專利名稱：：甘露糖在制備治療肺部炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬藥物用途，涉及甘露糖的藥物新用途，具體涉及甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病藥品或保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘露糖(mannose)，此名來(lái)源于圣經(jīng)中甘露(manna)。作為己醛糖之一，與人們最熟知的葡萄糖不僅是同分異構(gòu)體，且有著許多密不可分的關(guān)系。甘露糖分子式C晶206，分子量180.16，密度L539。結(jié)構(gòu)有直鏈和環(huán)狀。構(gòu)型有D—和L一兩種，自然界常見的是D—甘露糖。作為糖類，甘露糖無(wú)疑首要的用途是甜昧劑，用于食品飲料的添加劑，其次是醫(yī)藥，對(duì)糖尿病、肥胖病、便秘和高膽固醇等疾病患者有良好的輔助治療作用。據(jù)報(bào)道養(yǎng)殖業(yè)也有運(yùn)用，如在雞的飲水中加入適量的甘露糖，可以提高雞的產(chǎn)蛋量及防止沙門氏菌污染蛋品。甘露糖還是其衍生物的前體，通過(guò)甘露糖衍生的化合物更多、用途更廣。目前較為熟知的是甘露醇，甘露醇比甘露糖運(yùn)用的要廣，它是低熱量甜味劑、口香糖及果糖的舫粘劑、營(yíng)養(yǎng)的增補(bǔ)劑、組織的改良劑及片劑的賦形劑。在工業(yè)上可用于塑料行業(yè)制造松香酸脂及人造甘油樹脂、炸藥、雷管(硝化甘露醇)等。在醫(yī)藥上是良好的利尿劑，可降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓，是急救藥的首選藥之一。但到目前為止，尚未見有關(guān)甘露糖用于治療肺部炎癥性疾病的報(bào)道，特別是用于治療急性肺損傷(AcuteLungInjury,ALI)，急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome,ARDS)，嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS)等疾病的報(bào)道。急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征，SARS都屬于各種原因引起的肺部急性炎癥性疾病，是一種常見而嚴(yán)重的臨床綜合癥并影響病人的生命安全。ARDS最近被明確為一種急性發(fā)作和氧合損傷的疾病(動(dòng)脈氧分壓與吸入氧分?jǐn)?shù)之比小于200),有雙側(cè)肺浸潤(rùn)以及肺動(dòng)脈嵌合壓小于19mmHg，而ALI指的是臨床上那些動(dòng)脈氧分壓與吸入氧分?jǐn)?shù)之比小于300的患者。AU是ARDS發(fā)展的前期階段，而ARDS則是ALI惡化形式。ALI/ARDS也是器官功能不全最常見的形式。急性呼吸功能不足常發(fā)生在炎癥反應(yīng)的24-72小時(shí)之內(nèi)和引起其它器官系統(tǒng)進(jìn)行性功能不全，如系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征(SystemicInflammatoryResponseSyndrome,SIRS)和多器官功能不全綜合征(MultipleOrganDysfUnctionSyndrome,MOD)。雖然ALI/ARDS在整個(gè)人群中發(fā)病率只是一定數(shù)量，但是在重危病人和監(jiān)護(hù)室病人中，它的發(fā)病率極高，并且在短期內(nèi)治療ALI/ARDS的費(fèi)用是極為昂貴。以美國(guó)為例，大約百分之五十重癥膿毒血癥病人患有ALI/ARDS或呼吸道合并癥，而每個(gè)這樣病人平均住院日期為二十天并花費(fèi)2.2萬(wàn)美元。每年全美國(guó)這樣病人的治療費(fèi)用約為17億美元，而其中一半或半數(shù)以上的費(fèi)用用于ALI/ARDS治療。而目前對(duì)上述疾病的治療手段有限，主要是通氣支持療法以及大劑量抗菌藥物基礎(chǔ)上早期糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，而糖皮質(zhì)激素雖然可以抑制炎癥細(xì)胞的聚集以及炎癥介質(zhì)的釋放等優(yōu)點(diǎn)，但也會(huì)帶來(lái)各種類型的副作用以及不良反應(yīng)，例如抑制了機(jī)體的免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的代謝功能，水鹽平衡等產(chǎn)生不良影響，而這些與患者的癥狀相互重疊，長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)也產(chǎn)生深重的不良影響，因此，尋找有效而副作用更低的抑制急性期炎癥細(xì)胞聚集和釋放的藥物是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供甘露糖的新的藥物用途，即甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的甘露糖分子式C6H1206，分子量180.16，密度1.539，構(gòu)型為D—甘露糖。所述的治療肺部急性炎癥性疾病的藥物包括治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合征等疾病的藥物。本發(fā)明所涉及的肺部急性炎癥性疾病的藥物還包括治療其他原因引起的以肺部的炎癥細(xì)胞滲出和炎癥介質(zhì)大量釋放的炎癥性變化的藥物。本發(fā)明模擬臨床急性肺損傷建立了小鼠的動(dòng)物模型，應(yīng)用該模型研究后發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的甘露糖藥物制備，以lmg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、和100mg/kg的劑量能降低LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型的肺組織TNF-a水平升高，減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度，抑制毛細(xì)血管通透性，減少蛋白滲出及肺水含量，降低BALF上清的MPO水平，改善肺組織炎癥病理變化。這些結(jié)果提示甘露糖具有抗炎、抗氧化、減輕肺水腫等多方面作用，可以在制備臨床治療急性肺損傷的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的甘露糖有多種提取方法，目前屬于已知工藝并技術(shù)成熟，并已有商品出售。本發(fā)明的甘露糖是一種藥物活性成分，按照常規(guī)的制劑工藝，可以以甘露糖為主要活性成分，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、增稠劑、增溶劑等藥物輔料或載體，制成任何一種適于臨床上使用的劑型，如膠囊劑、口服液體劑、注射劑、氣霧噴劑、滴劑等。尤其制備甘露糖生理鹽水液體制劑。所述藥物的給藥方式包括口服給藥、噴霧給藥或注射給藥。本發(fā)明提供的甘露糖還可與其它活性組份或輔料配合制成藥物制劑。本發(fā)明的甘露糖在制成上述劑型時(shí)，均具有治療肺部急性炎癥性疾病，包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥等疾病的作用。任何藥劑，如果其組份中含有甘露糖或僅以甘露糖單一成份制備成藥，在其包裝或說(shuō)明書等標(biāo)識(shí)上，以及在其他任何宣傳品上，只要注明或提示具有治療肺部急性炎癥性疾病，包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥等上述疾病的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的有益效果是拓展了甘露糖的醫(yī)藥新用途，克服因長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)體造成的不良副作用。為臨床治療肺部急性炎癥性疾病提供了一種有效而副作用更低的抑制急性期炎癥細(xì)胞聚集和釋放的藥物。甘露糖來(lái)源于天然植物，也可由其他合成方法而得，易制備，價(jià)格低廉，實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明的甘露糖制備的藥物，以15mg/kg、45mg/kg、135和405mg/kg的劑量，經(jīng)靜脈給予內(nèi)毒素脂多糖(LPS，3mg/kg)誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘露糖顯著降低了急性肺損傷模型大鼠的肺干/濕重比例，減少了血漿蛋白的滲出，抑制了白細(xì)胞在肺部的聚集，顯著抑制了急性肺損傷模型大鼠的肺組織以及支氣管肺泡灌洗液的腫瘤壞死因子a(TNF-a)的水平。并且，甘露糖135mg/kg和405mg/kg增加了急性肺損傷模型大鼠肺內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)的活性，45mg/kg、135mg/kg和405mg/kg三個(gè)劑量的甘露糖也改善了急性肺損傷模型大鼠的病理變化，這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明，甘露糖可以緩解急性肺損傷的多種病理生理變化，從而緩解臨床癥狀。圖1為甘露糖和地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠BALF炎癥細(xì)胞的影響。圖2為甘露糖和地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)肺伊文氏蘭滲出的抑制作用。圖3為甘露糖和地塞米松對(duì)對(duì)肺組織中TNF-a及IL-10水平的影響。圖4為甘露糖對(duì)LPS致小鼠肺濕重/干重比值的影響。圖5為L(zhǎng)PS給小鼠氣道滴入6小時(shí)后肺組織炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)和組織間隙水腫。圖6為甘露糖和地塞米松對(duì)肺組織病理變化的影響。圖7為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈血氧分壓下降的保護(hù)作用。圖8為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈血二氧化碳分壓上升的保護(hù)作用。圖9為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺血管通透性指數(shù)增加的保護(hù)作用。圖IO為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺水腫的保護(hù)作用。圖11為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠BALF中炎癥細(xì)胞的影響。圖12為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織MPO水平升高的保護(hù)作用。圖13為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠BALF中MPO水平升高的保護(hù)作用。圖14為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織SOD水平下降的保護(hù)作用。圖15為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-a水平上升的保護(hù)作用。圖16為甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺組織SOD水平下降的保護(hù)作用。圖17為L(zhǎng)PS給大鼠氣道滴入6小時(shí)后肺組織炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)和組織間隙水腫病理檢查代表性照片，HE染色。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1甘露糖對(duì)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)(GradeII)雄性ICR品系小鼠(體重2022g)，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SYXK(Zhe)20040052。所有的操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均自由進(jìn)食和進(jìn)水。2.主要試劑和儀器(1)脂多糖(LPS,Esherichiacoli0127:B8):美國(guó)Sigma公司；(2)甘露糖(D-mannose):美國(guó)Sigma公司；(3)地塞米松磷酸鈉注射液(dexamethasone，DXM，批號(hào)050502):浙江仙琚制藥股份有限公司；(4)水合氯醛國(guó)產(chǎn)分析純制品；(5)烏拉坦國(guó)產(chǎn)分析純制品；(6)其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純制品；(7)小鼠TNF-ocELISA測(cè)定試劑盒(批號(hào)E016527):BioscienceCo.USA;(8)小鼠IL-10ELISA測(cè)定試劑盒(批號(hào):E017710):BioscienceCo.USA;(9)考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)20060515):購(gòu)于南京建成生物工程公司；(10)髓過(guò)氧化酶測(cè)定試劑盒(批號(hào)20060516):購(gòu)于南京建成生物工程公司；(11)抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒(批號(hào)20060517):購(gòu)于南京建成生物工程公司；(12)酶標(biāo)儀型號(hào)ELX800UV，Bio-tekinstrumentINC，美國(guó)；(13)PH酸度計(jì):MettlerToledo320PHMeter,瑞典；(14)顯微鏡BX51型，CH21型,Olympus公司，日本；(15)純水儀Labconco公司，美國(guó)；(16)冷凍離心機(jī)5804R型，eppendorf公司，德國(guó)；(17)AF10制冰機(jī):Scotman公司，意大利；(18)電子天平FA1104型，JY6001型，上海天平儀器廠；(19)精密天平AG245型，MettlerToledo公司，瑞典；(20)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9145型，上海一恒科技有限公司；(21)臺(tái)式恒溫振蕩器SHZ-88型，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；(22)低溫冰箱FormaScientific公司，美國(guó)；(23)勻漿機(jī)寧波新科；(24)恒溫循環(huán)水浴槽Fisherscientific公司；3.主要試劑的配制(1)LPS溶液精密稱取LPS，用生理鹽水配成濃度為2mg.ml"的溶液；充分混勻，4'C冰箱中保存。(2)甘露糖溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，用完后4'C保存小鼠實(shí)驗(yàn)以0.1ml/20g給藥體積量用生理鹽水配制1)lmg,kg"給藥組(即0.2mg.mr1)，2)3mg'kg"給藥組(即0.6mg'mr1)，3)10mg'kg"給藥組(即2mg.mr1)，4)30mg.kg"給藥組(即6mgml")，5)100mg'kg"給藥組(即20mg'mr1)等不同濃度的給藥組溶液，低濃度藥液可由高濃度稀釋而成。(3)水合氯醛用雙蒸水配成10%的濃度，以0.5g'kg"麻醉小鼠；(4)PBS配方NaCl:8.00gKC1:0.20g"七"a^1Tf加水配至1LNa2HP04-12H20:3.49gKH2P04:0.20g4.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS組和甘露糖(1、3、10、30、lOOmg.kg")組和地塞米松(DXM，0.5mg.kg")等8組。以0.5g.kg"劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠后，小心鈍性分離并暴露氣管，氣管內(nèi)滴入LPS4mglg"(20|il/10g)，對(duì)照組給予相同容積劑量的生理鹽水，甘露糖組和DXM組分別于造模前10min和造模后3h給予尾靜脈注射相應(yīng)劑量各1次。5.支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)造模6h后將小鼠麻醉后股動(dòng)脈放血處死，暴露氣管行氣管插管，用PBS液1.5ml分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，回收率達(dá)80%，冰浴保存收集的BALF，將其混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)液稀釋后進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，然后用冰凍離心機(jī)(4°C)1500rpm離心10min，取細(xì)胞沉淀涂片，涼干后Wright染色，做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；留取上清液，儲(chǔ)存于-8(TC備用。6.支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量的測(cè)定取上清液用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測(cè)定BALF中蛋白含量，測(cè)定方法參照廠商提供的使用說(shuō)明書操作。7.肺毛細(xì)血管通透性測(cè)定LPS滴入氣管5.5h后，以1%伊文思藍(lán)5ml，kg"尾靜脈注射，30min后，麻醉小鼠，打開胸腔暴露心肺，從右心室注入生理鹽水沖洗凈肺血管內(nèi)的血液，剪除心臟與肺門組織，濾紙吸干血液和肺周圍水分，精密稱取肺組織，用手術(shù)剪將肺組織剪成均勻小塊，置試管內(nèi)，每100mg肺組織加入丙酮一生理鹽水溶液(7:3，v/v)3ml，置室溫(25°C)24h，然后1500rpm離心10min，取上清用分光光度計(jì)480nm比色測(cè)定浸出液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克濕肺中伊文氏蘭的含量。8.髓過(guò)氧化酶(MPO)和抗超氧陰離子自由基(0,—)測(cè)定取-8(TC保存的BALF上清，4°C，10，OOOrpm離心15min，取其上清液，用試劑盒測(cè)定其MPO和02"的含量，測(cè)定方法參照廠商提供的使用說(shuō)明書。9.肺水含量與細(xì)胞因子的測(cè)定將小鼠分為正常組、LPS組、甘露糖lmg'kg"組、10mg'kg"組、30mg'kg"組和DXM(0.5mg'kg")組。造模6h將小鼠麻醉后股動(dòng)脈放血處死，暴露氣管，取右下葉肺稱重濕肺，并隨即置于6(TC烘箱烘烤48h后稱干重，剩余肺組織加入磷酸緩沖液(PBS)，用組織勻漿機(jī)把肺組織制成10%(w/v)的組織勻漿，4°C，10，000rpm離心15min，分裝吸取的上清至-8(TC冰箱保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-10和TNF-a含量，具體操作方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書。10.肺組織學(xué)檢查造模6h后將小鼠麻醉后股動(dòng)脈放血處死，暴露氣管，取左肺用中性福爾馬林固定，制備石蠟切片，HE染色。顯微鏡高倍鏡下觀察肺組織炎癥性浸潤(rùn)、損傷、水腫等病理性變化。采用半定量積分法評(píng)估這些病理變化的嚴(yán)重程度即每個(gè)小鼠的病理切片在顯微鏡高倍鏡下用數(shù)碼相機(jī)隨機(jī)攝影5個(gè)不同區(qū)域的照片，然后在電腦上讀片，計(jì)數(shù)這5張照片中的中性粒細(xì)胞數(shù)目(血管內(nèi)中性粒細(xì)胞除外)，05個(gè)/張為(0)，625(+)，2645(++)，4665(+++)，65以上(++++);并參考損傷、水腫等病理性變化的嚴(yán)重程度加以綜合評(píng)分。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用；±^表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用f檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用"檢驗(yàn)。尸<0.05表示有顯著性差異，表示有非常顯著性差異。結(jié)果1.對(duì)BALF中炎癥細(xì)胞聚集的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)目迅速上升，與正常組比較分別增加了7.1倍和192倍。甘露糖l、3、10、30和100mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴減少BALF中的白細(xì)胞總數(shù)，其抑制率分別為10.9、21.5、41.3、48.3和54.3%;呈劑量依賴減少中性粒細(xì)胞數(shù)目，其抑制率分別為30.7、47.7、65.5、75.3和82.2%。地塞米松(作為陽(yáng)性對(duì)照藥)0.5mg'kg"靜脈注射顯示強(qiáng)大的抗炎作用，其作用強(qiáng)度相當(dāng)于甘露糖103011^.1^-1，參見圖l(5士SD,動(dòng)物數(shù)=1017.tt##p<0.001w對(duì)照組，"pO.Ol,一pO.OOlvsLPS組)。2.對(duì)BALF中蛋白含量的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組BALF中的蛋白含量與正常組比較明顯升高(PO.OOl)，甘露糖3、10、30和IOOmg.kg"靜脈注射能明顯減少BALF中的蛋白含量，地塞米松0.5mg.kg"靜脈注射也有明顯的抑制作用，參見表l。表l:甘露糖和地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠BALF中蛋白含量的影響.;土SD，動(dòng)物數(shù)=9.###p<0.001vs對(duì)照組/"p<0.01raLPS組組別劑量蛋白含量抑制％(mg■kg")(g,L")對(duì)照00.585±0.187LPS01.278±0.177#*#甘露糖+LPS31.305±0.1690101.154±0.2819.7300.962±0.286"24.71000.971±0.16124.0DXM+LPS0.50.846土0.137"33.83.對(duì)肺毛細(xì)血管通透性的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組肺毛細(xì)血管通透性明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組比較，伊文思藍(lán)滲出增加了3.64倍(尸O.OOl)。甘露糖1、3、10、30和100mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴減少伊文思藍(lán)滲出，地塞米松0.5mg'kg"靜脈注射也有明顯的抑制作用，其作用強(qiáng)度相當(dāng)于甘露糖1030mg.kg"，參見圖2(;±SD，動(dòng)物數(shù)=1012.###pO.001w對(duì)照組；"p<0.01,*"p<0.001wLPS組)。4.對(duì)BALF中MPO和0,—的含量的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組BALF中MPO水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異非常顯著(尸O.OOl)。甘露糖1、3、10、30和100mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴降低MPO水平，甘露糖30mg'kg'M乍用強(qiáng)度相當(dāng)于地塞米松0.5mg.kg"，參見表2。但是甘露糖對(duì)BALF中02"水平升高無(wú)明顯作用，見表2。表2:甘露糖和地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)BALF中MP0和02卜的含量的影響.；±SD，動(dòng)物數(shù)=710.##p<0.01，###p<0.001vs對(duì)照組；*p<0.05，**p<0.0ir*p<0.001wLPS組<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.對(duì)肺組織勻漿中細(xì)胞因子的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組肺組織勻漿中TNF-oc水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較增加了12.0倍(尸<0.001)。甘露糖1、3、10和30mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴降低TNF-a水平，3、10和30mgkg"組與LPS組比較有非常顯著的差異(P<0.050.01)，地塞米松0.5mgkg"靜脈注射也有明顯的抑制作用，甘露糖30mgkg"的作用強(qiáng)度接近與地塞米松0.5mg.kg"靜脈注射，參見圖3(;±SD,動(dòng)物數(shù)=710.#尸<0.05，##^P<0.001對(duì)照組；*尸<0.05，**P<0.01,***戶<0.01wLPS組)。給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組肺組織勻漿中的IL-10水平稍升高，甘露糖1、3、10和30mg'kg"，以及地塞米松0.5mg'kg"靜脈注射肺組織IL-10水平無(wú)明顯影響(P>0.05)。6.對(duì)肺水含量的影響小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組濕重/干重水平明顯升高(尸O.Ol)。甘露糖1、10和30mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴降低濕重/干重比值，DXM組、甘露糖1mgkg"組、甘露糖10mgkg—1組低于LPS組(p<0.05)，30mg'kg"組與LPS組比較有非常顯著的差異(P<0.01)，甘露糖30mgkg"作用強(qiáng)度相當(dāng)于地塞米松0.5mgkg—1靜脈注射，參見圖4(S±SD,動(dòng)物數(shù)=911;##p<0.01w對(duì)照組；*p<0.05,**p<0.01vsLPS組)。7.對(duì)肺組織變化的影響給小鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，組織切片觀察肺組織的病理變化，可見LPS組小鼠氣道管腔內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞聚集，肺組織間隙可見大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示明顯的炎癥和輕度的肺水腫現(xiàn)象(圖5顯示各組的代表性照片，HE染色，其中A:對(duì)照組，B:LPS組，C:甘露糖lmg/kg+LPS，D:甘露糖3mg/kg+LPS，E:甘露糖10mg/kg+LPS，F(xiàn):甘露糖30mg/kg+LPS，G:甘露糖100mg/kg+LPS，H:地塞米松0.5mg+LPS)。半定量積分法評(píng)估顯示，甘露糖1、3、10、30和lOOmg'kg"靜脈注射呈劑量依賴改善這些病理變化，與LPS組比較均有非常顯著的差異(尸O.OOl)見圖6和表3。甘露糖10和3011^.]^-1的作用強(qiáng)度相當(dāng)于地塞米松0.511^.1^-1。圖6中5士SD，動(dòng)物數(shù)=6，##、<0.01vs對(duì)照組,*"p<0.01wLPS組。表3甘露糖對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型肺組織病理檢查積分變化的影響.;±SD,動(dòng)物數(shù)=6,Utest:##:p<0.01w對(duì)照組，**:p<0.01，v;yLPS組.(ifu<1.96，p〉0.05;if1.96<u<2.58，p<0.05;elsep<0.01)組<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。目前炎癥學(xué)說(shuō)趨于主導(dǎo)地位。炎癥的早期階段為ALI，重度的ALI就是ARDS。炎癥可分為啟動(dòng)、放大和損傷三個(gè)階段。在啟動(dòng)階段，多種免疫與非免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子；在放大階段，效應(yīng)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞被激活、遷移、跨膜、滯留于肺臟等靶器官中；在損傷階段，滯留于肺內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞，釋放活性氧代謝產(chǎn)物和蛋白酶，引起耙細(xì)胞損害(PuneetP,MoochhalaS，BhatiaM.Chemokinesinacuterespiratorydistresssyndrome.爿m/P/z;yw'o/Ce//A/b/尸/j^z'o/,2005，288(1)丄3-15.)。此種炎癥瀑布過(guò)程是系統(tǒng)性和全身性的。效應(yīng)細(xì)胞和炎癥介質(zhì)兩種主要因素共同參與了肺損傷，在ARDS的發(fā)病中起了關(guān)鍵性的作用。這些炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)構(gòu)成了ALI/ARDS炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)"細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)"和"細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)"。它們通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控著機(jī)體的炎癥反應(yīng)(BhatiaM,MoochhalaS.Roleofinflammatorymediatorsinthepathophysiologyofacuterespiratorydistresssyndrome./PaZ/zo/,2004,202(2):145-56.)。敗血癥時(shí)的內(nèi)毒素(LPS)引起的損傷是引起ALI/ARDS的最主要原因。LPS由O-特異性多糖側(cè)鏈、核心寡聚糖和類脂A組成。類脂A是LPS的"毒力中心"，在生物活性中起關(guān)鍵作用。LPS與其靶細(xì)胞如單核/巨噬細(xì)胞上的Tol牌受體結(jié)合后釋放各種如TNF-a等前炎癥因子與抗炎癥介質(zhì)，TNF-a等其它細(xì)胞因子釋放后導(dǎo)致繼發(fā)性呼吸上皮細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生致使炎癥加重(StevenD,Freedman，DeborahWeinstein,etal.CharacterizationofLPS-inducedlunginflammationinq/r—miceandtheeffectofdocosahexaenoicacid./jp//2002,92(5):2169-76)。因此，LPS通常被用來(lái)復(fù)制與細(xì)菌感染有關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)以氣管內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生ALI。小鼠氣管內(nèi)滴入LPS(4mg'kg")6h后，測(cè)定肺組織勻漿中的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)TNF-a顯著升高，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞激活，大量進(jìn)入肺組織，在支氣管肺泡灌洗液(BALF)中可見白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯升高，病理切片觀察肺組織間隙可見大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，提示效應(yīng)細(xì)胞中性粒細(xì)胞被激活、遷移、跨膜、滯留于肺臟等靶器官中；BALF中的蛋白水平和MPO水平明顯升高，提示中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放活性氧代謝產(chǎn)物和蛋白酶，引起靶細(xì)胞損害，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管的通透性增加，在肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示有輕度的肺水腫現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用靜脈注射或緩慢靜脈恒速注射甘露糖的方法，避免了口服甘露糖造成藥物的首關(guān)消除效應(yīng)，且靜脈給藥可使藥物迅速而有效地進(jìn)入體循環(huán)，適合ALI患者疾病進(jìn)行性快，基礎(chǔ)狀況適于靜脈給藥(如ARDS患者大都需用低潮氣量機(jī)械通氣輔以藥物對(duì)癥治療)的特征。特別是緩慢靜脈恒速注射能維持恒定的血藥濃度，更好地模擬治療ALI/ARDS。本研究的結(jié)果顯示甘露糖1、3、10、30和100mg'kg"靜脈注射呈劑量依賴性減少LPS誘導(dǎo)的小鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，甘露糖1030mg'kg"作用強(qiáng)度相當(dāng)于DXM0.5mg'kg"靜脈注射的作用強(qiáng)度。甘露糖靜脈注射也能明顯減少BALF中的蛋白含量，減少伊文氏蘭滲出和肺泡間隙邊緣透明膜，提示甘露糖具有抗?jié)B出和改善肺水腫方面的作用。甘露糖1、3、10、30和100mgkg"靜脈注射呈劑量依賴性降低MPO水平，其抑制率分別為6.6、6.6、9.2、27.8和36.9%;DXM0.5mgkg—1的抑帝U率為25.1%，甘露糖30mg'kg"作用強(qiáng)度相當(dāng)于DXM0.5mg'kg"。但甘露糖對(duì)BALF中02"—水平升高無(wú)明顯作用。MPO是一種中性粒細(xì)胞大量釋放的蛋白酶，能激活未活化的氧化自由基，如把無(wú)毒的H202轉(zhuǎn)換成毒性很強(qiáng)的次氯酸、次溴酸和次碘酸，次氯酸與胺反應(yīng)產(chǎn)生作用很強(qiáng)的細(xì)胞和組織蛋白溶解物一氯胺，體內(nèi)過(guò)多的產(chǎn)生MPO會(huì)導(dǎo)致組織損傷、溶解和破壞(NathanC.Neutrophilsandimmunity:challengesandopportunities.Ato7m騰wo/，2006,6(3):173-82.)。LPS可誘導(dǎo)許多免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，引起一系列的前炎因子(pro-inflammatory)釋放，Vuichard(VuichardD,GanterMT，SchimmerRC,da/.Hypoxiaaggravateslipopolysaccharide-inducedlunginjury.C7/"￡xp/mmwwo/,2005，141(2):248-60)禾口Kono(KonoH,AsakawaM，F(xiàn)ujiiH,&a/.MatsumotoEdaravone,anovelfreeradicalscavenger,preventsliverinjuryandmortalityinratsadministeredendotoxin./_P/zanaco/￡xp7Tzer,2003，307(1):74-82.)以及Rojas(RojasM,WoodsCR,MoraALetal.Endotoxin-inducedlunginjuryinmice:structural,functional,andbiochemicalresponses.爿淤/尸/z少w'o/Ce〃A/b/尸/z;w'o/,2005，288(2):333-41.)等證明LPS氣道內(nèi)滴入后首先是LPS促進(jìn)單核吞噬細(xì)胞活化，導(dǎo)致釋放不同的細(xì)胞因子如TNF-a急速上升，2h內(nèi)可達(dá)到高峰，而TNF-a還可刺激LPS結(jié)合的Toll樣受體(如Tolllikereceptor2，TLR2)及下游的髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)表達(dá)的增高(OshikawaK,SugiyamaY.Geneexpressionoftoll-likereceptorsandassociatedmoleculesinducedbyinflammatorystimuliintheprimaryalveolarmacrophage.萬(wàn)z'oc/zew5z'o//2jasWasCcw2mww，2003,305(3):649-55.)，促"f吏TNF-a，IL-1P等炎癥因子的表達(dá)的增加，導(dǎo)致炎癥的放大。此外，TNF-a可誘導(dǎo)循環(huán)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移和浸入支氣管肺泡腔，TNF-a還能使中性粒細(xì)胞激活和脫顆粒，產(chǎn)生氧自由基，釋放顆粒酶，包括髓過(guò)氧化物酶(MatthayMA，ZimmermanGA.Acutelunginjuryandtheacuterespiratorydistresssyndrome:fourdecadesofinquiryintopathogenesisandrationalmanagement.Jies;/尸CW/Mo/5/o/，2005，33(4):319-27.)。TNF-aO.l嗎鼻腔內(nèi)滴入給藥能完全模擬出LPS引起的小鼠AL(CorbelM,GermainN，LanchouJa/.Theselectivephosphodiesterase4inhibitorRP73-401reducedmatrixmetalloproteinase9activityandtransforminggrowthfactor-betareleaseduringacutelunginjuryinmice:theroleofthebalancebetweenTumornecrosisfactor-alphaandinterleukin-10.JP/^附"co/E^77^,2002，301(1):258-65.)。所有這些反應(yīng)在我們建立的小鼠ALI模型中也可觀察到，表明TNF-a在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中扮演著一個(gè)重要角色。我們的結(jié)果顯示CP1、10和30mgkg"靜脈注射呈劑量依賴性降低TNF-a水平，并能抑制可能由TNF-a水平上升導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞聚集于支氣管肺泡，進(jìn)而使中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放出MPO和02卜，最后導(dǎo)致肺組織水腫和損傷的病理過(guò)程。IL-10由多種細(xì)胞合成和釋放，在免疫反應(yīng)過(guò)程中是一個(gè)重要的抗炎性細(xì)胞因子，能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上抑制前炎癥因子的合成與釋放。IL-10與TNF-a在ALI和ARDS病理生理過(guò)程中是一對(duì)重要的平衡性細(xì)胞因子(PestkaS，KrauseCD,SarkarDaa/.Interleukin-10andrelatedcytokinesandreceptors.Xwwmiev/mmw"o/,2004，22:929-79.)。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，IL-10抑制TNF-a、IL-l、IL-6、IL-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-la(macrophageinflammatoryprotein-la,MIP-la)等多種炎癥介質(zhì)的同時(shí)可上調(diào)IL-l受體拮抗劑(IL-lreceptorantagonist,IL-lRa)、可溶性TNF受體(solubleTNFreceptor)等抗炎物質(zhì)，有利于重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡(ArmstrongL,MillaAB.Relativeproductionoftumournecrosisfactoralphaandinterleukininadultrespiratorydistresssyndrome.Thorax,1997，52:442-6.)。盡管本實(shí)驗(yàn)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中未見IL-10水平明顯下降，但I(xiàn)L-10/TNF-a比值與正常組比較下降了近9倍，該比值可能在ALI過(guò)程中起了關(guān)鍵性作用。綜上結(jié)果表明，甘露糖能降低LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型的肺組織TNF-a水平升高，減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度，抑制毛細(xì)血管通透性，減少蛋白滲出及肺水含量，降低BALF上清的MPO水平，改善肺組織炎癥病理變化。這些結(jié)果提示甘露糖具有抗炎、抗氧化、減輕肺水腫等多方面作用。實(shí)施例2甘露糖對(duì)大鼠急性呼吸窘迫征模型保護(hù)作用本發(fā)明的甘露糖制備的藥物，以15mg/kg、45mg/kg、135和405mg/kg的劑量，并且以葡萄糖135mg/kg、半乳糖135mg/kg和果糖135mg/kg等其他單糖類作對(duì)照，經(jīng)靜脈給藥，防治內(nèi)毒素脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性呼吸窘迫征模型，結(jié)果顯示甘露糖能保護(hù)LPS誘導(dǎo)的動(dòng)脈氧分壓下降，動(dòng)脈二氧化碳分壓升高，肺血管通透性增加，肺水腫，肺內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集，細(xì)胞因子TNF-a上升，髓過(guò)氧化酶(MPO)水平升高，超氧歧化酶(SOD)水平下降。而葡萄糖135mg/kg、半乳糖135mg/kg和果糖135mg/kg等其他單糖類則無(wú)明顯療效。此外，我們還對(duì)甘露糖作了小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)。甘露糖5g/kg，分4次給小鼠靜脈注射(間隔6小時(shí))，觀察7天，未見小鼠有中毒和死亡現(xiàn)象，結(jié)果證明甘露糖為無(wú)毒級(jí)藥物。鑒于上述實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為該項(xiàng)研究成果能推廣到臨床應(yīng)用，為此我們希望對(duì)該項(xiàng)研究的知識(shí)產(chǎn)權(quán)能加以保護(hù)。實(shí)驗(yàn)材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性Sprague"Dawley品系大鼠(體重180-220g)，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SYXK(Zhe)20040052。所有的操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均自由進(jìn)食和進(jìn)水。2.主要試劑和儀器(1)月旨多糖(Esc/zeWc/7/"co//lipopolysaccharide，026:B6);甘露糖(D-mannose)，葡萄糖(D-glucose),半乳糖(D-galactose)，果糖(D-fructose)，地塞米松磷酸鈉(dexamethasone，DXM)。上述試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(SigmaChemicalCo"USA);(2)水合氯醛國(guó)產(chǎn)分析純制品；(3)烏拉坦國(guó)產(chǎn)分析純制品；(4)其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純制品；(5)大鼠TNF-otELISA測(cè)定試劑盒BioscienceCo.USA;(6)大鼠IL-10ELISA測(cè)定試劑盒BenderMedSystems(Vienna,Austria).(7)考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，髓過(guò)氧化酶測(cè)定試劑盒，抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒，上述試劑購(gòu)于南京建成生物工程公司。(8)酶標(biāo)儀型號(hào)ELX800UV，Bio-tekinstrumentINC，美國(guó)；(9)pH計(jì):MettlerToledo320PHMeter,瑞典；(10)顯微鏡BX51型，CH21型，Olympus公司，日本；(11)純水儀Labconco公司，美國(guó)；(12)冷凍離心機(jī)5804R型，eppendorf公司，德國(guó)；(13)AF10制冰機(jī)Scotman公司，意大利；(14)電子天平FA1104型，JY6001型，上海天平儀器廠；(15)精密天平AG245型，MettlerToledo公司，瑞典；(16)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9145型，上海一恒科技有限公司；(17)臺(tái)式恒溫振蕩器SHZ-88型，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；(18)低溫冰箱FormaScientific公司，美國(guó);(19)勻漿機(jī)寧波新科；(20)恒溫循環(huán)水浴槽Fisherscientific公司；(21)血?dú)夥治鰞xABL700，Radiometercorenhagen,丹麥。3.主要試劑的配制(1)LPS溶液精密稱取LPS，用生理鹽水配成濃度為5mg，ml"的溶液；充分混勻，4'C冰箱中保存。(2)甘露糖溶液現(xiàn)配現(xiàn)用實(shí)驗(yàn)以10ml/kg給藥體積量用生理鹽水配制1)15mg'kg"給藥組(即1.5mg.mr1)，2)45mg.kg"給藥組(即4.5mgml"),3)135mg'kg"給藥組(即13.5mg.mr1)，4)270mg.kg"給藥組(即27mg'mr1)，等不同濃度的給藥組溶液，低濃度藥液可由高濃度稀釋而成。(3)葡萄糖、半乳糖、果糖溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。135mgkg"給藥組(即13.5mgm1-1)，(4)烏拉坦用雙蒸水配成24%的濃度，以1.2gAg"麻醉大鼠；(5)PBS配方:、NaCl:8.00gKC1:0.20g>加水配至1L乂Na2HP04.12H20:3.49gKH2P04:0.20g4.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS組和甘露糖(15、45、135、270mg'kg")組和地塞米松(DXM，lmg'kg")等7組。以Ug'kg"劑量腹腔注射24%烏拉坦麻醉大鼠后，小心鈍性分離并暴露氣管，LPS氣管內(nèi)滴入5mg.kg"(10(Hil/100g)，對(duì)照組給予相同容積的生理鹽水，在誘導(dǎo)前10min開始以0.5ml，h"緩慢靜脈恒速注射生理鹽水、不同劑量甘露糖(15、45、135、270mgkg")、葡萄糖135mgkg"、半乳糖135mgkg"、果糖135mg.kg"及陽(yáng)性對(duì)照藥DXMlmg'kg"。5.血?dú)夥治鰷?zhǔn)備注射器用12001>ml"的肝素潤(rùn)洗，造模6h后打開腹腔，腹主動(dòng)脈采血約0.4ml后即刻塞入橡皮塞后，用血?dú)夥治鰞x(ABL700，Radiometercorenhagen，丹麥)測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓、二氧化碳、pH值、血漿碳酸氫根濃度、血紅蛋白氧飽和度、血氧總濃度、標(biāo)準(zhǔn)堿剩余、實(shí)際堿剩余、標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫鹽、血漿總二氧化碳濃度。6.支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)血?dú)夥治龊蠊蓜?dòng)脈放血3ml置試管用于血清分析，暴露氣管行氣管插管，結(jié)扎右肺，左肺用PBS液5ml分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，回收率達(dá)90%，冰浴保存BALF，將其混勻用細(xì)胞計(jì)數(shù)液稀釋后進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，剩余BALF用冰凍離心機(jī)(4°C)1500rpm離心10min，取細(xì)胞沉淀涂片，涼干后Wright染色，做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；留取上清液，儲(chǔ)存于-8(TC備用。取右中葉肺組織加入磷酸緩沖液(PBS)，用組織勻漿機(jī)把肺組織制成10%(w/v)的組織勻漿，4°C，10,000rpm離心15min，分裝吸取的上清至-80'C冰箱保存?zhèn)溆谩?.肺血管通透性指數(shù)的測(cè)定按文獻(xiàn)方法(ChialHJ.SplittgerberAG.AcomparisonofthebindingofCoomassiebrilliantbluetoproteinsatlowandneutralpH.AnalBiochem1993:213:362-9.)取血清，BALF和肺組織勻漿液，加入考馬斯亮藍(lán)，用分光光度計(jì)595nm測(cè)定蛋白含量。按文獻(xiàn)方法(HarkinDW,MarronCD,RotherRP，etal.complementinhibitionattenuatesshockandacutelunginjuryinanexperimentalmodelofrupturedabdominalaorticaneurysm.BrJSurg2005;92:1227-34)計(jì)算出肺血管通透性指數(shù)8.髓過(guò)氧化酶(MP0)、抗超氧陰離子自由基(02")和SOD的測(cè)定取-80。C保存的BALF上清和10°/。肺組織勻漿液，4°C，10,000rpm離心15min，取其上清液，用試劑盒測(cè)定其MPO、02"、SOD含量，測(cè)定方法參照廠商提供的使用說(shuō)明書。9.細(xì)胞因子的測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-10和TNF-a含量，具體操作方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書。10.肺水含量測(cè)定及肺組織學(xué)檢查右肺下葉稱肺濕重，并隨即置于6(TC烘箱烘烤48h后稱干重，右中葉肺液氮冷卻后儲(chǔ)存于-8(TC備用，右上葉用10%中性福爾馬林固定，制備石蠟切片，HE染色行肺組織學(xué)檢查。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用^±^表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用^檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用"檢驗(yàn)。戶O.05表示有顯著性差異，PO.01表示有非常顯著性差異。結(jié)果1.甘露糖對(duì)動(dòng)脈血?dú)夥治龅挠绊懘笫髿獾纼?nèi)滴入LPS6h后，LPS組動(dòng)脈血氧分壓與對(duì)照組比較明顯降低，參見圖7(;±SD，動(dòng)物數(shù)="=6~11，##p<0.01vs對(duì)照組ZpO.05vsLPS組，SpO.05vsDXM組)，動(dòng)脈血二氧化碳分壓明顯上升(見圖8)，甘露糖15、45、135和270mg.kg"靜脈恒速注射呈劑量依賴性增高動(dòng)脈血氧分壓，其中45、135和270mg'kg"組與LPS組相比有顯著性差異(P<0.05)，DXM無(wú)明顯作用，270mgkg"組與DXM組比較有明顯差異(見圖7)。對(duì)動(dòng)脈血二氧化碳分壓而言，甘露糖135和270mgkg"組與LPS組相比有顯著性差異(尸<0.05)，DXM也有明顯作用(PO.05)，參見圖8(;土SD，動(dòng)物數(shù)="=6~11，#、<0.01vs對(duì)照組ZpO.05wLPS組)。甘露糖及DXM對(duì)動(dòng)脈血pH值、血紅蛋白氧飽和度、血漿碳酸氫根濃度、血氧總濃度、標(biāo)準(zhǔn)堿剩余、實(shí)際堿剩余、標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫鹽、血漿總二氧化碳濃度等各組間無(wú)顯著性差異，數(shù)據(jù)未顯示。2.甘露糖對(duì)肺血管通透性指數(shù)的影響給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組的肺血管通透性指數(shù)與正常組比較明顯升高(PO.Ol)，甘露糖135和270mg.kg"靜脈注射與LPS組比較能明顯降低肺血管通透性指數(shù)，而葡萄糖135mg'kg"、半乳糖135mg.kg"、果糖135mgkg"和地塞米松1mgkg"靜脈注射與LPS組比較則無(wú)明顯降低作用，參見圖9(S士SD，動(dòng)物數(shù)="=8~9,#ttp<0.01w對(duì)照組Zp〈0.05wLPS組)。3.甘露糖對(duì)肺水含量的影響大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組濕重/干重比值明顯升高(尸O.Ol)。甘露糖135和270mgkg"靜脈注射與LPS組比較能明顯降低濕重/干重比值(尸<0.05)，DXM1mgkg"組也有明顯的作用(尸<0.05)。而葡萄糖135mg.kg"、半乳糖135mgkg"和果糖135mg.kg"靜脈注射與LPS組比較則無(wú)明顯降低作用(&0.05)，見圖10G±SD,動(dòng)物數(shù)="=8~9,共、<0.01vs對(duì)照組，*p<0.05wLPS組)。4.甘露糖對(duì)BALF中炎癥細(xì)胞聚集的影響給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)目迅速上升，與對(duì)照組比較分別增加了10倍左右(尸O.Ol)。甘露糖15、45、135和270mgkg"靜脈注射呈劑量依賴減少BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)目。地塞米松1mgkg"靜脈注射也顯示明顯的抗炎作用(PO.Ol)。而葡萄糖135mg.kg"、半乳糖135mg.kg"、和果糖135mg'kg"與LPS組比較則無(wú)明顯降低作用，見圖11(;士SD，動(dòng)物數(shù)="=8~9，#、<0.01w對(duì)照組；V〈0.05,"p0.01wLPS組)。5.甘露糖對(duì)大鼠肺組織勻漿和BALF中MPO和SOD的含量的影響給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組肺組織勻漿和BALF中MPO水平明顯升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(PO.05)，見圖12G±SD，動(dòng)物數(shù)="=8~9，#、<0.01vs對(duì)照組；*p<0.05vsLPS組)和圖13G±SD，動(dòng)物數(shù)=/1=8~9，#、<0.01vs對(duì)照組廣pO.05vsLPS組)；LPS組肺組織勻漿SOD水平明顯降低，與對(duì)照組比較有明顯差異(尸<0.05),見圖14G士SD，動(dòng)物數(shù)="=89,#>=:0.01vs對(duì)照組;、<0.05wLPS組)。甘露糖135和270mg.kg"靜脈注射與LPS組比較能明顯降低肺組織勻漿和BALF中MPO水平(/^0.05)，升高SOD水平(P0.05)，DXMlmg'kg"組也有明顯的作用(PO.05)。而葡萄糖135mgkg"、半乳糖135mg.kg"和果糖135mg.kg"靜脈注射與LPS組比較則無(wú)明顯降低MPO水平和升高SOD水平作用(P>0.05)。6.甘露糖對(duì)肺組織勻漿中細(xì)胞因子的影響給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組肺組織勻漿和BALF中TNF-a水平明顯升高，與對(duì)照組比較有非常顯著的差異倍(尸O.Ol)，見圖15(;±SD，動(dòng)物數(shù)="=8~9，#、<0.01vs對(duì)照組；*p<0.05，"p<0.01LPS組)。甘露糖135和270mgkg"靜脈注射與LPS組比較能明顯降低肺組織勻漿和BALF中TNF-ot水平(P<0.05)，DXM1mg'kg"組也有明顯作用(尸<0.05)。而葡萄糖135mg.kg"、半乳糖135mg'kg—1和果糖135mg.kg"靜脈注射與LPS組比較則無(wú)明顯降低TNF-ot水平作用(P>0.05)。給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，LPS組BALF中IL-10水平明顯升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(尸<0.05)，見圖16(;±SD，動(dòng)物數(shù)="=8~9,##p<0.01vs對(duì)照組；*p<0.05vsLPS組)。甘露糖270mgkg"和DXM1mg'kg"組靜脈注射分別降低了BALF中IL-10水平(P<0.05)，而甘露糖靜脈15、45、135mg.kg"靜脈注射，葡萄糖135mg.kg"、半乳糖135mgkg"和果糖135mgkg"靜脈注射對(duì)BALF中IL-10水平無(wú)明顯影響(P>0.05)。7.甘露糖對(duì)肺組織病理變化的影響給大鼠氣道內(nèi)滴入LPS6h后，肺組織切片觀察肺組織的病理變化，可見LPS組小鼠氣道管腔內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞聚集，肺組織間隙可見大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示明顯的炎癥和輕度的肺水腫現(xiàn)象(圖5顯示各組的代表性照片)。半定量積分法評(píng)估顯示，LPS組、甘露糖15、45、135、270和地塞米松lmg'kg"組的病理積分分別為4.6±0.3，3.8±0.4,2.5±0.4(尸<0.05)，1.9±0.3(尸O.Ol)和1.6±0.5(尸O.Ol)。甘露糖對(duì)肺組織病理變化作用的代表性照片參見圖17，其中A:對(duì)照組，B:LPS組，C:LPS組，D:甘露糖135mg/kg+LPS，E:葡萄糖135mg/kg+LPS，F(xiàn):半乳糖135mg/kg+LPS，G:果糖135mg/kg+LPS，H:地塞米松1mg/kg+LPS。8討論與小結(jié)呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是因急性肺水腫及炎癥導(dǎo)致急性呼吸衰竭的綜合征，其發(fā)生一般與肺炎、敗血癥、急性胰腺炎、藥物過(guò)量服用等有關(guān)，ARDS主要病理特征為肺微血管通透性增高而導(dǎo)致的肺泡滲出液中富含蛋白質(zhì)的肺水腫及透明膜形成，并伴有肺間質(zhì)纖維化。由肺內(nèi)炎癥細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)為主導(dǎo)的肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的肺泡毛細(xì)血管膜損傷是形成肺毛細(xì)血管通透性增高肺水腫的病理基礎(chǔ)。病理生理改變以肺順應(yīng)性降低，肺內(nèi)分流增加及通氣/血流比例失調(diào)為主。臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥、呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫，胸部X線顯示雙肺彌漫性浸潤(rùn)影，后期多并發(fā)多器官功能障礙，ARDS死亡率一直較高，現(xiàn)仍維持在30%-40%(PiantadosiCA，SchwartzDA.Theacuterespiratorydistresssyndrome.爿朋/"femMW，2004，141(6):460-70.)，到目前為止，仍然沒有治療ARDS的特效藥物，因此探索治療新靶點(diǎn)，尋找和開發(fā)ARDS治療新藥是研究者的目標(biāo)(MichaelA.M，GuyA.Z，CharlesE，etal.Futureresearchdirectionsinacutelunginjury.爿附CWYC臟M喊2003,167:1027-35)。在實(shí)施案例中，我們首次模擬臨床呼吸窘迫綜合征建立了大鼠的動(dòng)物模型，應(yīng)用該模型研究后發(fā)現(xiàn)甘露糖能保護(hù)LPS誘導(dǎo)的動(dòng)脈氧分壓下降，動(dòng)脈二氧化碳分壓升高，肺血管通透性增加，肺水腫，肺內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集，細(xì)胞因子TNF—oc上升，髓過(guò)氧化酶(MP0)水平升高，超氧歧化酶(SOD)水平下降。此外，我們還對(duì)甘露糖作了小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明甘露糖為無(wú)毒級(jí)藥物，甘露糖5g/kg，分4次給小鼠靜脈注射(間隔6小時(shí))，觀察7天，未見小鼠有中毒和死亡現(xiàn)象。實(shí)施例3甘露糖對(duì)嚴(yán)重急性呼吸器官綜合癥(SARS)的防治2002年11月中旬，我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)了病因不明的具有傳染性的非典型肺炎病例(簡(jiǎn)稱非典)。該病在香港以及許多個(gè)國(guó)家和地區(qū)很快流行，與該病患者有密切接觸史的所有人員幾乎都受到感染，以醫(yī)護(hù)人員的感染率為最高。因此立即引起了全世界各地民眾、政府和世界衛(wèi)生組織的高度重視，各國(guó)的科研人員也迅速地加入到對(duì)非典型肺炎的研究之中(趙喜榮，等.SARS的臨床及病理學(xué)研究進(jìn)展.中華醫(yī)院感染雜志2003，11(3):1092-94)。該病患者由于呼吸系統(tǒng)嚴(yán)重受損而產(chǎn)生急性呼吸窘迫，而且可通過(guò)呼吸道傳染，2003年3月初，世界衛(wèi)生組織(WHO)向全球發(fā)出警告，將該病命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)，并將此病列為一級(jí)傳染性疾病，該病的病原體已經(jīng)被WHO認(rèn)定為一種新型的冠狀病毒。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在SARS患者的尸檢肺部組織中)冠狀病毒不僅可見于感染的細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或空腔中也可見于細(xì)胞外，病毒的直徑在55-90nm之間。在尸檢SARS患者的肺部組織中可觀察到不同程度的進(jìn)行性病理變化，肺部組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)整個(gè)肺均有不同程度的彌漫性肺泡損傷，有的患者的肺泡內(nèi)還可見出血現(xiàn)象，在毛細(xì)支氣管中發(fā)現(xiàn)炎癥壞死碎片，進(jìn)行性肺炎和在肺泡中出現(xiàn)多核的融合細(xì)胞。有SARS患者的尸檢結(jié)果還發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)組織中存在明顯的病理改變。SARS早期由病毒侵襲產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)給SARS病人造成最嚴(yán)重的損傷病變是肺小動(dòng)脈炎癥(紀(jì)小龍，等.從SARS患者肺部病變的病理特點(diǎn)探討SARS的損傷機(jī)制.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志2003;23(5):321-24)。進(jìn)入第二周患者的病情進(jìn)行性加速，雙測(cè)肺很快出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、肺纖維化。實(shí)驗(yàn)證明肺小動(dòng)脈炎的直接后果是造成肺循環(huán)障礙，肺毛細(xì)血管個(gè)肺泡壁的雙重受損，肺泡上皮細(xì)胞脫落，造成急性的、彌漫性的肺泡炎癥、滲出和肺水腫，稱之為急性非心源性肺水腫。病人的氣體交換功能嚴(yán)重受損，造成低氧血癥，表現(xiàn)為急性呼吸窘迫征(趙曉琰.SARS的病理特征.微生物學(xué)和免疫學(xué)進(jìn)展.2003;31(4):88-90)。綜上病理變化，SARS的后期主要死因是急性肺損傷造成的呼吸衰竭。治療主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。如前所述，糖皮質(zhì)激素可能會(huì)加重患者的感染，并且可能延長(zhǎng)患者的預(yù)后。所以尋找新的抗炎藥物對(duì)SARS后期的治療至關(guān)重要。甘露糖在急性肺損傷和呼吸窘迫征動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證明了治療效果的前景，因此我們認(rèn)為甘露糖可用于治療SARS.實(shí)施例4甘露糖制劑甘露糖輸液制劑的制備甘露糖注射液(mannoseinjection)處方5%10%注射用甘露糖50g100g1%鹽酸適量適量注射用水加至1000ml1000ml制法按處方量將甘露糖投入煮沸的注射用水內(nèi)，使成50%60%的濃縮液，加鹽酸適量，同時(shí)加濃溶液量的0.1%(g/ml)的活性炭，混勻，加熱煮沸15min,乘熱濾過(guò)脫炭。濾液加注射用水稀釋至所需量，測(cè)定pH值及含量合格后，過(guò)濾，灌裝，封口，115°C30min熱壓滅菌。每瓶裝量250或500實(shí)施例5甘露糖噴霧制劑處方和制法同上每瓶裝量將上述制法所得5%或10%甘露糖制劑分裝入20ml氣霧瓶?jī)?nèi)。權(quán)利要求1.甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的甘露糖分子式C6H12O6，分子量180.16，密度1.539，構(gòu)型為D一甘露糖，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑、氣霧噴劑、滴劑或膠丸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物中的用途，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥、噴霧給藥或注射給藥。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備治療急性肺損傷藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備治療急性呼吸窘迫綜合征藥物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備治療嚴(yán)重急性呼吸器官綜合征藥物中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備治療其他原因引起的以肺部的炎癥細(xì)胞滲出和炎癥介質(zhì)大量釋放的炎癥性變化藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供甘露糖在制備治療肺部急性炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的甘露糖分子式C₆H₁₂O₆，構(gòu)型為D一甘露糖，本發(fā)明制備的藥物包括制劑允許的藥物賦形劑或載體。按制劑領(lǐng)域已知方法制成腸道或非腸道組合藥的劑型，制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、氣霧噴劑、滴劑或膠丸。本發(fā)明能降低LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型的肺組織TNF-α水平升高，減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度，抑制毛細(xì)血管通透性，減少蛋白滲出及肺水含量，降低BALF上清的MPO水平，改善肺組織炎癥病理變化。這些結(jié)果提示甘露糖具有抗炎、抗氧化、減輕肺水腫等多方面作用，可以在制備臨床治療急性肺損傷的藥物中應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P11/00GK101095688SQ20071006997公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者徐旋里,董新威,謝強(qiáng)敏,鄧楊梅申請(qǐng)人:浙江大學(xué)