專利名稱：多肽過渡金屬鹽以及增強多肽抗hiv活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂多糖類，特別是對內(nèi)毒素具有較強的親和性的多肽的過渡金屬鹽，更具體的說，本發(fā)明涉及通過將該多肽制成過渡金屬鹽穩(wěn)定的高度的顯示出多肽所具有的抗病毒效果(例如抗HIV效果)的活性增強法以及以該多肽的過渡金屬鹽為活性成分用于抑制病毒特別是HIV的活動的制藥學(xué)組合物和制劑學(xué)組合物。
背景技術(shù)：
如下述文獻所述，匯報了以前從鱟分離對內(nèi)毒素具有親和性、抗菌性的2族多肽。
參見例如Shigenaga等，J.Biol.Chem.,265:21350～21354(1990)；Kawano等，J.Biol.Chem.,265:15365～15367(1990)；Muta等，J.Biochem.,108:261～266(1990)；特開平2-167230號公報；特開平2-152987號公報；特開平2-53799號公報；USP5068314(公告特許公報平2-500194)；Miyata等，J.Biochem.,106:663～668(1989)；Akaji等，Chem.Pharm.Bull.37:2661～2664(1989)；Tokunaga和Iwanaga,代謝，26:429～439(1989)；Shieh等，F(xiàn)EBSLett.,252:121～124(1989)；Nakamura等，J.Biol.Chem.,263:16709～16713(1989)。
一族(タキプレシン族)從日本產(chǎn)鱟Tachypleus屬分離出來鑒定為TachypleusⅠ、Ⅱ和Ⅲ。另一族(ポリフェムシン族)從美國產(chǎn)鱟Limulus polyphemus分離出來鑒定為polyphemusⅠ和Ⅱ。
另外發(fā)現(xiàn)Tachypleus、polyphemus兩族都在低濃度下抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的任何一種或白色假絲酵母(Candidaalbicans)類的真菌的發(fā)育，形成細菌脂多糖和復(fù)合體?！睸higenaga等，J.Biol.Chem.,265:21350～21354(1990)；Muta等，J.Biochem.,108:216～266(1990)〕。
另外，發(fā)現(xiàn)Tachypleus族的多肽對流感病毒、水皰性口內(nèi)炎病毒〔Murakami等，Chemotherapy,37:327～334(1991)〕或人類免疫缺陷病毒〔Morimoto等，Chemotherapy,37:206～211(1991)〕等病毒中有的種具有抑制作用。
一方面希望開發(fā)一種與高度分化的人的生存維持有關(guān)，對于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的后天性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的發(fā)病有預(yù)防或治療效果的藥劑。
本發(fā)明者已經(jīng)對這些內(nèi)毒素親和性多肽的結(jié)構(gòu)變換與抗人類免疫缺陷病毒(抗HIV)活性的關(guān)系進行了研究，發(fā)現(xiàn)鱟的多肽的共同結(jié)構(gòu)基本不同的一系列具有高的抗HIV活性的多肽群，并公開了以下文獻。〔Nakashima等，Antimicrob.Agents Chemother.,36:1249～1255(1992)；Masuda等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,189:845～850(1992)；Tamamura等，Chem.Pharm.Bull.,41:978～980(1993)；Tamamura等，Biochim.Biophys.Acta,1163:209～216(1993)；Masuda等，J.Pharmacobio.Dyn.,15:s-90(1992)；USP5571892(PCT國際公開公報WO92/04374號)；USP5449752(日本國特許公開公報特開平5-163298號公報)〕當(dāng)初以從鱟得來的多肽的基本結(jié)構(gòu)為模型，由于氨基酸16～18殘基構(gòu)成的多肽顯示出抗HIV病毒活性對其必要結(jié)構(gòu)進行了研究，根據(jù)其結(jié)果本發(fā)明者進一步提出了以最小必需結(jié)構(gòu)概念為中心的改進發(fā)明〔PCT國際公開公報WO95/10534號〕。
本發(fā)明者將基于上述發(fā)明以鱟的多肽作為基準物質(zhì)得到的具有抗HIV活性的先導(dǎo)化合物·多肽的結(jié)構(gòu)概念集約成下式〔Ⅰ〕123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被?；蛉〈虼被柞；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酰氨基)
X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的l個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈场?br> 正如已經(jīng)明確指出的一樣，具有上述式〔Ⅰ〕的結(jié)構(gòu)時顯示出高的抗HIV活性，而且即使對特定部位進行修飾活性也不會降低，可以通過對其進行修飾使具有基本結(jié)構(gòu)的多肽的物理化學(xué)性質(zhì)或治療用法在很寬的范圍內(nèi)選擇成為可能，例如增減親水性、親油性、選擇的在特定組織、臟器、細胞積聚或增減其在體內(nèi)的滯留時間的方法或劑型的展開。式〔Ⅰ〕所包含的多肽中，其自身具有較高的抗HIV活性的化合物如表1所示。
表1序號[Ⅰ] 123 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4(序列號1)12 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15(1) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號2)12 3 4 5 6(7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15(2) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys---------DLys-Pro--------Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(3) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號3)(4) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號4)(5) Ac-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Cly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號4)(6) Parm-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號5)(7) FTC-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號2)表1(續(xù))12 3 4 5 6(7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15(8)Myr-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列號2)(9)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-DLys-Pro-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(10) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Pro-DLys-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NH2

(12) FTC-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys---------DLys-Pro---------Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2

在本發(fā)明者對式〔Ⅰ〕表示的多肽表現(xiàn)出特異的抗HIV活性的理由進行研究的過程中，得知了該多肽和過渡金屬形成鹽可以保持多肽具有穩(wěn)定的較高的抗HIV活性的事實，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第1個目的是提供一種具有抗病毒活性的有特定結(jié)構(gòu)式的多肽的新的過渡金屬鹽，第2個目的是提供一種通過將該多肽制成過渡金屬鹽增強生理活性特別是抗HIV活性等抗病毒活性，并且作為治療劑在制劑學(xué)上具有穩(wěn)定的活性的方法和制劑學(xué)組合物。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及脂多糖，特別是對內(nèi)毒素具有很強的親和性的式〔Ⅰ〕所表示的多肽的過渡金屬鹽，進一步的說，本發(fā)明涉及通過將該多肽制成過渡金屬鹽穩(wěn)定的高度的顯示出多肽所具有的抗病毒效果(例如抗HIV效果)的活性增強法。
也就是說，本發(fā)明提供(1)多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽，該多肽過渡金屬鹽化合物是下式123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被?；蛉〈虼被柞；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酸酰氨基)X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，
Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示多肽化合物和過渡金屬形成的鹽。(2)如(1)的多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽的酸加成鹽，與過渡金屬形成的鹽是絡(luò)合物。(3)如(1)或(2)的多肽過渡金屬鹽化合物或多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽，過渡金屬是選自鐵族(Fe、Co、Ni)、銅族(Cu、Ag、Au)、鋅族(Zn、Cd、Hg)和錳族(Mn、Tc、Re)的過渡金屬。(4)顯示出下式123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被?；蛉〈虼被柞；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酰氨基)X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，
通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈乘硎镜亩嚯幕衔锟笻IV作用活性的方法，通過與過渡金屬形成鹽顯示出較高的抗HIV作用和穩(wěn)定的活性。(5)含有有效量的(1)所述的多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽以及制藥學(xué)載體的制藥學(xué)或制劑學(xué)組合物。(6)用于抑制病毒活動的(5)的組合物。(7)用于抑制患者體內(nèi)HIV活動的(5)的組合物。
上述取代N-a位的氫原子的?；梢允翘荚訑?shù)為2～18的酰基，具體的說例如乙?；?、丙?；?、丁?；?、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂?；?、肉豆蔻?；?、棕櫚酰基、硬脂?；?、煙酰基等。上述取代N-α位氫原子的取代硫代氨基甲酰基的取代基有熒光素、苯基、取代苯基(例如二甲氨基苯基偶氮苯基等)。
上述取代構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基上氫原子的ω-氨基?；梢允翘荚訑?shù)為2～6的ω-氨基?；唧w的說例如ω-氨基乙?；ⅵ?氨基丁?；?、ω-氨基己酰基等。
這里規(guī)定的多肽序列中，各標記是按照國際上承認的由三個字母表示的氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基。即各個標記表示下述氨基酸或取代的氨基酸的殘基。
Ala(丙氨酸)；Arg(精氨酸)；Cys(半胱氨酸)；Ile(異亮氨酸)；Gly(谷氨酸)；Leu(亮氨酸)；Ser(絲氨酸)；Met(甲硫氨酸)；Lys(賴氨酸)；Orn(鳥氨酸)；Phe(苯丙氨酸)；Pro(脯氨酸)；Trp(色氨酸)；Tyr(酪氨酸)；Val(纈氨酸)；DArg(D-精氨酸)；Dlys(D-賴氨酸)；DOrn(D-鳥氨酸)；Ac-Arg(N-α-乙酰基精氨酸)；FTC-Arg(N-a-熒光素硫代氨基甲?；彼?；Laur--Arg(N-α-月桂?；彼?；Myr-Arg(N-α-肉豆蔻?；彼?；Nicot-Arg(N-α-煙?；彼?；Oct-Arg(N-α-辛?；彼?；Parm-Arg(N-α-棕櫚?；彼?；Parm-Orn(N-α-棕櫚酰基鳥氨酸)；PTC-Arg(N-α-苯基硫代氨基甲酰基精氨酸)；ε-N-Ac-DLys(ε-N-ω-氨基乙酰基-D-賴氨酸)和ε-N-But-DLys(ε-N-ω-氨基丁?；?D-賴氨酸)。
本發(fā)明是基于上述觀點完成的，提供了一種多肽化合物的鹽，該多肽化合物的鹽是包含如下式〔Ⅰ〕123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被?；蛄蛉〈被柞；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酰氨基)X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈乘硎镜亩嚯幕衔锱c選自鐵族、銅族、鋅族和錳族的過渡金屬形成的鹽，過渡金屬鹽的形態(tài)是絡(luò)合物，其目的是提供一種能使具有較高抗HIV效果的式〔Ⅰ〕多肽化合物的活性穩(wěn)定的而且高度的顯示出來的鹽形成物和活性增強法。
下面對本發(fā)明的新的多肽過渡金屬鹽化合物進行詳細的說明。
多肽的制備本發(fā)明中如式〔Ⅰ〕所表示的多肽可以按照其本身公知的方法(例如Stewart&Young著，皮爾斯化學(xué)公司發(fā)行，羅克福德，伊利諾伊州(1984)“固相肽合成法”中記載的固相合成方法)制造。當(dāng)式〔Ⅰ〕中A1上的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α位氫原子被?；〈蔀镹-α-酰基氨基酸殘基或N-α-?；臍埢鶗r，使直鏈狀式〔Ⅰ〕的多肽與不溶性樹脂結(jié)合制備成多肽樹脂，使用縮合劑使該多肽樹脂與相當(dāng)于?；乃狒螋人徇M行反應(yīng)，將N末端的氨基酰基化，形成N-?；嚯臉渲缓笫共蝗苄詷渲桶被岬谋Ｗo基脫離，制得直鏈狀式〔Ⅰ〕的多肽。當(dāng)式〔Ⅰ〕中A1上的氨基末端N-α位氫原子被取代硫代氨基甲酰基取代成為N-α-取代硫代氨基甲?；被釟埢騈-α-取代硫代氨基甲?；臍埢鶗r，通過使上述多肽與取代異硫氰酸酯化合物在微堿性條件下進行反應(yīng)，可以得到本發(fā)明的N末端N-α取代硫代氨基甲?；嚯?。
得到的多肽14位氨基酸殘基的羧基末端是游離的(A4相當(dāng)于-OH)，也可以變換為酰胺基(A4相當(dāng)于-NH2)。
上述固相合成法中使用的各氨基酸如果沒有特別的說明都是L構(gòu)型，與構(gòu)成8位Y的脯氨酸成對的堿性氨基酸限定為D構(gòu)型。
至于其它的方法，本發(fā)明的多肽也可以按照重組DNA方法制得。也就是說，可以將形成線性的本發(fā)明多肽的堿基序列的多核苷酸克隆，利用已經(jīng)公知的技術(shù)制得該多肽。
參考例如Maniatis等，Molecular Cloning,A LaboratoryMannual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1991。
因此，得到的多肽可以按照多肽其本身公知的分離純化手段進行分離純化，例如提取、重結(jié)晶、各種色譜分離法(凝膠過濾、離子交換、分配、吸附、反相)、電泳、逆流分配等，采用反相高效液相色譜法最有效。
采用這些制法的具體實施例可以參見已經(jīng)公開的USP5571892(國際公開公報WO92/04374號)；USP5449752(特開平5-163298號公報)和國際公開公報WO95/10534號的說明書。
式〔Ⅰ〕所本身的多肽分子內(nèi)包含Cys殘基、Arg殘基、Lys殘基，通過觀察其立體結(jié)構(gòu)可以得知至少有1對Cys殘基或Arg殘基在立體結(jié)構(gòu)的同一側(cè)面形成-SH側(cè)鏈或胍基側(cè)鏈的構(gòu)型，該側(cè)鏈容易與過渡金屬形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。但是，通常由于該多肽氧化形成-S-S-構(gòu)型后更容易與過渡金屬形成絡(luò)合物，因此在形成絡(luò)合物時優(yōu)選預(yù)先以-SH(還原)型與過渡金屬形成鹽。
例如，可以通過在該還原型的醋酸鹽的中性水溶液中加入過渡金屬的鹽至少2當(dāng)量以上，優(yōu)選過渡金屬與有機酸或無機酸形成的水溶性鹽(例如醋酸鋅)，從而與過渡金屬形成鹽。
本發(fā)明式〔Ⅰ〕所表示的多肽過渡金屬鹽化合物具有非常強的堿性。
由于其強堿性的原因，通過與酸加成形成加成鹽。與藥學(xué)上可接受的酸例如無機酸(鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸等)；有機羧酸(醋酸、鹵代醋酸如三氟醋酸、丙酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、枸櫞酸、酒石酸、水楊酸等)；葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、抗壞血酸等酸性糖類；包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素類、海藻酸等硫酸多糖在內(nèi)的酸性多糖或有機磺酸(甲磺酸、對苯甲磺酸等)形成鹽。本發(fā)明上述式〔Ⅰ〕所表示的多肽的過渡金屬鹽可以將其與藥學(xué)上可接受的酸形成的加成鹽用于制藥學(xué)組合物。
式〔Ⅰ〕所表示的多肽的過渡金屬鹽化合物具有結(jié)合內(nèi)毒素的能力、抗菌活性及內(nèi)毒素感染血球溶血性。此外，本發(fā)明的多肽過渡金屬鹽化合物還具有非常高的抗病毒活性。作為實施方式，本發(fā)明的多肽過渡金屬鹽化合物具有抗HIV活性。
本發(fā)明涉及的藥劑特別是抗HIV劑是作為藥物組合物進行制備的，該藥物組合物含有作為有效成分的式〔Ⅰ〕所表示的多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽化合物與藥學(xué)上可接受的酸形成的加成鹽以及根據(jù)給藥方法和給藥方式可以選擇的藥學(xué)上可接受的載體。作為藥學(xué)上可接受的載體，例如Hank’s或Ringer’s溶液、生理鹽水、葡萄糖生理鹽水或其混合液以及已知的生理緩沖液肝素化枸櫞酸/枸櫞酸碳酸鈉鹽/葡萄糖溶液。另外，本發(fā)明的抗HIV劑，根據(jù)生物體內(nèi)病毒疾病或生物體表等的生物體外病毒感染部位的治療或消毒對象，可以經(jīng)口或非經(jīng)口給藥，根據(jù)其給藥方法選擇適當(dāng)?shù)乃幬镙d體，制成粉末、顆粒、注射液或口服液、片劑、栓劑、陰道栓劑、軟膏、霜劑、氣溶膠等制劑。
實施例下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作出更具體的說明，但本發(fā)明并不因此受到任何限定。
在下述實施例中說明了多肽(1)和多肽(2)的過渡金屬鹽的制造例和該多肽過渡金屬鹽的抗HIV活性檢測結(jié)果，以及已知的內(nèi)毒素親和性多肽的這些內(nèi)容。
實施例1多肽(1)鋅絡(luò)合物的制備下式所表示的多肽(1)按照USP5571892(PCT國際公開公報WO92/04374號)、USP5449752(日本特許公開公報特開平5-163298)記載的方法合成制備。123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)12 3 4 5 6 7 8 910Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-11 12 13 14 15Arg-Lys-Cys-Arg-NH2………(1)(序列號2)1.1多肽(1)的還原型的制備；將按照上述PCT國際公報等制得的多肽(1)醋酸鹽(10.2mg，3.37μmol)溶于純化水(0.5ml)中。在該溶液中加入相對于多肽(1)50倍當(dāng)量的二硫蘇糖醇(生化學(xué)工業(yè)(株)生產(chǎn))(26.0mg,169μmol)，通入氮氣，在氮氣流下，室溫條件下攪拌2小時。用HPLC追蹤該還原反應(yīng)進行的狀況，確認還原反應(yīng)進行完全。
將還原反應(yīng)結(jié)束后得到的該反應(yīng)溶液置于預(yù)先用25％醋酸水溶液平衡過的交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-25(細小的)(ファルマシァバィォテク(株))柱(2.5×70cm)中，用同樣的25％醋酸水溶液解脫，進行分級分離(1級分=224滴)。收集埃爾曼反應(yīng)〔G.L.Ellman,Arch.Biochem.Biophys.,82,70(1995)，硫醇基檢測法〕和熒光胺反應(yīng)〔A.M.Felix等，J.Chromatogr.,89,361(1974)，胺基的熒光檢測法〕為陽性的級分號為26和27的級分，將該級分溶液減壓濃縮，用10％醋酸水溶液稀釋后將該溶液冷凍干燥，得到目的產(chǎn)物多肽(1)還原型醋酸鹽。
產(chǎn)量6.8mg(收率67％)1.2對多肽(1)的還原型的分析；按照Liu等的方法〔T.-Y.Liu等，J.Biol.Chem.,251,1936(1976)〕，將由1.1得到的多肽(1)的還原型醋酸鹽置于含有0.2％色胺的4M甲磺酸中，在115℃條件下酸加水分解24小時。其氨基酸的組成與多肽(1)還原型的氨基酸組成很一致。
得到的多肽(1)的還原型醋酸鹽的比旋光度〔α〕20D為-26.0°(c=0.09,1M醋酸水溶液)。
而且，用在下述條件下的HPLC分析得到的多肽(1)的還原型醋酸鹽，出現(xiàn)單峰。
<HPLC分析條件和結(jié)果>
柱TSK gel ODS-120T(0.46×15cm)(東ソ-(株))+TSK gurd gel ODS-120T(0.32×1.5cm)(東ソ-(株))梯度溶出溶出液10％乙腈/0.1％三氟醋酸(A液)80％乙腈/0.1％三氟醋酸(B液)梯度條件梯度時間 B液濃度 A液濃度1.0分 0％ 10％29.4分42％ 39.4％35.0分100％80％溫度40℃流速0.8ml/分檢測220nm和280nm用量5μl(肽濃度1mg/ml)洗脫時間多肽(1)的還原型醋酸鹽19.27分多肽(1)的醋酸鹽18.24分1.3多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子的絡(luò)合物的制備；將1.1得到的多肽(1)還原型醋酸鹽溶于精制水或1M醋酸銨緩沖液(pH7.2)。
在該水溶液或緩沖液溶液中加入相當(dāng)于多肽(1)還原型的2當(dāng)量鋅(Ⅱ)離子的0.005M醋酸鋅水溶液。將最終的多肽濃度調(diào)整為5mg/ml，得到多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液。
1.4采用離子噴霧質(zhì)譜分析法對多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物進行的結(jié)構(gòu)確認；取出由1.3得到的多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的一部分，將該溶液作為結(jié)構(gòu)解析的檢測溶液，在下述條件下采用離子噴霧質(zhì)譜分析法進行結(jié)構(gòu)分析。
<離子噴霧質(zhì)譜分析條件>
裝置三重等級四重極型質(zhì)譜儀APⅢE型(Perkin-Elmer Sciex公司產(chǎn)品；寶酒造(株)處理)樣品注入使用Harvard Apparatus syringe infusion pump22(South Natick,MASS)，以5μl/分的流速注入噴嘴(ォリイフィス)電壓130V質(zhì)譜范圍等荷質(zhì)比(m/n)600-1800(分成0.5amu.的陽離子模型片段，平均30次掃描)所得數(shù)據(jù)的分析用Macspec3.22(Sciex)分析<離子噴霧質(zhì)譜分析結(jié)果>
分別觀察電荷狀態(tài)為2+和3+的荷質(zhì)比(m/z:1277.00及851.67)，其再構(gòu)成荷質(zhì)比(m/z:2552.48)與多肽(1)+Zn-4H的計算荷質(zhì)比(m/z:2552.40)非常一致。也就是說明還原多肽(1)和鋅(Ⅱ)離子形成了多肽∶Zn=1∶1的絡(luò)合物。<討論>
已經(jīng)報道過通過離子噴霧質(zhì)譜分析或電子噴霧質(zhì)譜分析可以鑒定出多肽或蛋白與金屬的絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。參照例如H.E.Witkowska等的糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合部位的鋅指結(jié)構(gòu)的分析〔J.Amer.Chem.Soc.,117,3319(1995)〕,T.W.Hutchens等的鋅指蛋白部位的銅配位結(jié)構(gòu)的分析〔FEBS Lett.,309,170(1992)〕以及關(guān)于離子噴霧質(zhì)譜分析法的梅田總論〔蛋白質(zhì)核酸酶，36,1665(1991)〕等。
在這次的試驗中也可以通過離子質(zhì)譜分析法鑒定出多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。
1.5通過對多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物進行紫外吸收光譜測定分析確認結(jié)構(gòu)；取出一部分1.1得到的多肽(1)還原型的水溶液和1.3得到的由多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液，以這樣的每種溶液作為結(jié)構(gòu)解析的檢測溶液，在下述條件下測定紫外吸收光譜及其差光譜，通過對之分析進行結(jié)構(gòu)分析。<紫外吸收光譜測定>
儀器紫外可見分光光度計Ubest-30(日本分光(株))測定波長200-340nm試樣將新制備的各檢測液裝入測定管中后，通入氮氣立即測定通常的紫外吸收光譜對照液蒸餾水檢測液多肽(1)還原型溶液及多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)形成的絡(luò)合物溶液紫外吸收差光譜對照液多肽(1)還原型溶液檢測液多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液<紫外吸收光譜測定結(jié)果>
通常的紫外吸收光譜多肽(1)還原型溶液在構(gòu)成多肽(1)的氨基酸中Trp的特征吸收250-300nm處有最大吸收峰。在278nm處有最大吸收峰且在280nm處有肩峰，這是由于Trp引起的特有的吸收。
多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液得到了250nm附近到200nm處在上述多肽(1)還原型溶液的吸收曲線的基礎(chǔ)上加寬的吸收曲線。為了使吸收波長更加明確，測定了下述差光譜。
紫外吸收差光譜得到了以215-235nm范圍為差吸收峰的差光譜。<得到的紫外吸收光譜的分析>
如上所述，如果在多肽(1)還原型溶液中加入鋅(Ⅱ)離子，可以觀察到以215-235nm為中心紫外吸收向?qū)捲黾印?br> 其觀察結(jié)果表明，如下述討論所述，在多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子的溶液中多肽(1)還原型的Cys中的SH基與鋅(Ⅱ)離子通過硫醇鹽配位鍵形成絡(luò)合物。<討論>
與重金屬解毒有關(guān)的蛋白、金屬硫蛋白已知如果其構(gòu)成Cys殘基的SH基與鎘(Ⅱ)、鋅(Ⅱ)、銅(Ⅰ,Ⅱ)、汞(Ⅱ)離子等通過硫醇配位鍵形成絡(luò)合物，脫金屬硫蛋白(SH)通過硫醇配位鍵結(jié)合金屬，則由于各金屬硫醇配位鍵在其特有的波長范圍內(nèi)紫外吸收有所增大。例如，與鋅(Ⅱ)離子形成的硫醇配位體時，以220-230nm范圍為中心紫外吸收向?qū)捲黾印矃⒁奐.H.R.Kagi和B.L.Vallee,J.Biol.Chem,236,2435(1961)；M.Vasak等，Biochemistry,20,2852(1981)；A.R.Thrower等，J.Biol.Chem,263,7037(1988)；J.H.R.Kagi等，Environmental Health Perspectives,54,93(1984)等〕。由于該鋅(Ⅱ)離子的硫醇配位鍵引起的向?qū)捲黾拥淖贤馕辗秶?220-230nm)與上述對多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子的溶液進行觀察得到的差光譜的增大波長范圍一致。
也就是說，在多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子的溶液中多肽(1)還原型的Cys的SH基與鋅(Ⅱ)離子形成了硫醇配位鍵。
1.6多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的抗HIV活性；取出一部分1.3得到的多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液，以該溶液作為抗HIV活性測定的檢測溶液，測定抗HIV活性。
實施例2多肽(2)鋅絡(luò)合物的制備下式所表示的多肽(2)按照PCT國際公開公報WO95/10534號記載的方法合成制備。123 4 567 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-(X)-Y-(Z)-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)1 2 3 4 5 6 (7) 8(9) 10 11Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-----DLys-Pro-----Tyr-Arg12 13 14 15-Lys-Cys-Arg-NH2………(2)2.1多肽(2)的還原型的制備；將按照上述PCT國際公報等制得的多肽(2)醋酸鹽(10.0mg,3.94μmol)溶于純化水(0.5ml)中。在該溶液中加入相對于多肽(2)53倍當(dāng)量的二硫蘇糖醇(生化學(xué)工業(yè)(株)生產(chǎn))(32.0mg，207.5μmol)，通入氮氣，在氮氣流下，室溫條件下攪拌2小時。
用HPLC追蹤該還原反應(yīng)進行的狀況，確認還原反應(yīng)進行完全。
將還原反應(yīng)結(jié)束后得到的該反應(yīng)溶液置于預(yù)先用25％醋酸水溶液平衡過的交聯(lián)葡聚糖G-25(細小的)(ファルマシァバィォテク(株))柱(2.5×70cm)中，用同樣的25％醋酸水溶液洗脫，進行分級分離(1級分=224滴)。收集埃爾曼反應(yīng)和熒光胺反應(yīng)為陽性的級分號為25-27的組分，將該級分溶液減壓濃縮，用10％醋酸水溶液稀釋后將該溶液冷凍干燥，得到目的產(chǎn)物多肽(1)還原型醋酸鹽。
產(chǎn)量9.8mg(收率98％)2.2對多肽(2)的還原型的分析；與1.2的多肽(1)的場合相同，按照Liu等的方法，將由2.1得到的多肽(2)的還原型醋酸鹽置于含有0.2％色胺的4M甲磺酸中，在115℃條件下酸加水分解24小時。其氨基酸的組成與多肽(2)還原型的氨基酸組成很一致。
得到的多肽(2)的還原型醋酸鹽的比旋光度〔α〕20D為-23.3°(c=0.04,1M醋酸水溶液)。
而且，在與1.2的多肽(1)的HPLC分析條件相同的條件下，HPLC分析得到的多肽(2)的還原型醋酸鹽，出現(xiàn)單峰。
<HPLC分析結(jié)果>
溶出時間多肽(2)的還原型醋酸鹽 16.14分多肽(2)的醋酸鹽15.87分2.3多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的制備；將2.1得到的多肽(2)還原型醋酸鹽溶于精制水或1M醋酸銨緩沖液(pH7.2)。
在該水溶液或緩沖液溶液中加入相當(dāng)于多肽(2)還原型的1當(dāng)量鋅(Ⅱ)離子的0.005M醋酸鋅水溶液。將最終的多肽濃度調(diào)整為5mg/ml，得到多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液。
2.4采用離子噴霧質(zhì)譜分析法對多肽(1)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物進行的結(jié)構(gòu)確認；取出由2.3得到的多肽(2)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液的一部分，將該溶液作為結(jié)構(gòu)解析的檢測溶液，在1.4的多肽(1)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的離子噴霧質(zhì)譜分析時相同的條件下采用離子噴霧質(zhì)譜分析法進行結(jié)構(gòu)分析。<離子噴霧質(zhì)譜分析結(jié)果>
分別觀察電荷狀態(tài)為2+和3+的荷質(zhì)比(m/z:1030.50及687.34)，其再構(gòu)成荷質(zhì)比(m/z:2059.98)與多肽(1)+Zn-4H的計算荷質(zhì)比(m/z:2059.83)非常一致。
也就是說明還原多肽(2)和鋅(Ⅱ)離子形成了多肽∶Zn=1∶1的絡(luò)合物。
2.5通過對多肽(2)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物進行紫外吸收光譜測定分析確認結(jié)構(gòu)；取出一部分2.1得到的多肽(2)還原型的水溶液和2.3得到的由多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液，以這樣的每種溶液作為結(jié)構(gòu)解析的檢測溶液，在與1.5的多肽(1)的場合相同的條件下測定紫外吸收光譜及其差光譜。<紫外吸收光譜測定>
通常的紫外吸收光譜對照液蒸餾水檢測液多肽(2)還原型溶液及多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)形成的絡(luò)合物溶液紫外吸收差光譜對照液多肽(2)還原型溶液檢測液多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液<紫外吸收光譜測定結(jié)果>
通常的紫外吸收光譜多肽(2)還原型溶液在構(gòu)成多肽(2)的氨基酸中Trp的特征吸收250-300nm處有最大吸收峰。在278nm處有最大吸收峰且在280nm處有肩峰，這是由于Trp引起的特有的吸收。
多肽(2)還原型和鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液得到了250nm附近到200nm處在上述多肽(2)還原型溶液的吸收曲線的基礎(chǔ)上稍稍加寬的吸收曲線。
紫外吸收差光譜得到了在215-235nm范圍有差吸收峰的差光譜。<得到的紫外吸收光譜的分析>
如上所述，如果在多肽(2)還原型溶液中加入鋅(Ⅱ)離子，可以觀察到以215-235nm為中心紫外吸收向?qū)捲黾印?br> 其觀察結(jié)果表明，如下述討論所述，在多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子的溶液中多肽(2)還原型的Cys中的SH基與鋅(Ⅱ)離子通過硫醇配位鍵(mercaptide bond)形成絡(luò)合物。2.6多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物的抗HIV活性；取出一部分2.3得到的多肽(2)還原型與鋅(Ⅱ)離子形成的絡(luò)合物溶液，以該溶液作為抗HIV活性測定的檢測溶液，測定抗HIV活性。實施例3對人類免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性按照以下方法進行實驗評價實施例1制得的多肽(1)鋅絡(luò)合物和實施例2制得的多肽(2)鋅絡(luò)合物對HIV的抗病毒活性。
將各種濃度的實驗物質(zhì)以及HIV感染MT-4細胞(2.5×104細胞/孔、感染多重度(MOI):0.001)感染之后加入到96孔的微滴定板上。在CO2恒溫箱中，在37℃條件下培養(yǎng)5天后，用MTT法〔Pauwels等，J.Virol.Methods 20,309～321(1988)〕測定存活細胞數(shù)?？共《净钚杂媚芤种?0％感染HIV的細胞死亡的濃度來表示。另一方面，為了知道實驗物質(zhì)對MT-4細胞的細胞毒性，與上述相同相同的條件下，將非病毒感染細胞與各種濃度的實驗物質(zhì)一起進行培養(yǎng)。細胞毒性用引起50％細胞障礙的實驗物質(zhì)的濃度表示(CC50:50％細胞毒濃度)來表示。另外，CC50與EC50的概略比(CC50/EC50)用有效比(SI)表示。
抗HIV活性測定結(jié)果與其它化合物的結(jié)果一同如表2所示。
表2.各種化合物的抗HIV活性化合物 CC50(μg/ml)EC50(μg/m SI(CC50/1) EC50)多肽(1) 41.35 0.0047 8928多肽(1)+Zn++(2eq) 38.66 0.008 4808多肽(1)的還原型 41.27 0.0052 8011〔多肽(1)/2eq Zn++〕絡(luò)合物 40.63 0.0013 30683多肽(2) 44.60 0.029 1565多肽(2)+Zn++(1eq) 38.93 0.033 1172多肽(2)的還原型 41.17 0.040 1034〔多肽(2)/1eq Zn++〕絡(luò)合物 54.63 0.014 4052Zn++(μM) 0.48 0.15 3葡聚糖硫酸 ＞10000.68＞1480AZT(μM)1.930.00111716序列表序列號1序列長度14序列類型氨基酸拓撲學(xué)線性序列類型肽序列的特征存在位置1其它信息Xaa表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；至少有2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基末端氨基酸殘基的N-α位氫原子被酰基或取代硫代氨基甲?；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基。存在位置2其它信息Xaa表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基。存在位置4其它信息Xaa表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基。存在位置5,6其它信息Xaa表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基。存在位置7其它信息Xaa表示在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位通過肽鍵結(jié)合了Phe、Trp或Tyr中的1個氨基酸的有2個氨基酸殘基的肽殘基。存在位置8其它信息Xaa表示Gly與Arg、Lys或Orn中的1個氨基酸殘基組成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro與選自D-Arg、D-Lys和D-Orn中的1個氨基酸殘基組成的有2個氨基酸殘基的肽殘基。存在位置9其它信息Xaa表示Cys通過肽鍵結(jié)合在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met、Phe、Trp和Tyr中的1個氨基酸殘基的次位形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基。存在位置7,8,9其它信息通過肽鍵結(jié)合的Xaa-Xaa-Xaa殘基可以分別與6位和10位的氨基酸殘基通過肽鍵結(jié)合起來，也可以由于7位的Xaa和9位Xaa同時缺失，8位的Xaa殘基分別與6位和10位的氨基酸殘基通過肽鍵直接結(jié)合，這時8位Xaa的構(gòu)成氨基酸D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈?。存在位置10其它信息Xaa表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基。存在位置11,12其它信息
Xaa表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基。存在位置14其它信息Xaa表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基。序列Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa15 10序列號2序列長度18序列類型氨基酸拓撲學(xué)線性序列類型肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg序列號3序列長度17序列類型氨基酸拓撲學(xué)線性序列類型肽序列Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Lys1 5 10 15Cys Arg序列號4序列長度18序列類型氨基酸拓撲學(xué)線性序列類型肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg序列號5序列長度18序列類型氨基酸拓撲學(xué)線性序列種類肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg
權(quán)利要求
1．多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽，該多肽過渡金屬鹽化合物是下式1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被酰基或取代硫代氨基甲?；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酰氨基)X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈乘硎径嚯幕衔锖瓦^渡金屬形成的鹽。
2．如權(quán)利要求1所述的多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽的酸加成鹽，其中權(quán)利要求1的過渡金屬鹽是絡(luò)合物鹽。
3．如權(quán)利要求1或2所述的多肽過渡金屬鹽化合物或多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽，其中過渡金屬是選自鐵族(Fe、Co、Ni)、銅族(Cu、Ag、Au)、鋅族(Zn、Cd、Hg)和錳族(Mn、Tc、Re)的過渡金屬。
4．使下式1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列號1)〔式中A1表示獨立的選自Lys、Arg和Orn的堿性氨基酸殘基；具有至少2個上述堿性氨基酸的肽殘基；上述堿性氨基酸殘基或上述肽殘基的氨基酸末端氨基酸殘基的N-α氫原子被?；蛉〈虼被柞；〈腘-α取代氨基酸殘基或N-α取代肽殘基，A2表示獨立的選自Phe、Trp和Tyr的氨基酸殘基，A3表示獨立的選自Arg、Lys和Orn的堿性氨基酸殘基，A4表示-OH(來源于羧基)或-NH2(來源于酸酰氨基)X表示A2的1個氨基酸通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1個氨基酸殘基的次位上的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Y表示Gly和A3的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，或Pro和選自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1個氨基酸殘基組合成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，Z表示Cys通過肽鍵連接在選自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1個氨基酸殘基的次位上形成的有2個氨基酸殘基的肽殘基，通過肽鍵連接的X-Y-Z殘基的6位和10位的各氨基酸殘基通過肽鍵連接起來，或者也可以由于XZ的同時缺失Y殘基的6位和10位的各殘基通過肽鍵連接起來，這時，構(gòu)成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的側(cè)鏈ω-氨基的氫原子也可以被ω-氨基?；〈乘硎镜亩嚯幕衔锟笻IV作用活性發(fā)揮出來的方法，通過與過渡金屬形成鹽而發(fā)揮出較高的抗HIV作用和穩(wěn)定的活性。
5．含有有效量的權(quán)利要求1所述的多肽過渡金屬鹽化合物或該多肽過渡金屬鹽化合物的酸加成鹽以及制藥學(xué)載體的制藥學(xué)或制劑學(xué)組合物。
6．權(quán)利要求5所述的組合物，用于抑制病毒活動。
7．權(quán)利要求5的組合物，用于抑制患者體內(nèi)HIV活動。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對人類免疫缺陷病毒(HIV)具有較高抗病毒作用的式[Ⅰ]所表示的多肽與過渡金屬的新的鹽化合物。這些多肽的過渡金屬鹽化合物通過形成絡(luò)合物以及通過與通常藥學(xué)上可接受的酸形成離子性鹽,穩(wěn)定的表現(xiàn)出高度的抗HIV活性。代表性的多肽過渡金屬鹽化合物如下式(1)所示的化合物。
文檔編號A61P31/18GK1233257SQ97198808
公開日1999年10月27日 申請日期1997年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月15日
發(fā)明者松本章義, 脅道典 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社