥，可呼吸的顆粒含有反義化合物，受試者吸入這些顆粒?？珊粑念w?？梢允且后w或固體。任選地顆?？梢院衅渌委煶煞帧?br> 本發(fā)明的反義化合物通常以顆粒的形式輸送。顆粒應(yīng)該包括可呼吸大小的顆粒，優(yōu)選地顆粒的大小足夠小以便吸入時(shí)通過嘴和喉進(jìn)入肺的支氣管和肺泡。通常，顆粒大小的范圍在約0.5到10微米是可呼吸的。包括在氣霧劑中的非可呼吸大小的顆粒趨向于沉積在喉部并且咽下，氣霧劑中的非可呼吸顆粒的量?jī)?yōu)選地盡可能地少。對(duì)于鼻給藥，顆粒大小的范圍在10到500微米是優(yōu)選的能夠保證滯留在鼻腔。
通過反義化合物和適當(dāng)?shù)妮d體如無菌無熱原水結(jié)合可以制備用于生產(chǎn)氣霧劑的活性化合物的液體藥物組合物。任選地可以包括其它治療化合物。
利用臼和杵研磨干的反義化合物，然后，將微粒化組合物通過400網(wǎng)篩粉碎或分離出大的團(tuán)塊可以制備含有微?；姆戳x化合物的可吸入干顆粒的固體顆粒組合物。含有反義化合物的固體顆粒組合物任選地含有分散劑，作用是促進(jìn)氣霧劑的形成。適當(dāng)?shù)姆稚┦侨樘?，其可以適當(dāng)比例與反義化合物混合，例如重量比例為1∶1。同樣還可以包括其它治療化合物。
給藥的反義化合物的劑量將取決于待治療的疾病，個(gè)體的狀況，特定的配方，給藥的途徑，給予個(gè)體的時(shí)間，等等。通常，寡核苷酸細(xì)胞內(nèi)的濃度為0.05到50μM，或更優(yōu)選地0.2到5μM是符合需要的，但是，更高或更低的濃度也可以用于治療。對(duì)于個(gè)體如人的給藥，通常采用的劑量范圍為0.01，0.1或1毫克/公斤到50，100，或150毫克/公斤或更多。根據(jù)給藥的活性化合物的特定配方的可溶性，每天的劑量可以分成一個(gè)或幾個(gè)單位劑量給藥。反義化合物的給藥可以治療性(即，作為挽救性治療)或預(yù)防性地進(jìn)行。
通過任何適當(dāng)?shù)氖侄稳缋脟婌F器可以生產(chǎn)含有反義化合物的液體顆粒的氣霧劑，參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,501,729。噴霧器是商購(gòu)可得的設(shè)備，它通過加速壓縮氣體，通常是空氣或氧氣，通過狹窄的文丘里小孔或通過超聲波攪拌轉(zhuǎn)化活性成分的溶液或懸浮液成為治療性氣霧劑霧。用于噴霧器的適當(dāng)配方由在液體載體中的活性成分組成，配方中含有約0.01％到約40％w/w的活性成分，和更高，優(yōu)選地達(dá)到約20％w/w。通常載體是水或稀釋的乙醇水溶液，優(yōu)選地加入例如氯化鈉制成等滲于體液的溶液。任選的添加劑包括防腐劑，如果配方?jīng)]有制備成無菌，例如羥基苯甲酸甲酯，抗氧化劑，調(diào)味劑，揮發(fā)油，緩沖劑和表面活性劑。
含有活性化合物的固體顆粒的氣霧劑可以同樣利用任何固體顆粒藥物氣霧劑發(fā)生器產(chǎn)生。用于對(duì)個(gè)體給藥固體顆粒藥劑的氣霧劑發(fā)生器產(chǎn)生的顆粒是可呼吸的，如上面解釋，并且產(chǎn)生一定體積的適用于人給藥的比例含有預(yù)定供給的藥物劑量的氣霧劑。固體顆粒氣霧劑發(fā)生器的一個(gè)舉例性類型是吹入器。通過吹入給藥的適當(dāng)配方包括精細(xì)造粒的粉末，可以通過吹入器輸送，或通過聞的方式吸入鼻腔。在吹入器中，粉末(例如，有效地進(jìn)行如本文所述的治療的供給劑量)包含在通常由明膠或塑料制備的膠囊或藥筒中，可以原位刺破或打開，通過吸入時(shí)通過裝置抽氣或通過手操作泵輸送粉末。用于吹入器的粉末僅含有活性成分，或粉末混合物，其中含有活性成分，適當(dāng)?shù)姆勰┫♂寗┤缛樘牵腿芜x的表面活性劑。活性成分通常占配方的0.1到100w/w。第二類舉例性氣霧劑生產(chǎn)器含有劑量計(jì)量吸入器，其是加壓的氣霧劑分散器，通常含有在液體化的推進(jìn)劑中的活性成分的懸浮液或溶液配方。在使用過程中，這些裝置通過適于輸送計(jì)量體積通常是10到150微升的閥排出配方溶液，以便產(chǎn)生含有活性成分的精細(xì)顆粒噴霧劑。適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑包括某些含氯氟烴化合物，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷和其混合物。另外，可以采用與氟烴和含氯氟烴化合物比較環(huán)境特性提高的其它推進(jìn)劑。另外，配方可以含有一個(gè)或多個(gè)共溶劑，例如，乙醇，表面活性劑，例如油酸或脫水山梨醇三油酸酯，抗氧化劑和適當(dāng)?shù)恼{(diào)味劑。
以約10到150升每分鐘，更優(yōu)選地30到150升每分鐘，最優(yōu)選地約60升每分鐘的比例通過氣霧劑生產(chǎn)器生產(chǎn)固體或液體顆粒形成的氣霧劑?？梢愿焖俚亟o予含有更大量的藥物的氣霧劑。
提供下面的實(shí)施例說明本發(fā)明，其將不構(gòu)成限制。
實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，μM指微摩爾/升，mL指毫升，μm指微米，mm指毫米，cm指厘米，℃指攝氏度，μg指微克，mg指毫克，g指克，kg指千克，M指摩爾/升，和h或hr指小時(shí)。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)和合成反義寡核苷酸針對(duì)A1和A3腺苷受體的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)可能需要靶A1受體mRNA，靶A2a受體mRNA，靶A2b受體mRNA和靶A3受體mRNA的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的溶液。在產(chǎn)生這一結(jié)構(gòu)后，設(shè)計(jì)反義核苷酸以靶擊mRNA區(qū)，這種區(qū)域可以理解為使mRNA具有功能活性或穩(wěn)定性，該區(qū)最好與起始密碼重疊。其它靶位點(diǎn)是容易利用的。作為反義效應(yīng)的特異性的證明，其它不完全是與靶mRNA互補(bǔ)，但含有同樣的重量比的核苷酸組合物的寡核苷酸包括在反義實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照。
分析腺苷A1受體mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并且如上所述用于設(shè)計(jì)硫代磷酸酯反義寡核苷酸。合成的反義寡核苷酸命名為HAdA1AS并且具有下面的序列5’-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3’(SEQ ID NO1)作為對(duì)照，合成具有下面的序列的命名為HAdA1MM的錯(cuò)配的硫代磷酸酯反義核苷酸GTA GGT GGC GGG CAA GGC GGG(SEQ ID NO2)每個(gè)寡核苷酸具有相同的堿基含量和一般的序列結(jié)構(gòu)。在GENBANK(release85.0)和EMBL(release40.0)中同源性檢索表明該反義寡核苷酸特異于人和兔腺苷A1受體基因，并且錯(cuò)配對(duì)照不是與任何已知基因序列雜交的候選物。
同樣分析了腺苷A3受體mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且如上所述用于設(shè)計(jì)了兩個(gè)硫代磷酸酯反義寡核苷酸。合成的第一個(gè)反義寡核苷酸(HAdA3AS1)具有下面的序列5’-GTTGTTGGGCATCTTGCC-3’(SEQ ID NO3)作為對(duì)照，合成了錯(cuò)配的硫代磷酸酯反義寡核苷酸(HAdA3MM1)，具有下面的序列5’-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3’(SEQ ID NO4)同時(shí)設(shè)計(jì)和合成了第二個(gè)硫代磷酸酯反義寡核苷酸(HAdA3AS2)，具有下面的序列5’-GTG GGC CTA GCT CTC GCC-3’(SEQ ID NO5)它的對(duì)照寡核苷酸(HAdA3MM2)具有序列5’-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3’(SEQ ID NO6)在應(yīng)用生物系統(tǒng)公司396型寡核苷酸合成儀上合成了硫代磷酸酯寡核苷酸，并且利用NENSORB層析(DuPont，MD)純化。
實(shí)施例2腺苷A1受體反義寡核苷酸的體外效果在體外模型中利用肺腺癌細(xì)胞HTB-54測(cè)試了如上所述的針對(duì)人A1受體的反義寡核苷酸(SEQ ID NO1)的效果。利用標(biāo)準(zhǔn)的Northern印跡程序和在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和合成的受體探針證明HTB-54肺腺癌細(xì)胞表達(dá)A1腺苷受體。
將HTB-54人肺腺癌細(xì)胞(106/100毫米組織培養(yǎng)皿)與5.0μMHAdA1AS(SEQ ID NO1)或HAdA1MM(SEQ ID NO2)接觸24小時(shí)，在培養(yǎng)12小時(shí)后替換新鮮培養(yǎng)基和寡核苷酸。在與寡核苷酸接觸24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，通過標(biāo)準(zhǔn)程序提取它們的RNA。合成對(duì)應(yīng)于反義序列靶擊的mRNA區(qū)(并且因此具有如反義序列同樣的序列，但不是硫代磷酸酯化)的21-聚體探針，并且用于探測(cè)從HAdA1AS處理的，HAdA1MM處理的和未處理的HTB-54細(xì)胞制備的RNA的Northern印跡。這些印跡清楚地顯示HAdA1AS(SEQ ID NO1)，而不是HAdA1MM(SEQ ID NO2)有效地減少人腺苷受體mRNA達(dá)50％以上。這一結(jié)果表明HAdA1AS(SEQ ID NO1)是抗哮喘藥物的良好候選物，因?yàn)樗谋M了參與哮喘的腺苷A1受體的細(xì)胞內(nèi)mRNA。
實(shí)施例3A1腺苷受體反義寡核苷酸的體內(nèi)效果在重疊起始密碼的腺苷A1基因內(nèi)兔和人DNA序列之間的偶然的同源性使得最初設(shè)計(jì)用于針對(duì)人腺苷A1受體的硫代磷酸酯反義寡核苷酸能用于兔模型中。
利用312抗原單位/毫升馬塵螨(D.farinae)提取物(BerkeleyBiologicals，Berkeley，CA)，與10％高嶺土混合在出生的24小時(shí)內(nèi)腹膜內(nèi)免疫接種新生新西蘭白色無巴斯德菌兔。在第一個(gè)月每星期重復(fù)接種免疫，然后，后二個(gè)月每?jī)尚瞧诿庖呓臃N一次。在3-4個(gè)月齡時(shí)，麻醉8個(gè)敏感的兔，利用肌肉內(nèi)給予鹽酸氯胺酮(44毫克/公斤)和乙酰丙嗪馬來酸(0.4毫克/公斤)的混合物松弛。
然后，在小的有墊子的動(dòng)物板上以舒服的位置仰臥放置兔，利用4.0毫米的氣管內(nèi)管插管(Mallinkrodt，公司，Glens Falls，NY)。將具有附著的橡膠氣囊的外部直徑為2.4毫米的聚乙烯導(dǎo)管通過食管并且在實(shí)驗(yàn)過程中保持離開嘴同樣的距離(約16厘米)。將氣管內(nèi)管附著于加熱的Fleisch呼吸速度描記器(大小00；DOM醫(yī)學(xué)公司，Richmond，VA)，利用Gould載體擴(kuò)增儀(11-4113型，Gould電子，Cleveland，OH)驅(qū)動(dòng)的Validyne壓力差異換能器(DP-45161927型；Validyne工程公司，Northridge，CA)測(cè)量流量。將食管氣囊附著于壓力差異換能器的一側(cè)，將氣管內(nèi)管的出流連接在壓力差異換能器的另一側(cè)，使得能記錄跨肺的壓力。整合流量給出連續(xù)的潮氣體積，用一自動(dòng)呼吸分析儀(6型，Buxco，Sharon，CT)，以等體積和流量零點(diǎn)計(jì)算總肺抗性(RL)和動(dòng)態(tài)貼合性(Cdyn)。
任意取動(dòng)物，在第1天獲得氣霧化的腺苷的PC50預(yù)處理值。在無菌生理鹽水中以5000微克(5毫克)每1.0毫升的濃度溶解反義(HAdA1AS)或錯(cuò)配對(duì)照(HAdAS1MM)寡核苷酸。隨后，通過氣管內(nèi)管每天兩次共2天對(duì)動(dòng)物給藥氣霧化的反義或錯(cuò)配寡核苷酸(約1.0毫升體積中5000微克)。通過超聲波噴霧器(DeVilbiss，Somerset，PA)產(chǎn)生了鹽，腺苷，或反義或錯(cuò)配寡核苷酸的氣霧劑，產(chǎn)生80％小于5微米直徑的氣霧劑小滴。
在實(shí)驗(yàn)的第一部分，對(duì)四個(gè)任意選擇的變應(yīng)性兔給藥反義寡核苷酸，另四個(gè)兔給藥錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸。在第三天的早晨，獲得PC50值(與基準(zhǔn)值相比支氣管氣道的動(dòng)態(tài)貼合降低50％所需的氣霧化的腺苷的濃度，毫克/毫升)，并與在接觸寡核苷酸之前的這些動(dòng)物獲得的PC50值比較。
在2星期的間隔后，交換動(dòng)物，前面給藥錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸的那些現(xiàn)在給藥反義寡核苷酸，前面利用反義寡核苷酸處理的動(dòng)物現(xiàn)在給藥錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸。處理方法和測(cè)量方法與實(shí)驗(yàn)的第一部分利用的那些方法相同。應(yīng)該注意到在8個(gè)用反義寡核苷酸處理的動(dòng)物中的6個(gè)，其中腺苷的溶解度達(dá)到極限20毫克/毫升仍然不能獲得腺苷介導(dǎo)的支氣管狹窄。為了計(jì)算的目的，這些動(dòng)物的PC50值設(shè)定在20毫克/毫升。所以，給出的值代表了反義效果的最小數(shù)據(jù)。真正的效果更高。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖1和表1中示出。
表1腺苷A1受體反義寡核苷酸對(duì)哮喘的兔中的PC50值的作用<
結(jié)果表示為平均(N＝8)±SEM。通過變量的重復(fù)測(cè)量分析(ANOVA)，和Turkey保護(hù)測(cè)試確定顯著性**與所有其它組的明顯不同，p＜0.01。
在實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)部分中，接受反義寡核苷酸的動(dòng)物均顯示了降低肺的動(dòng)態(tài)貼合性50％所需的氣霧化腺苷的劑量增加一個(gè)數(shù)量級(jí)。觀察到錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸對(duì)PC50值沒有效果。在接受反義或?qū)φ盏奈氲墓押塑账岬乃袆?dòng)物中均沒有觀察到毒性。
這些結(jié)果明顯地顯示了肺具有作為基于反義寡核苷酸的肺疾病的治療性干預(yù)的靶的優(yōu)異潛力。另外，他們顯示了緊密接近人哮喘的模型系統(tǒng)中，腺苷A1受體的下調(diào)大大減弱了哮喘氣道中的腺苷介導(dǎo)的支氣管狹窄。在人哮喘的變應(yīng)性兔模型中支氣管的超反應(yīng)性是反義干預(yù)的良好結(jié)局，因?yàn)閰⑴c這一應(yīng)答的組織位于與氣霧化寡核苷酸接觸的點(diǎn)附近，該模型很接近地模仿了這一重要的人疾病。
實(shí)施例4腺苷A1受體反義寡核苷酸的特異性在實(shí)施例3的交叉實(shí)驗(yàn)的結(jié)尾，來自所有兔的氣道光滑肌進(jìn)行了外科解剖，并且定量地分析了腺苷A1受體數(shù)目。作為反義寡核苷酸的特異性的對(duì)照，將應(yīng)該不受影響的腺苷A2受體同時(shí)進(jìn)行定量。
從每個(gè)兔中解剖氣道光滑肌組織，根據(jù)所述方法制備膜部分(J.Kleinstein和H.Glossmann，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.305，191-200(1978)，所述方法經(jīng)過輕微修改。將粗質(zhì)膜制劑儲(chǔ)藏在70℃直到測(cè)試時(shí)間。通過Brakford方法(M.Bradford，生物化學(xué)分析72，240-254(1976))確定蛋白質(zhì)含量。在室溫下解凍冷凍的質(zhì)膜，并且利用0.2單位/毫升腺苷脫氨酶在37C溫育30分鐘，以便除去內(nèi)源腺苷。[3H]DPCPX(特異于A1受體)或[3H]2-[p-(2-羧乙基)-苯乙氨基]-5’-(N-乙基羰酰氨基)腺苷(CGS-21680；特異于A2受體)的結(jié)合如前所述進(jìn)行測(cè)量，S.Ali等人，藥學(xué)實(shí)驗(yàn)理論雜志，268，Am.J.Physiol 266，L271-277(1994)。
如圖2和表2中所示，如特異于A1拮抗劑DPCPX的特異結(jié)合所測(cè)試的，在交叉實(shí)驗(yàn)中用腺苷A1反義寡核苷酸處理的動(dòng)物與對(duì)照比較A1受體的數(shù)目將近下降了75％。如特異于A2受體的激動(dòng)劑CGS-21680的特異結(jié)合測(cè)試的，腺苷A2受體數(shù)目沒有變化。
表2腺苷A1受體反義寡核苷酸的作用的特異性
結(jié)果表示成平均(N＝8)±SEM通過變量的重復(fù)測(cè)量分析(ANOVA)，和Turkey保護(hù)測(cè)試確定顯著性**與錯(cuò)配對(duì)照明顯不同，p＜0.01前面的實(shí)施例是本發(fā)明的說明，并不構(gòu)成對(duì)發(fā)明的限制。下面的權(quán)利要求定義了本發(fā)明，權(quán)利要求的等當(dāng)物包括在其中。
權(quán)利要求
1.一種藥劑，包括一種寡核苷酸，該寡核苷酸是選自如下一組RNA的信使RNA(mRNA)的反義寡核苷酸，所述的RNA(a)與選自腺苷受體和緩激肽受體靶基因的DNA互補(bǔ)；(b)與靶腺苷和緩激肽受體基因的內(nèi)含子和外顯子邊界區(qū)互補(bǔ)，選自由包括5’，3’末端和編碼和非編碼區(qū)之間的內(nèi)含子/外顯子接界的寡核苷酸區(qū)段組成的組；(c)選自由編碼腺苷和緩激肽受體的RNA組成的組的所有RNA片段；和(d)其藥物學(xué)可接受鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中受體選自由腺苷A1，A2a，A2b和A3受體和其藥物學(xué)可接受鹽組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥劑，其中受體是腺苷A1受體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥劑，其中受體是腺苷A2b受體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥劑，其中受體是腺苷A3受體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥劑，其中受體是腺苷A2a受體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥劑，其中受體是緩激肽B2受體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸包括至少一個(gè)被如下的殘基所取代的連接單核苷酸的磷酸二酯鍵殘基，所述的殘基選自由甲基膦酸酯，磷酸三酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硼磷酸酯，甲縮醛，2’-O-甲基，硫代甲縮醛，硫醚，碳酸酯，氨基甲酸酯，硫酸酯，磺酸酯，氨基磺酸酯，氨磺酰，砜，亞硫酸酯，亞砜，硫化物，羥胺，亞甲基(甲基亞氨基)，亞甲氧基(甲基亞氨基)，和氨基磷酸酯殘基組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸包括約7到60個(gè)單核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥劑，其中反義寡核苷酸包括約10到36個(gè)單核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥劑，其中反義寡核苷酸包括約12到約21個(gè)單核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸選自SEQ IDNO7，SEQ ID NO7的片段1到955，和SEQ ID NO7的約7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸選自SEQ IDNO8，SEQ ID NO8的片段1到4，和SEQ ID NO8的約7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸選自SEQ IDNO9，SEQ ID NO9的片段1到4，和SEQ ID NO9的約7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸選自SEQ IDNO10，SEQ ID NO10的片段1到5，和SEQ ID NO10的約7到18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中反義寡核苷酸可操作地連接一個(gè)是活細(xì)胞內(nèi)在的或從其提取出的物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥劑，其中該物質(zhì)選自由運(yùn)鐵蛋白，脫唾液酸糖蛋白，和鏈霉抗生物素蛋白組成的組。
18.一種組合物，含有權(quán)利要求1的藥劑；和載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中載體選自由氣態(tài)載體，固體載體和液體載體組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，進(jìn)一步包括失活mRNA的物質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中失活mRNA該物質(zhì)包括一種酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的酶包括核酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，進(jìn)一步包括一種選自由其它治療性化合物，提供抗氧化劑，調(diào)味劑，揮發(fā)油，緩沖劑，分散劑，表面活性劑，推進(jìn)劑和防腐劑組成的組的試劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中反義寡核苷酸以占組合物的約0.01到約99.99w/w的量存在。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中反義寡核苷酸以占組合物的約0.1到約40w/w的量存在。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中反義寡核苷酸以占組合物的約1到約20w/w的量存在。
27.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求18所述的組合物，其中載體包括藥學(xué)或獸藥可接受載體。
28.一種配方，包括權(quán)利要求18所述的組合物，其中載體包括疏水載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的配方，其中載體包括脂顆?；蚰?。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的配方，其中囊包括脂質(zhì)體，顆粒包括微晶體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的配方，其中囊包括含有反義寡核苷酸的脂質(zhì)體。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的配方，其中顆粒包括選自由N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲銨甲基硫酸鹽組成的組的脂類。
33.根據(jù)權(quán)利要求28所述的配方，包括可呼吸的配方。
34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的配方，包括氣霧劑。
35.含有權(quán)利要求18所述的組合物的膠囊或藥筒。
36.一種試劑盒，包括權(quán)利要求18所述的組合物；和其給藥說明。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，包括輸送裝置；和用于組合物給藥的說明。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥盒，其中輸送裝置包括吸入器，它計(jì)量輸送組合物的劑量。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥盒，其中吸入器包括噴霧器或吹入器；并且進(jìn)一步包括具有藥劑固體顆粒的可刺破或可打開的膠囊或藥筒。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥盒，其中輸送裝置含有加壓吸入器，并且該配方包括藥劑的懸浮液或溶液。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的藥盒，進(jìn)一步包括在分開的容器中的選自由其它治療性化合物，抗氧化劑，調(diào)味和著色劑，填充劑，揮發(fā)油，緩沖劑，分散劑，表面活性劑，細(xì)胞內(nèi)在化的或提取自細(xì)胞的物質(zhì)，RNA失活劑，抗氧化劑，調(diào)味劑，推進(jìn)劑和防腐劑組成的組的試劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的藥盒，其中溶劑選自由有機(jī)溶劑和混合一種或多種共溶劑的有機(jī)溶劑組成的組。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥盒，其中藥劑懸浮于或溶解于溶劑或其混合物中。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的藥盒，其中溶劑選自由含氯氟烴或含氯氟烴與共溶劑組成的組；配方進(jìn)一步包括選自由表面活性劑，抗氧化劑，和調(diào)味劑組成的組的試劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求37的藥盒，其中組合物提供在膠囊或藥筒中。
46.細(xì)胞，含有權(quán)利要求1的藥劑。
47.治療與支氣管狹窄和/或肺部炎癥相關(guān)的疾病或癥狀的方法，包括將權(quán)利要求1的藥劑直接給藥到需要這樣的治療的個(gè)體的呼吸道，其中含有抗支氣管狹窄和/或抗炎癥有效量的反義寡核苷酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中將藥劑直接給藥到個(gè)體的肺，藥劑的形式是含有反義寡核苷酸的可呼吸的顆粒的氣霧劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中疾病或癥狀包括炎癥；并且藥劑包括腺苷A3受體mRNA的反義寡核苷酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中疾病或癥狀包括呼吸疾病或癥狀；并且藥劑包括腺苷A1受體mRNA的反義寡核苷酸。
51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中疾病或癥狀包括呼吸疾病或癥狀和肺部炎癥；并且藥劑包括腺苷A2b受體mRNA的反義寡核苷酸。
52.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中疾病或癥狀包括變應(yīng)性；并且藥劑包括腺苷A3受體mRNA的反義寡核苷酸。
53.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中疾病或癥狀包括呼吸疾病和肺部炎癥；并且藥劑包括腺苷A2a受體mRNA的反義寡核苷酸。
54.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中疾病或癥狀包括呼吸疾病和肺部炎癥；并且藥劑包括緩激肽B2受體的反義寡核苷酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中個(gè)體是哺乳動(dòng)物個(gè)體。
56.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中哺乳動(dòng)物個(gè)體選自由人和非人個(gè)體組成的組。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中哺乳動(dòng)物個(gè)體是人。
58.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中個(gè)體是人。
59.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中受體和個(gè)體屬于同樣的物種。
60.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中受體和個(gè)體屬于不同的物種。
61.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中藥劑以可呼吸的氣霧劑形式給藥。
62.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中疾病或癥狀是肺疾病或癥狀；并且至少一個(gè)靶mRNA編碼選自由腺苷A1受體，腺苷A2a受體，腺苷A2b受體，腺苷A3受體，和緩激肽B2受體組成的組的蛋白質(zhì)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中疾病或癥狀與個(gè)體氣道阻塞和/或支氣管狹窄相關(guān)。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與哮喘相關(guān)。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與炎癥相關(guān)。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與成人呼吸窘迫綜合癥相關(guān)。
67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與慢性阻塞性肺病相關(guān)。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與肺動(dòng)脈高血壓相關(guān)。
69.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與變應(yīng)性相關(guān)。
70.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中疾病或癥狀與肺氣腫相關(guān)。
71.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中反義寡核苷酸以約0.001到約150毫克/公斤個(gè)體體重的量給藥。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中反義寡核苷酸以約0.1到約100毫克/公斤體重的量給藥。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中反義寡核苷酸以約1到50毫克/公斤體重的量給藥。
74.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，是預(yù)防性的方法。
75.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，是治療性的方法。
全文摘要
一種藥劑包括用于減輕呼吸失調(diào)和炎癥的針對(duì)腺苷受體的反義寡聚物。該藥劑以組合物,各種配方和藥盒形式提供。本發(fā)明藥劑可以以抗支氣管狹窄和/或抗炎癥的有效量給藥,以減輕個(gè)體的支氣管狹窄和炎癥。優(yōu)選的藥劑含有靶擊腺苷A
文檔編號(hào)A61P11/00GK1247473SQ97181523
公開日2000年3月15日 申請(qǐng)日期1997年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月26日
發(fā)明者喬納森·W·耐思 申請(qǐng)人:東卡羅來納大學(xué)