一種金鐵鎖不定根快速增殖培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物器官組織培養(yǎng)，特別是藥用植物不定根培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 金鐵鎖（卩8&11111108；[16116 1：1111；[(301(168?.0.￥1161：(].￥.￥11)為石竹科 (Caryophy Ilaceae)金鐵鎖屬(Psammosi Iene)單種屬多年生藥用草本植物，又名昆明沙參、 獨(dú)定子等。金鐵鎖根含皂苷成分，并含氨基酸、有機(jī)酸、三萜等，其根干燥后入藥，是云南白 藥、雪上一枝蒿、痛血康膠囊、金骨蓮膠囊等的主要成分。我國缺乏中藥資源有效保護(hù)措施， 野生資源瀕臨滅絕，以人工培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)可彌補(bǔ)植物資源的匱乏。金鐵鎖不定根的培 養(yǎng)主要受外植體、接種量、植物激素、蔗糖以及無機(jī)鹽等幾方面的影響。相關(guān)報(bào)道中，趙爽和 李景濱曾分別利用發(fā)根農(nóng)桿菌金鐵鎖獲得毛狀根，并研究金鐵鎖毛狀根的最優(yōu)培養(yǎng)條件。 但該技術(shù)需要較高技術(shù)和設(shè)備條件，尚有局限。（趙爽等.金鐵鎖毛狀根誘導(dǎo)的初步研究 [J].中藥材，2012,35(2) :176-179;李景濱等.金鐵鎖毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的建立[J]. 中國中藥雜志，2011，36(5): 547-551)。文獻(xiàn)："影響金鐵鎖毛狀根生長及皂苷積累的因 素"是以發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌株感染金鐵鎖莖段、葉片誘導(dǎo)出毛狀根，經(jīng)抗卡那霉素篩 選培養(yǎng)，獲得的毛狀根為不定根液體培養(yǎng)材料，分別接種5種添加了外源激素的液體培養(yǎng)基 中，以添加 NAA、IAA、IBA的1/2MS液體培養(yǎng)基對金鐵鎖不定根增殖較好，且發(fā)現(xiàn)增長率與皂 苷產(chǎn)量呈正相關(guān)。（田思迪等，時(shí)珍國醫(yī)國藥[】]，2012,23(4):824-826.)。另一文獻(xiàn)："不同 培養(yǎng)條件對金鐵鎖毛狀根生長的影響"（高帥，王洪峰，侯麗麗，等，廣東林業(yè)科技[J]， 2012，28(2): 16-21.)選擇1/2MS固體培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，以發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后的不定根 為材料進(jìn)行培養(yǎng)。
[0003] 糖是外植體生長發(fā)育形成碳架的元素，同時(shí)維持培養(yǎng)基的滲透壓。不同種類的糖， 分子結(jié)構(gòu)不同，其形式與濃度對不定根生長影響較為明顯。以上兩篇文獻(xiàn)認(rèn)為蔗糖作為培 養(yǎng)基的碳源，金鐵鎖毛狀根生物量積累最大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在建立一種金鐵鎖不定根快速增殖培養(yǎng)的方法，它包括由基本培養(yǎng)基及 其與不同種類激素組合構(gòu)成的培養(yǎng)基體系，以便于根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行生 產(chǎn)，從而降低生產(chǎn)成本，提高效率，為工廠化生產(chǎn)金鐵鎖不定根提供指導(dǎo)。
[0005] 本發(fā)明以下述方法實(shí)現(xiàn)： (1) 切取金鐵鎖無菌苗的頂芽接種于l/2MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA+ 0.3g/L活性 炭的生根培養(yǎng)基中，于60d后形成毛狀不定根叢； (2) 按塊狀方式切取擴(kuò)繁后的金鐵鎖不定根叢，接種于添加了激素和白砂糖的MS固體 基本培養(yǎng)基中，每瓶分裝25mL的培養(yǎng)基，每瓶接種4塊金鐵鎖不定根叢。
[0006] 進(jìn)一步，所述的培養(yǎng)基為以下之一種： (I)MS固體基本培養(yǎng)基與生長素的組合:MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L IBA; (2)MS固體基本培養(yǎng)基與細(xì)胞分裂素的組合:MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L KT; 以上（1)~(2)培養(yǎng)條件為：25±2°C，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1500~2000 lx，培養(yǎng) 時(shí)間40d。
[0007] 優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基為MS固體基本培養(yǎng)基與細(xì)胞分裂素的組合:MS+1.0 mg/L KTo
[0008] 進(jìn)一步，所述的培養(yǎng)基是:接種于所述的培養(yǎng)基的金鐵鎖不定根組織塊為0.05g/ 塊，該組織塊干重約合0.0056 ± 0.0004g/塊。
[0009] 本發(fā)明的顯著進(jìn)步在于： (1)本發(fā)明通過2種不同組成成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果認(rèn)為:除考慮所選材料的基因型不 同外，應(yīng)當(dāng)以MS固體培養(yǎng)基為金鐵鎖毛狀根的基本培養(yǎng)基，在該基本培養(yǎng)基下，即使不添加 激素其鮮重也可以達(dá)到較高數(shù)值，這與目前一般選擇1/2MS培養(yǎng)基不同。
[0010] (2)與現(xiàn)有技術(shù)取蔗糖和葡萄糖不同，本發(fā)明從不定根生長效果和生產(chǎn)成本考慮： 在MS培養(yǎng)基中加入30 g/L的白砂糖更適宜于金鐵鎖不定根的生長和生物量積累。在30 g/L 的白砂糖下，不添加激素其鮮重可達(dá)到5.088 g的較高數(shù)值，其干重為0.480g，也是較高數(shù) 值。它反映出：白砂糖作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充碳源，以30 g/L的用量，既能有效降低成本，又能獲 得較高的毛狀根產(chǎn)出。
[0011] (3)本發(fā)明在添加了30g/L白砂糖的MS基本培養(yǎng)基中附加1.0 mg/L IBA培養(yǎng)金鐵 鎖不定根，也可獲得較好的效果。
[0012] (4)評價(jià)金鐵鎖不定根生長情況的指標(biāo)包括鮮重、干重的生長量及干物率。其中， 干物率是指不定根的干重與鮮重的比值，它反映了不定根的凈得率。在添加了 30g/L白砂糖 的MS固體培養(yǎng)基上，本發(fā)明改變了金鐵鎖組織培養(yǎng)的植物激素，在添加1.0 mg/L KT的MS培 養(yǎng)基中不定根干重和干物率最高，且與其他處理差異顯著，KT更有利于金鐵鎖不定根的生 長。相對于現(xiàn)有文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，該MS+1.0 mg/L KT的固體培養(yǎng)基所獲得的金鐵鎖不定根的干 物率為11.96%，其鮮重為173.2 g.L-S干重為20.72 g.L-S干重是現(xiàn)有文獻(xiàn)的1.52倍。
【附圖說明】
[0013] 圖1為WPM基本培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0014] 圖2為MS基本培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0015] 圖3為MS+30 g/L白砂糖的培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0016] 圖4為MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0017] 圖5為MS+KT 1.0 mg/L培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0018] 圖6為MS+ NAA 0.5 mg/L +KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中不定根生長情況。
[0019]以上MS是指MS固體培養(yǎng)基，KT是指激動素，IBA是指3-吲哚丁酸，NAA是指α-萘乙 酸。
[0020]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。本發(fā)明包括但不限于實(shí)施例的內(nèi)容。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 1材料與方法 1.1材料 在無菌條件下，切取金鐵鎖無菌苗的頂芽接種于l/2MS+0.3mg/L IBA+O.lmg/L NAA+ 〇. 3g/L活性炭的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，于60天后，培養(yǎng)成毛狀不定根叢，備用。
[0022] 1.2 方法 接種時(shí)，按塊狀方式切取上述不定根叢進(jìn)行培養(yǎng)。
[0023] 1.2.1不同基本培養(yǎng)基對金鐵鎖不定根生物量的影響 切取金鐵鎖不定根組織塊，每塊約〇. 〇5g，干重約合0.0056 ± 0.0004g/塊，分別接種于 分別添加了30 g/L蔗糖的MS、1/2MS、WPM三種固體基本培養(yǎng)基中，每處理5瓶，每瓶分裝25mL 培養(yǎng)基，每瓶接種4塊，重復(fù)3次，于第40d時(shí)測定金鐵鎖不定根的鮮重、干重。培養(yǎng)條件為： 溫度25±2°C，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1500~2000 lx。下同。
[0024] 1.2.2不同濃度碳源種類對金鐵鎖不定根生物量的影響 切取金鐵鎖不定根組織塊，每塊約〇. 〇5g，干重約合0.0056 ± 0.0004g/塊，分別接種于 不同碳源的基本培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基分別加入濃度為20、30及40 g/L的白砂糖、蔗糖和葡萄 糖，試驗(yàn)共計(jì)9種處理，每處理5瓶，每瓶分裝25mL培養(yǎng)基，每瓶接4塊，重復(fù)3次，于第40 d時(shí) 測定金鐵鎖不定根的鮮重、干重。
[0025] 1.2.3不同濃度生長素對金鐵鎖不定根生物量的影響 基于1.2.1和1.2.2篩選得到的基本培養(yǎng)基和碳源，附加不同濃度的IBA和NAA作為附加 了生長素的培養(yǎng)基。
[0026] 切取金鐵鎖不定根組織塊，每塊約0.05g，其干重約合0.0056 ± 0.0004g/塊，分別 接種于附加了生長素的培養(yǎng)基上。試驗(yàn)共計(jì)9種培養(yǎng)基處理。每處理5瓶，每瓶分裝25mL培養(yǎng) 基，每瓶接4塊，重復(fù)數(shù)為3，于第40 d時(shí)測定金鐵鎖不定根的鮮重及干重。
[0027] 1.2.4不同濃度細(xì)胞分裂素對金鐵鎖不定根生物量的影響 基于1.2.1和1.2.2篩選得到的基本培養(yǎng)基和碳源，附加不同濃度的KT、6-BA和TDZ作為 附加了細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。
[0028] 切取金鐵鎖不定根組織塊，每塊約0.05g，其干重約合0.0056 ± 0.0004g/塊，分別 接種于附加了細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上。試驗(yàn)共計(jì)11種培養(yǎng)基處理，每處理5瓶，每瓶分裝 25mL培養(yǎng)基，每瓶接4塊，重復(fù)數(shù)為3，于第4