專利名稱：具有預防及治療肝臟損害功能的丁酸梭菌,以及由其培養(yǎng)物制成的肝保護劑、食品和飼料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下列發(fā)明產(chǎn)物對肝病具有預防及治療作用的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，以培養(yǎng)該丁酸梭菌的培養(yǎng)液、將該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣或該殘渣的干燥物為有效成份的肝保護劑，以及由上述培養(yǎng)液等制成的食品和飼料。具體地說，本發(fā)明涉及對肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病以及中毒性肝損害具預防及治療作用的丁酸梭菌，以培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液、該培養(yǎng)液經(jīng)離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣或該殘渣的干燥物為有效成分，以治療及預防肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害為目的的肝保護劑，以及由上述培養(yǎng)液等制成的食品和飼料。
背景技術(shù)：
被稱作酪酸菌的丁酸梭菌是腸內(nèi)細菌的一種，與其他腸內(nèi)細菌一樣，是一種由體內(nèi)排泄到類便中仍然保持活性的菌。此外，丁酸梭菌(下文中同樣的情況下省略括號中的英文)經(jīng)酪酸發(fā)酵可由糖類生成大量的酪酸，因此也是一種被應用于工業(yè)性酪酸生產(chǎn)的有益菌。眾所周知，丁酸梭菌的培養(yǎng)液中可產(chǎn)生抗腐敗菌有效因子，因此一直以來，丁酸梭菌作為具有全腸道調(diào)理作用的活菌劑，被廣泛應用于以改善腹部癥狀為目的的醫(yī)藥品及飼料成分中。加之近年來在丁酸梭菌的某個菌株中發(fā)現(xiàn)了它的抗腫瘤作用，也有人提倡將其作為抗腫瘤免疫賦活劑來利用(特開平06-292597號)。
另一方面，肝臟是位于上腹部右側(cè)、橫隔膜直下方的暗褐色臟器，附屬于消化道，是人體中最大的腺體，約占總體重的1/45。此外，肝臟具有脂肪等物質(zhì)的代謝、解毒、膽汁排泄、各種營養(yǎng)物質(zhì)的貯存、造血及血液凝固、調(diào)節(jié)循環(huán)血液量等多種功能。因此，一旦肝臟發(fā)生病變，就會引起上述機能的低下，最糟糕的情況下，甚至會使生命的維系都陷入困境。肝臟就是一個如此重要的臟器。一般所提到的肝損害的原因，通常可以列舉從出由病毒引發(fā)的感染、毒物或藥物引起的中毒、飲酒和飲食過度、營養(yǎng)障礙以及循環(huán)障礙到應激反應等比較切身的原因，其原因多種多樣。除上述原因之外，近年來，為提高家畜的產(chǎn)量而大量使用的抗生素和營養(yǎng)補及品也會引起肝臟損害。遭受這種損害的肝臟可見肝腫大、邊緣鈍化、脂肪沉著(脂肪化)、淤血及膽汁淤滯，甚至于可見肝細胞的氣球樣變性、肝細胞的破壞和壞死等癥狀。這成為倦息、疲勞乏力感或成長期發(fā)育不良、特別是由抵抗力低下所引起的非特異性感染的原因。上述癥狀進一步進展，會發(fā)展為脂肪肝、肝炎及肝硬化，甚至于肝癌等嚴重的肝臟疾病，很多最終可能直至死亡。但是，盡管存在如此巨大的損害，由于肝臟具有很強的后備力，即便肝臟發(fā)生了一些損害，也難以表現(xiàn)出上述的種種癥狀。當出現(xiàn)疼痛等癥狀時，大多病變已經(jīng)進展到相當嚴重的地步，多數(shù)病例都錯過了早期發(fā)現(xiàn)。
對于這種肝臟損害的治療方法因引起損害的原因的不同而各異。如對于酒精性肝病，應中止酒精的攝入以消除病因；對于營養(yǎng)過剩引起的脂肪肝，應減少脂肪的攝入量或消除肥胖；對于病毒性肝炎，應給予抗病毒藥物等。雖然可以舉出的方法有很多，但是最佳治療方法仍未確立。尤其是對于由服用治療原發(fā)性疾病的藥物而引起的肝臟損害，以及進展性肝臟損害，雖然十分有必要對其進行治療，但是現(xiàn)在所公知的針對肝臟損害的治療藥物，卻具有反應劇烈、大量或長期服用產(chǎn)生副作用等缺點?；谝陨习踩缘目紤]，以現(xiàn)所公知的治療藥物作為保護肝臟的預防藥物使用，或者作為維持日常健康的健康食品來利用，這種狀況看似理所應當，實際上卻存在諸多的問題。
因此，基于上述背景，如果可以開發(fā)高效、安全的治療及預防肝臟損害的肝保護劑，進一步開發(fā)借助于這種肝保護劑的治療及預防肝臟損害的方法，更進一步，能夠把具有治療和預防肝臟損害的效果的物質(zhì)應用到食品或者飼料中，由此而獲得的利益將不可計數(shù)。
本發(fā)明鑒于上述諸多背景而完成，其目的在于獲取一種無嚴重副作用，具有有效預防及治療肝臟損害的作用，且安全性高的肝保護劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種無嚴重副作用，對肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害具有效預防及治療作用且安全性高的肝保護劑。
本發(fā)明進一步的目的在于提供一種有效預防及治療肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害的方法。
本發(fā)明更進一步的目的在于提供具有有效預防及治療肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害作用，且不伴有不良反應、易于食用的食品或飼料。
發(fā)明描述上述諸項目的，通過對肝臟損害有治療及預防作用的丁酸梭菌而實現(xiàn)。
本發(fā)明是保藏編號為FERM BP-5794的丁酸梭菌NIP1020株、保藏編號為FERM BP-5795的丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC 19398株，也就是前面所提到的丁酸梭菌。
本發(fā)明還包括保藏編號為FERM BP-5794的丁酸梭菌NIP1020株，也是前面所提到的丁酸梭菌。
上述諸項目的，還通過以含有丁酸梭菌培養(yǎng)液、或該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣、或該殘渣的干燥物等有效成份為特征的肝保護劑來實現(xiàn)。需要說明的是，在本說明書中，凡出現(xiàn)“肝保護劑”的字樣，均作“對肝臟損害具有預防和/或治療作用的制劑”之意使用。
本發(fā)明所指的丁酸梭菌，是指保藏編號為FERM BP-5794的丁酸梭菌NIP1020株、保藏編號為FERM BP-5795的丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC 19398株，也就是前面所說的肝保護劑。
本發(fā)明所指的丁酸梭菌還包括保藏編號為FERM BP-5794的丁酸梭菌NIP1020株，也是前面所說的肝保護劑。
本發(fā)明還包括以預防和/或治療脂肪肝、酒精性肝病和中毒性肝損害為目的而使用的前述肝保護劑。需要說明的是在本說明書中，凡出現(xiàn)“中毒性肝損害”的字樣時，均作“由醫(yī)藥品、毒物及化學物質(zhì)等引起的肝臟損害”之意使用。
上述諸項目的，還通過給肝臟損害患者服用前述的任意一種肝保護劑，由此治療及預防肝臟損害的方法來實現(xiàn)。
上述諸項目的，還通過將丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或該殘渣的干燥物按重量比10-6～1％加入的食品或飼料來實現(xiàn)。
本發(fā)明中的培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或該殘渣的干燥物(以下簡稱以“丁酸梭菌的培養(yǎng)物”，或者“培養(yǎng)物”)具有高效的改善肝臟損害及肝保護作用，并且對哺乳動物具高度安全性，因此在肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害的治療和/或預防中發(fā)揮很大的作用。
此外，本發(fā)明中的肝保護劑，由于含有上述的丁酸梭菌的培養(yǎng)物，并以之為有效成分，因此對肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害具有高效的治療和預防作用，并且是對哺乳動物具有高度安全性的制劑。
再者，本發(fā)明中的食品及飼料，由上述丁酸梭菌的培養(yǎng)物制成，在確保高度安全性的前提下加入到食品或飼料中，因此是安全而有效的、具有改善肝臟損害和肝保護作用的、并且可以方便食用的食品及飼料。發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的發(fā)明者們，為解決上述諸多的問題，對微生物的性質(zhì)及生產(chǎn)進行了深入細致的研究。首先找到肝臟疾病中所見的肝腫大、脂肪沉著、炎癥或膽汁淤滯等肝臟損害在動物身上發(fā)生的條件，并發(fā)現(xiàn)給這種動物模型服用培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或者該培養(yǎng)液離心分離所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或者該殘渣的干燥物，可以預防及治療肝臟損害，從而完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明中的肝保護劑，其特征在于含有培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或者該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或者該殘渣的干燥物，以之為有效成份。
作為本發(fā)明中所使用的丁酸梭菌，有丁酸梭菌NIP1019株、NIP1020株、NIP1021株及NIP1022株，以及丁酸梭菌ATCC 19398、ATCC 860株等等。雖然所有的丁酸梭菌均可使用，但其中優(yōu)選使用丁酸梭菌NIP1020株(以下有時簡稱以“NIP1020株”)、丁酸梭菌NIP1021株(以下有時簡稱為“NIP1021株”)和丁酸梭菌ATCC 19398株(以下有時簡稱為“ATCC株”)。此外，上述的丁酸梭菌NIP1021株與特公昭37-8300號中記載的丁酸梭菌宮入(ミセイリ)株相同，保藏編號為FERM BP-5795號，于平成9年1月23日保藏在日本國茨城縣筑波市東1條街1號3室的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所。
在此說明一下本發(fā)明中優(yōu)選使用的丁酸梭菌NIP1020株的細菌學性質(zhì)。(a)形態(tài)1)細胞形狀及大小直線型或曲線型兩端鈍圓的桿菌。大小為0.6～1.2μm×5～10μm。芽孢末端為在近末端處呈現(xiàn)卵圓形。2)有無運動性有3)有無孢子有(b)培養(yǎng)性質(zhì)1)含有1％淀粉的肉汁瓊脂平板培養(yǎng)圓形或不規(guī)則形菌落，呈乳白色凸狀隆起。菌落的大小為在37℃經(jīng)兩天培養(yǎng)，直徑約2～4mm。2)含有1％淀粉的肉汁液體培養(yǎng)酸及氣體顯示酸性。3)含有1％淀粉的肉汁明膠瓊脂平板培養(yǎng)未見明膠液化。4)石蕊牛乳培養(yǎng)基酸性、產(chǎn)氣、凝固。(c)生理學性質(zhì)1)草蘭氏染色 +2)硝酸鹽還原性-3)吲哚的生成 -4)淀粉加水分解+5)過氧化氫酶 -6)是否需氧厭氧性7)生長增殖范圍pH；5.0～8.0溫度；20～42℃8)能否從下列糖類生成酸纖維二糖+D-果糖 +D-半乳糖+乳糖+麥芽糖 +D-甘露糖+蜜二糖 +蜜三糖 +鼠李糖 -水楊苷 +D-山梨醇-
蔗糖+海藻糖 +D-木糖 +(d)其他生理學性質(zhì)1)溶血性 -2)卵磷脂酶-3)發(fā)酵產(chǎn)物酪酸、醋酸本菌依照《巴吉氏細菌學分類手冊》第9版(Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology 9th)進行分類，當歸屬于丁酸梭菌類。關(guān)于這種丁酸梭菌，正如下面實施例中所記載的，當研究其對肝臟損害的預防和治療效果時，可知其與公知的菌株(丁酸梭菌NIP1021株和丁酸梭菌ATCC 19398株)相比較，對肝臟損害的治療效果有顯著性提高。據(jù)此認為上述菌株為新的微生物，將其命名為丁酸梭菌NIP1020株，平成9年1月23日保藏在日本國茨城縣筑波市東1條街1號3室的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所，保藏編號為FERM BP-5794。
此外，丁酸梭菌作為活菌劑、飼料添加劑、甚至于食品在市場上大量銷售，人和家畜等哺乳動物長期服用未見任何副作用，保證了它的高度安全性。
本發(fā)明中的丁酸梭菌培養(yǎng)物，即“培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液、該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣、及該殘渣的干燥物”，可以按既知的微生物培養(yǎng)方法獲得。例如特愿平08-252088號所公開的方法。其實施方式如下所示將丁酸梭菌按105～106個/ml的量接種于由1.0(w/v)％蛋白胨、1.0(w/v)％酵母浸膏、1.0(w/v)％玉米淀粉及0.2(w/v)％碳酸鈣制成的培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃48小時靜置培養(yǎng)，即可得“丁酸梭菌培養(yǎng)液”；接下來，將所得的丁酸梭菌培養(yǎng)液離心(2000～6000g×10～30分鐘)，即可分離出“將培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣”；將該殘渣置于0～80℃，優(yōu)選10～20℃，通過1～24小時優(yōu)選5～18小時風干等進行干燥處理，或者置于0～80℃，優(yōu)選10～20℃、以0.05～500Torr，優(yōu)選1～100Torr，經(jīng)1～24小時，優(yōu)選2～15小時的減壓干燥處理，即可得“該殘渣的干燥物”。
本發(fā)明中培養(yǎng)丁酸梭菌所使用的培養(yǎng)基，依使用的菌株種類等不同而有所差異，但只要是含有可供所使用的丁酸梭菌生長所需的碳源、適量氮源、無機鹽及維生素類等其他營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，無論是合成培養(yǎng)基還是天然培養(yǎng)基都可以。
比如，本發(fā)明的培養(yǎng)基中所使用的碳源，只要是可使所選用菌株正常生長的碳源，其他并無特殊限制。作為碳源，雖不一定必須是糖，但考慮到菌體的增殖，最好使用細菌可以利用的糖或者含糖的物質(zhì)?？紤]到生長性可以使用的碳源具體有以下幾種纖維二糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、蜜三糖、水楊苷、淀粉、蔗糖、海藻糖、木糖、糊精及糖漿等。這些碳源當中，優(yōu)選使用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖及糖漿。將上述列舉的碳源結(jié)合所使用的丁酸梭菌進行考慮，選擇其中的1種或2種以上均可。此時碳源的添加濃度依所選用的丁酸梭菌和碳源的種類以及所使用培養(yǎng)基中除碳源外的其它培養(yǎng)基組分的不同而各異，但通常是0.5～5(w/v)％，優(yōu)選2～4(w/v)％。
作為氮源和維生素類，可以列舉如下肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、化學醬油等大豆和小麥的水解產(chǎn)物、大豆粉、乳酪素、酪蛋白水解產(chǎn)物、各種氨基酸、玉米浸泡液的濃縮液、其他的動物、植物、微生物的水解產(chǎn)物等有機氮化合物及硫酸銨等銨鹽。這些氮源中，優(yōu)選使用蛋白胨、酵母浸膏、肉浸膏、玉米浸泡液的濃縮液及化學醬油。為提高所選用丁酸梭菌的生長增殖，可從上述列舉的氮源中選取1種或2種以上。此時氮源的添加濃度，依所選用的菌株和氮源的種類以及所使用的培養(yǎng)基中除氮源以外其它培養(yǎng)基組分的不同而各異，在使用氮源含量較高的蛋白胨時，通常濃度為0.5～4(w/v)％，優(yōu)選1～3(w/v)％。當使用氮源及維生素類含量較高的醬油或玉米浸泡液的濃縮液時，通常為0.5～5(w/v)％，優(yōu)選1～4(w/v)％。而且當使用維生素含量較高的酵母浸膏或肉浸膏時，通常濃度為0.5～4(w/v)％，以1～3(w/v)％較為理想。
作為無機鹽，可從鎂、錳、鈣、鈉、鉀、鉬、鍶、硼、銅、鐵、錫和鋅等的磷酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、酪酸鹽、丙酸鹽及醋酸鹽等中選用1種或者2種以上。此外，根據(jù)需要，培養(yǎng)基中還可適當添加消泡劑、植物油、表面活性劑、血液或血液成分、維生素類、抗生素等藥物、植物和動物激素等等生理活性物質(zhì)。
本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)條件，因本發(fā)明中所選用的丁酸梭菌的生殖范圍(pH值和溫度等)等生理學的性質(zhì)而異，但由于丁酸梭菌為專性厭氧性，因此必須在密閉，或通以氮氣或二氧化碳，或在培養(yǎng)基中加入還原劑以使氧化還原電位下降等所造成的厭氧條件下培養(yǎng)。此時的培養(yǎng)條件需據(jù)選用菌株的生長增殖范圍、培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)方法等進行適宜選擇，只要是可使本菌株增殖的條件，并無其他特殊限制。具體地講，培養(yǎng)溫度為20～40℃，優(yōu)選35～40℃。
此外，本發(fā)明丁酸梭菌的培養(yǎng)過程中，用堿中和培養(yǎng)中產(chǎn)生的酸可促進細菌的生長，因此，最好預先在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣。此時碳酸鈣的添加量為0.1～4(w/v)％，優(yōu)選0.2～2.5(w/v)％。另外在上述中和反應過程中，最好使用氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀和碳酸鉀等堿性溶液，使培養(yǎng)基的pH值控制在設定的pH值范圍內(nèi)進行反應。當使用堿性溶液時，所謂“設定的pH值”，是指培養(yǎng)期間預先設定的培養(yǎng)基的pH值；“設定的pH范圍”，是指培養(yǎng)期間所容許的pH范圍，一般用設定pH值±容許差表示。據(jù)本發(fā)明，設定的pH值通常為5.0～7.5，優(yōu)選5.5～6.5；設定的pH范圍，為設定pH±0.5，優(yōu)選設定pH±0.2。
本發(fā)明中進行培養(yǎng)期間的pH值，在細菌接種時為近中性，優(yōu)選6.5～7.5。在使用堿性溶液的情況下，為不使氧氣混入，最好邊緩慢攪拌邊維持設定pH范圍。如此控制住細菌接種和細菌增殖時的pH值，就可使細菌密度飛速增高。
在本發(fā)明的培養(yǎng)過程中，丁酸梭菌的初期培養(yǎng)濃度只要在丁酸梭菌的生長增殖范圍內(nèi)即可，并無特殊限制，與通常丁酸梭菌的培養(yǎng)中所使的濃度相同。具體地講，一般為104～107個/ml，優(yōu)選105～106個/ml。
由以上方法所得的丁酸梭菌的培養(yǎng)物，特別是丁酸梭菌NIP1020株的培養(yǎng)物，對于由于酒精攝入、有機溶劑、藥劑、病毒、應激反應、營養(yǎng)不足或營養(yǎng)過剩等因素引起的肝腫大、邊緣鈍化、脂肪沉積(脂肪化)、淤血及膽汁淤滯、特別是肝細胞的氣球樣變性、肝細胞的破壞和壞死等肝臟損害，尤其是脂肪肝、酒精性肝病和中毒性肝損害，具體良好的預防及治療效果。
本發(fā)明中的肝保護劑，可以直接以上述丁酸梭菌培養(yǎng)物形態(tài)，或者將上述丁酸梭菌培養(yǎng)物配合以制藥中允許的載體，以經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥的組成物的方式給予患者(家畜、家禽和人等哺乳動物，還包括魚類在內(nèi))。本劑經(jīng)口服用時，將上述丁酸梭菌培養(yǎng)物與適當?shù)奶砑觿┗旌?，比如乳糖、蔗糖、甘露糖、玉米淀粉、合成或天然樹脂、及結(jié)晶纖維素等賦形劑；淀粉、羧甲基纖維素和甲基纖維素等纖維素衍生物；阿拉伯糖膠、明膠、及聚乙烯吡咯烷酮等粘合劑；羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、淀粉、玉米淀粉、碳酸氫鈉及海藻酸鈉等崩解劑；滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉等潤滑劑；以及碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣及磷酸鈉等填充劑或稀釋劑。可制成片劑、散劑(粉末)、丸劑或顆粒劑等固體劑型。此外，經(jīng)口給藥的肝保護劑可也制成膠束劑的形式，此時所使用的膠束，可選用硬質(zhì)或者軟質(zhì)的明膠膠束。也可將這些固體制劑用羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸鹽、羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯、纖維素乙酸鄰苯二甲酸鹽和間丙烯酸酯共聚物等包衣材料，進行腸溶性包衣。此外，本發(fā)明中的丁酸梭菌培養(yǎng)物，可用純凈水等一般常用的非活性稀釋劑；或者三癸酸甘油酯、三醋酸甘油酯等甘油酯類；或者乙醇等醇類溶劑制成混懸液。根據(jù)需要，也可在此溶液中適當添加浸潤劑、乳化劑、助分散劑或表面活性劑、甜味劑、食用香精或芳香物質(zhì)等，以制成糖漿或者配劑等液體制劑。
另外，在本發(fā)明中的肝保護劑非經(jīng)口給藥的情況下，可將上述的丁酸梭菌培養(yǎng)物與純凈水、磷酸緩沖液等適當?shù)木彌_液、生理鹽水、林格溶液和洛克(tocke)溶液等生理性鹽類溶液、乙醇、丙二醇、甘油以及慣用的防腐劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑等適當混合，制成無菌水溶液或非水溶液、混懸液、脂質(zhì)體或乳劑，使之成為液體制劑。此時液體制劑的pH值最好在生理學范圍內(nèi)，優(yōu)選6～8范圍內(nèi)的pH值。此外，本發(fā)明中的肝保護劑，還可采用公知的方法，制成軟膏，洗劑或者霜劑等經(jīng)皮外用制劑。
另外，本發(fā)明中的肝保護劑，還可以使用由碳酸氫鈉、硼酸等配成的近中性或者pH值為3～7的緩沖液，根據(jù)需要，可加入防腐劑、穩(wěn)定劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑等，制成點眼劑型。
此外，本發(fā)明中的肝保護劑，還可以包埋入丸劑，或者使用明膠軟膠束等栓劑基質(zhì)制成栓劑給予患者。
主治醫(yī)師可從上述的各種給藥方式和給藥途徑中，選擇理想的給藥方式和給藥途徑。
本發(fā)明中的肝保護劑中所含丁酸梭菌培養(yǎng)物的濃度，因給藥方式，病變種類和危重程度以及用藥目的所決定的給藥量等因素的不同而各異，但一般相對于原料的總重量，菌體的重量約為0.1～50重量％，以1～10重量％的范圍內(nèi)較為優(yōu)選。尤其是本發(fā)明制劑經(jīng)口給藥的情況下，菌體重量占原料總重量的0.1～50重量％，最好是在1～10重量％的范圍內(nèi)；在非經(jīng)口給予的情況下，菌體重量占原料總重量的0.1～50重量％，最好是在1～10重量％的范圍內(nèi)。此時如果丁酸梭菌培養(yǎng)物的濃度超過了上述上限值，就無法得到均勻的給藥量，效果不理想；與之相對，如果丁酸梭菌培養(yǎng)物的濃度不滿上述下限值，就無法得到利用本發(fā)明所應當?shù)玫降牟∽兏纳菩Ч?，效果也不理想?br> 本發(fā)明中肝保護劑的用量，因患者年齡、體重及癥狀、用藥目的所決定的用藥方式和方法、治療效果及用藥時間等因素而不同，正確的用量應由醫(yī)師來決定。具體地講，在本發(fā)明中肝保護劑經(jīng)口給予的情況下，將丁酸梭菌培養(yǎng)液作為培養(yǎng)物使用時，通常用量為0.01～10ml/kg體重/次，最好是在0.1～2ml/kg體重/次的用量范圍內(nèi)。此外，以該培養(yǎng)液離心所得的菌體、提取物、精制物質(zhì)或其干燥物作為培養(yǎng)物使用時，通常用量為0.01mg～1g/kg體重/次，最好是在1mg～0.1g/kg體重/次的用量范圍內(nèi)。分別每日給藥1～6次，最好每日給藥1～3次。此時當1日給藥量較大的情況下，也可將每次用量分為幾個片劑等制劑分別級藥。在本發(fā)明中肝保護劑非經(jīng)口給予的情況下，將菌體重量進行換算，通常為0.01mg～1g/kg體重/次，最好在1mg～0.1g/kg體重/次的用量范圍內(nèi)，每日給藥1～6次，最好分1～3次給藥。
本發(fā)明的其他特征之一，是將培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或者該殘渣的干燥物，按10-6～1重量％的比例，最好是按10-6～0.1重量％比例混入的食品以及飼料。本發(fā)明中上述混入方式有兩種可將預先定量的培養(yǎng)物混入食品、飲用水或者飼料中；也可在攝取時將定量的培養(yǎng)物混入食品、飲用水或者飼料中。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)物的含量為10-6～1重量％。若不滿10-6重量％，將無法獲取理想的肝臟損害改善和保護效果；而超過1重量％，作為食品，又很可能會影響到味覺、風味和口感，效果也不理想。
與本發(fā)明相關(guān)的食品可舉例如下酸奶、乳酪等乳制品；魚糕、魚肉串、魚肉小芋丸子、油炸魚丸、海帶魚肉卷、氽魚肉丸子等水產(chǎn)糜制品；魚肉松等魚貝類加工品；紅腸、法式小香腸、肝醬等肉類加工食品；豆腐、烤豆腐、過油豆腐、油炸豆腐、摻菜油炸豆腐、豆腐渣、凍豆腐、豆腐皮等豆制品；(法式)濃湯等蔬菜加工品；土豆泥、葛粉、粉絲、魔芋、細粉條等薯類加工品；年糕、元宵、白米飯、面筋、米粉、通心粉、意大利細面條、掛面、蕎麥面、切面、中式面條、主食面包、面包干、夾心面包等谷類加工品；果醬等甜制品；黃油、人造奶油、蛋黃醬、調(diào)味品等油脂類食品；飴糖、糯米炒面甜點、酥脆餅干、烤年糕丁、蛋糕、羊羹、糯米豆餡點心、包子、豆餡年糕、江米團、米粉糕、巧克力、餅干、曲奇餅、多福餅、濾餅、餡餅、冰激淋、布丁、奶油夾心蛋卷、口香糖等點心類食品；豆腐、果凍、魔芋、凍粉和洋粉等凝膠狀食品；海帶、裙帶菜、紫菜、石花菜等海草類食品等。即包括通常所能食用的所有食品。
與本發(fā)明相關(guān)的飼料，包括豬、牛、綿羊、山羊等家畜；狗、貓、兔和田鼠等寵物；家禽以及魚類等通常所飼料動物的全部所用飼料。
以下對本發(fā)明中的丁酸梭菌NIP1020株、丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC19398株進行相關(guān)的毒性試驗，以確定其安全性將丁酸梭菌NIP1020株、丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC19398株分別以大約106個/ml的量接種于由1.0(w/v)％的蛋白胨、1.0(w/v)％的酵母浸膏、1.0(w/v)％的玉米淀粉及0.2(w/v)％碳酸鈣制成的培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃48小時靜置培養(yǎng)，將所得培養(yǎng)液離心(4,000g×20分鐘)分離菌體后，將菌體干燥處理(15℃，20Torr，經(jīng)12小時減壓處理)即可得到菌體干燥末。將該菌體干燥末以1∶105的重量比混合于小鼠飼料(東方酵母工業(yè)株式會社產(chǎn)生，產(chǎn)品名為MF)(以下簡稱為“小鼠飼料”)中，制成調(diào)制飼料。將4周齡的ddy系小鼠(雄性，體重17～20g)五只為一組事先飼料于同一鼠籠中，給予上述小鼠飼料飼養(yǎng)3天后，給予上述經(jīng)調(diào)制后的調(diào)制飼料飼養(yǎng)6個月。同時設“未給藥組”，即除以單純小鼠飼料代替調(diào)制飼料外，其他飼養(yǎng)條件均一致，作為比較對照。所有試驗組小鼠的攝食量均為3～8g/日/只。結(jié)果如下表1所示
表1

如表1所示，本發(fā)明中優(yōu)選使用的3個菌株，對小鼠體重及生存狀態(tài)的影響，均與未給藥組無差異，因此可以認為，上述3個菌株均具有安全性。
下面結(jié)合下述實施例對本發(fā)明進行更為具體的說明。需要指明的是，本發(fā)明并不局限于這些實施例。實施例1將丁酸梭菌NIP1020株、丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC19398株，分別以大約106個/ml的量接種于由1.0(w/v)％的蛋白胨，1.0(w/v)％的酵母浸膏、1.0(w/v)％的玉米淀粉及0.2(w/v)％的碳酸鈣制成的培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃48小時(靜置或者振蕩)培養(yǎng)。將所得培養(yǎng)液離心(4000g×20分鐘)分離出菌體后，將菌體經(jīng)干燥處理(15℃，20Torr，12小時減壓處理)，調(diào)制出各株菌體的干燥粉末。實施例2進行下述實驗，以觀察本發(fā)明中的菌株(NIP1020株、NIP1021株和ATCC株)對由乙醇所致肝臟損害的預防效果。
敘利亞倉鼠(體重100～160g，每組3只)除未給藥組(B組)每日2次強制以水0.6ml灌胃，同時使動物自由飲水外，其余各組(A、C、D、E及F組)均作如下處理3個月，以制成由乙醇引起的肝臟損害的動物模型每日2次強制以25(w/v)％乙醇水溶液0.6ml灌胃的同時，使動物自由飲取由5(w/v)％乙醇水溶液制成的飲水。此外，在本實驗期間，各動物組分別給予以下各種不同飼料飼養(yǎng)。
A組東方酵母工業(yè)株式會社生產(chǎn)，產(chǎn)品名為MF的倉鼠飼料(以下簡稱為“倉鼠飼料”)(陰性對照組)B組倉鼠(用)飼料(未處理組)C組倉鼠飼料每1kg加入實施例1中所調(diào)制的NIP1020株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(NIP1020株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
D組倉鼠飼料每1kg加入實施例1中所調(diào)制的NIP1021株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(NIP1020株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
E組倉鼠飼料每1kg加入實施例1中所調(diào)制的ATCC株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(ATCC株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
F組熊脫氧膽酸為現(xiàn)所公認的肝功能改善劑，以每1kg倉鼠飼料混入10mg熊脫氧膽酸的量加入熊脫氧膽酸的乙醇溶液(0.1mg/cc99、5％乙醇)，充分吸收后風干得到的調(diào)制飼料(熊脫氧膽酸給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
3個月的處理結(jié)束后，各處理組通過觸診以觀察其上腹部的腫塊，A組發(fā)現(xiàn)腫塊，B組和C組雖未發(fā)現(xiàn)上腹部腫塊，但D組、E組和F組卻發(fā)現(xiàn)了上腹部的輕度腫塊。各組的肝臟病理所見每100g體重的肝臟容積(ml/100g體重)、邊緣鈍化程度以及脂肪沉積的觀察結(jié)果如下表2所示
表2

由表2可知，本發(fā)明中的NIP1020株給予組(C組)、NIP1021株給予組(D組)及ATCC株給予組(E組)與陰性對照的A組相比較，均可顯著抑制肝臟腫大及脂肪沉積，而且其抑制效果與已知的肝功能改善劑熊脫氧膽酸相當或者更佳，由此提示本發(fā)明中的NIP1020株、NIP1021株及ATCC株培養(yǎng)物，對于乙醇所引起肝臟損害(酒精性肝病)具有有效的預防作用。此外，本實施例所使用的菌株中，特別是NIP1020株給予組(C組)抑制肝腫大、邊緣鈍化及脂肪沉著的效果甚至與未處理組(B組)完全相當，從而預示以本發(fā)明中的NIP1020株培養(yǎng)物為有效成份，含有這種有效成份的組合物很有可能成為酒精性肝病有效的預防藥物。實施例3進行下列實驗，以觀察本發(fā)明中的菌株(NIP1020株、NIP1021株和ATCC株)對四氯化碳引起的肝臟損害的預防效果。
敘利亞倉鼠(體重100～160g，每組4只)，除每周2次單獨給予石臘油0.2ml皮下注射，共計6個月的對照組(H組)外，其余各組(G、I、J、K和L組)的敘利亞倉鼠(100～160g，每組4只)均作如下處理6個月，以制成由四氧化碳引起的肝臟損害動物模型每周2次由皮下注射四氯化碳的石臘油混合液0.2ml，共計6個月。前4個月內(nèi)注射濃度為2.5mg/0.2ml，接下來1個月內(nèi)注射濃度為3.2mg/0.2ml，最后1個月內(nèi)注射濃度為4.0mg/0.2ml。此外本實驗期間，各動物組分別給予以下各種不同的飼料飼養(yǎng)。
G組倉鼠用飼料(陰性對照組)H組倉鼠用飼料(空白對照組)I組每kg倉鼠飼料加入實施例1中調(diào)制所得的NIP1020株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(NIP1020株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
J組每kg倉鼠用飼料加入實施例1中調(diào)制所得的NIP1021株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(NIP1021株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
K組每kg倉鼠飼料中加入實施例1中調(diào)制所得的ATCC株干燥粉末10mg，混合得到的調(diào)制飼料(ATCC株給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
L組現(xiàn)所公認的肝功能改善劑熊脫氧膽酸，以每1kg倉鼠飼料混入10mg的量，加入熊脫氧膽酸的乙醇溶液(0.1mg/cc 99.5％乙醇)、充分吸收后風干得到的調(diào)制飼料(熊脫氧膽酸給予組)。且試驗期間倉鼠的攝食量為每日5～30g左右。
6個月的處理結(jié)束后，觀察各處理組動物的肝臟病理所見(上腹部腫塊，邊緣鈍經(jīng)、肝臟白色化、脂肪沉積、膽汁淤滯及炎癥)，G組6個月后觸診可見上腹部腫塊，還確認出現(xiàn)邊緣鈍化、肝臟白色化、脂肪沉積、膽汁淤滯及炎癥表現(xiàn)，可以確認四氯化碳引起了明顯的肝臟損害。此外，I組和L組幾乎未見到上腹部腫塊，邊緣鈍化、肝臟白色化、脂肪沉積、膽汁淤滯及炎癥表現(xiàn)；但J組及K組可見上腹部輕微腫塊，邊緣鈍化現(xiàn)象也較多見。詳細結(jié)果如下表3所示
表3

由表3可知，本發(fā)明中的NIP1020株給予組(I組)、NIP1021株給予組(J組)和ATCC株給予組(K組)與陰性對照的G組相比較，均可顯著抑制肝臟腫大、邊緣鈍化、脂肪沉積、膽汁淤滯及炎癥，而且雖然NIP1021株組(J組)和ATCC株(K組)對肝腫大的抑制效果稍差，但整體上講其抑制效果卻與已知的肝功能改善劑熊脫氧膽酸相當或者更佳。由此提示本發(fā)明中的NIP1020株、NIP1021株及ATCC株的培養(yǎng)物，對于四氯化碳引起的肝臟損害(脂肪肝和中毒性肝損害)具有有效的預防作用。此外，本實施例所使用的菌株中，特別是NIP1020株給予組(I組)，與空白對照組(H組)和熊脫氧膽酸給予組(L組)相比較，幾乎可見同等的肝腫大、邊緣鈍化、脂肪沉著、膽汁淤滯及炎癥的抑制作用，從而預示以本發(fā)明中的NIP1020株培養(yǎng)物為有效成份，含有這種有效成份的組合物很有可能成為脂肪肝和中毒性肝損害的有效預防藥物。實施例4對實施例2和3中確認具有特別優(yōu)良的預防效果的NIP1020株進行下述實驗，以觀察其對由四氯化碳引起的肝臟損害的治療效果。
將敘利亞倉鼠(100～160g)進行與實施例2中相同的處理，以制成由四氯化碳引起的肝臟損害動物模型。給予6個月的四氯化碳后，將腹部出現(xiàn)腫塊的倉鼠分為兩組(每組4只)，一組單純給予倉鼠飼料飼養(yǎng)1個月(M組給予四氯化碳后的正常飼養(yǎng)組)；另一組給予每1kg倉鼠飼料加入實施例1中調(diào)制所得的NIP1020株干燥粉末10mg混合而成的調(diào)制飼料飼養(yǎng)1個月(N組給予四氯化碳后的NIP株給予組)。
此外，在上述實驗中，四氯化碳給予期間除以每1kg倉鼠飼料加入實施例1中調(diào)制所得的NIP1020株的干燥粉末10mg，混合成的調(diào)制飼料飼養(yǎng)外，其余重復相同的實驗，進行6個月的四氯化碳處理。將處理后的倉鼠分為2組(每組4只)；一組為O組，單純以倉鼠飼料飼養(yǎng)(NIP處理四氯化碳給予后的正常飼養(yǎng)組)；另一組以每kg倉鼠飼料加入實施例1調(diào)制所得的NIP1020株的干燥粉10mg，混合而成的調(diào)制飼料飼養(yǎng)(NIP處理四氯化碳給予后的NIP株給予組)。分別飼養(yǎng)1個月。
按預定時間結(jié)束飼養(yǎng)后，同實施例3，觀察肝臟的表現(xiàn)。結(jié)果如表4所示表4

由表4可知，M組與實施例3中G組的結(jié)果相比較，可見停止給予損傷肝臟的四氯化碳后，由其引起的肝臟損害癥狀繼續(xù)發(fā)展；但從N組的結(jié)果看，既便已由四氯化碳引起了肝臟損害之后，再給予本發(fā)明中的NIP1020株培養(yǎng)物，也可見到肝腫大、邊緣鈍化及膽汁淤滯等癥狀的減輕，從而提示給予NIP1020株培養(yǎng)物，既便對高度的肝臟損害也有效果。而且由表4 O組及P組的結(jié)果來看，若給予四氯化碳的同時給予含有NIP1020株培養(yǎng)物的飼料，那么既便在停止給予四氯化碳的同時停止NIP1020株培養(yǎng)物的攝取，M組與N組相比較肝臟也幾乎未遭到損害；特別是本實驗整個期間每日均給予NIP1020株培養(yǎng)物組(P組)，具有徹底的肝臟保護作用。因此，本發(fā)明中的NIP1020株培養(yǎng)物對于四氯化碳引起的肝臟損害(脂肪肝和中毒性肝損害)具有有效的治療作用，從而預示，以本發(fā)明中的NIP1020株培養(yǎng)物為有效成分，含有這種有效成分的組合物很有可能成為脂肪肝和中毒性肝損害的有效治療藥物。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明中的丁酸梭菌，是具有高度肝損害改善作用和肝保護作用的一種新的微生物。因此，與本發(fā)明相關(guān)的丁酸梭菌，特別是丁酸梭菌NIP1020株、丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC 19398株的培養(yǎng)物，在治療和/或預防肝臟損害的制劑以及健康食品及飼料中用途非常廣大。
此外，本發(fā)明中的肝保護劑，因含有上述丁酸梭菌的培養(yǎng)物，以之為有效成分，具有高度的肝臟損害預防作用以及肝臟損害治療作用，而且對哺乳動物具有高度安全性，因此在肝臟損害，特別是脂肪肝、酒精性肝病和中毒性肝損害的治療和/或預防中具有非常有效的使用價值。
再者，本發(fā)明中的食品及飼料，因由上述丁酸梭菌的培養(yǎng)物制成，在確保具有高度安全性和肝臟損害改善作用以及肝臟保護作用的前提下，混入公知的食品中，因此其優(yōu)點是不伴有不快感，可易于食用。
權(quán)利要求
1.對肝臟損害具有治療及預防效果的丁酸梭菌。
2.權(quán)利要求1中記載的丁酸梭菌，該丁酸梭菌為保藏編號FERMBP-5794的丁酸梭菌NIP1020株、保藏編號FERM BP-5795的丁酸梭菌NIP1021株及丁酸梭菌ATCC 19398株。
3.權(quán)利要求2中記載的丁酸梭菌，該丁酸梭菌為保藏編號FERMBP-5794的丁酸梭菌NIP1020株。
4.肝保護劑，其特征在于以培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或者該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或者該殘渣的干燥物為有效成分且含有這種有效成分。
5.權(quán)利要求4中記載的肝保護劑，該丁酸梭菌為保藏編號FERNBP-5794的丁酸梭菌NIP1020株、保藏編號FERM BP-5795的丁酸梭菌NIP1021株及ATCC 19398株。
6.權(quán)利要求5項中記載的肝保護劑，該丁酸梭菌為保藏編號FERMBP-5794的丁酸梭菌NIP1020株。
7.權(quán)利要求4至6中任意一項所記載的肝保護劑，用于預防或治療脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害。
8.對肝臟損害患者給予權(quán)利要求4至6中任意一項所記載的肝保護劑，治療或者預防肝臟損害的方法。
9.將培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)液，或者該培養(yǎng)液離心所得的含有丁酸梭菌的殘渣，或者該殘渣的干燥物，以10-6～1重量％的比例混入的食品或飼料。
全文摘要
本發(fā)明提供以對肝臟損害具有治療及預防效果的丁酸梭菌、培養(yǎng)該丁酸梭菌的培養(yǎng)液或者該培養(yǎng)液離心所得的含有該菌的殘渣或者該殘渣的干燥物為有效成分,并以含有上述物質(zhì)為特征的肝保護劑;借助于給肝臟損害患者服用該肝保護劑而實施的肝臟損害的治療及預防方法;以及含有丁酸梭菌培養(yǎng)物的食品和飼料。本發(fā)明中的肝保護劑,對于肝臟損害,特別是脂肪肝、酒精性肝病及中毒性肝損害具有有效的預防或使用效果。
文檔編號A61K35/66GK1246144SQ97181810
公開日2000年3月1日 申請日期1997年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月14日
發(fā)明者田口信洋 申請人:日寶化學株式會社