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      螺旋藻多肽的制備方法及其含有這些多肽的藥劑和應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:1067466閱讀:562來源:國知局
      專利名稱:螺旋藻多肽的制備方法及其含有這些多肽的藥劑和應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及螺旋藻多肽的制備方法及其制劑應(yīng)用,更具體地說,本發(fā)明涉及具有多種生理活性的螺旋藻多肽的其酸加成鹽及其復(fù)合物。本發(fā)明還涉及含有至少一種或多種螺旋藻多肽其酸加成鹽或其復(fù)合物作為活性成分,或可作藥用和保健品之用途。
      在螺旋藻中有著高含量的藻紅蛋白、藻蘭蛋白、變藻蘭蛋白、以及高含量膠原蛋白。總稱為藻蛋白。
      由于這些蛋白為肽化合物,因此通常在消化道分解,且由于它們是大分子量聚集態(tài)化合物。因此也難以從消化器官被充分吸收利用。
      本發(fā)明的目的就是提供對螺旋藻的藻蛋白進(jìn)行化學(xué)和生物酶解,制備出比原有藻蛋白更具有各種生理活性的多種小肽。這種生理活性肽又稱功能性肽,具有生理調(diào)節(jié)作用。
      本發(fā)明的另一個目的就是提供藻膽蛋白的多種小肽具有降血壓,降膽固醇,降血脂,抗腫瘤,預(yù)防心血管疾病作用,同時具有降血糖,防止肥胖等多種生理活性功能。
      本發(fā)明的目的之三就是提供一種藥用組合物,它含有至少一種或多種小肽作為活性成分。
      本發(fā)明人經(jīng)過深入研究達(dá)到了本發(fā)明的以上目的多種小肽具有多種生理活性作用,以滿足作為功能保健食品或藥物的要求。
      膽固醇是體內(nèi)必要生理物質(zhì)除作為細(xì)胞膜的成分外,在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為膽汁酸,類固醇激素和維生素D3。但膽固醇過多,積蓄在血管壁上,會使血管腔變窄,血流通過受阻,食物中的膽固醇進(jìn)入體內(nèi)后,需經(jīng)酶的作用后,變成膽固酸酯才能在腸道吸收,這一過程需要膽汁酸參與。膽汁酸是表面活性物,它對脂類有乳化作用。本發(fā)明小肽的活性基團(tuán)很容易和膽汁酸結(jié)合并排出體外,由于膽固醇周圍的膽汁酸消失,這種酶就無法使膽固醇轉(zhuǎn)變成容易被腸道吸收的膽固醇。那么為了保持膽汁酸的正常生理含量,人體就必須在肝臟中將膽固醇轉(zhuǎn)換成膽汁酸,其結(jié)果是使血液中的膽固醇含量必然下降,而起降脂,降膽固醇作用。
      原發(fā)性高血壓的治療原則是限制食鹽的攝取,可使約有60%的病人血壓下降。近幾年臨床試驗證明,血壓升高僅和食鹽中的氯離子有關(guān),而與鈉離子無關(guān),食鹽中的氯離子能使血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活化,該酶催化血管緊張素I轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素II,血管緊張素II能促進(jìn)醛固酮分泌,使體內(nèi)保留鈉和水,以致血容量增加,血壓升高。本發(fā)明的藻蛋白的小肽能與氯離子相作用,而共同排泄于糞便中,使體內(nèi)缺少氯離子,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶無活性,血管緊張素II減少,從而使血壓不再升高,起到調(diào)節(jié)血管作用。
      藻蛋白經(jīng)化學(xué)和酶法處理,制得多種小肽的分子中富含氨基,具有堿性。在與胃酸的反應(yīng)中可生成銨鹽,可使腸內(nèi)pH向堿性側(cè)位移,改善酸性體質(zhì)。由于胰蛋白不足會引起糖尿病,其患者體液呈酸性。由于這種螺旋藻小肽把pH調(diào)節(jié)到弱酸性,就能提高胰島素的利用率,有利于糖尿病的防治。此外,它還有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的功能,使胰島素分泌正常,抑制血糖上升。這種螺旋藻小肽還可排出體內(nèi)多余糖分,防止肥胖,有利于防止糖尿病。
      藻蛋白中的藻紅蛋白(R-phycoerythrin)具有(βa)6γ的亞基組成,其最穩(wěn)定的聚集態(tài)分子量是263,000。其藻蘭蛋白(C-phycocyanin)具有(βa)6亞基組成,該最穩(wěn)定的聚集態(tài)分子量為224,000。其變藻蘭蛋白(allophycicyanin)具有(βa)3的亞基組成,其最穩(wěn)定的聚集態(tài)分子量為104,000。a亞基多肽具有如下完整的162個氨基酸順序10-Mel-Lys-Thr-Pro-Ile-Thr-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Ala20-Asp-Asn-Gln-Gly-Arg-Phe-Leu-Ser-Asn-Thr-Glu-Leu30-Gln-Ala-Val-Asn-Gjy-Arg-Tyr-Gln-Arg-Ala-Ala-Ala40-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Arg-Ser-Leu-Thr-Ser-Asn-Ala50 60-Glu-Arg-Leu-Ile-Asn-Gly-Ala-Ala-Gln-Ala-Val-Tyr70-Ser-Lys-Phe-Pro-Tyr-Thy-Ser-Gln-Met-Pro-Gly-pro80-Gln-Tyr-Ala-Ser-Ser-Ala-Val-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys90-Ala-Arg-Asp-Ile-Gly-Tyr-Tyr-Leu-Arg-Met-Vai-Thr100-Thr-Cys-Leu-Val-Val-Gly-Gly-Thr-Gly-Pro-Met-Asp110 120-Gly-Tyr-Leu-Ile-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Ile-Asn-Arg130-Thr-Phe-Asp-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Tyr-Val-Glu-Ala140-Leu-Asn-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-His-Gly-Len-Ser-Gly150-Gln-Ala-Ala-Asn-Glu-Ala-Asn-Thr-Tyr-Ile-Asp-Tyr160-Ala-Ile-Asn-Ala-Leu-Serβ亞基多肽具有如下完整的172個氨基酸順序10-Met-Leu-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys-Val-Val-Ala-Gln-Ala20-Asp-Ala-Arg-Gly-Glu-Phe-Leu-Ser-Asn-Thr-Gln-Leu30-Asp-Ala-Leu-Ser-Lys-Met-Val-Ser-Glu-Gly-Asn-Lys40-Arg-Leu-Asp-Val-Val-Asn-Arg-Ile-Thr-Ser-Asn-Ala50 60-Ser-Ala-Ile-Val-Thr-Asn-Ala-Ala-Arg-Ala-Leu-Phe70-Ser-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Ile-Gln-Pro-Gly-Gly-Thr80-Ala-Tyr-Thr-Asn-Arg-Arg-Met-Ala-Ala-Cys-Len-Arg90-Asp-Met-Glu-Ile-Ile-Leu-Arg-Tyr-Val-Ser-Tyr-Ala100-Ile-Ile-Ala-Gly-Asp-Ser-Ser-Ile-Leu-Asp-Asp-Arg110 120-Cys-Len-Asn-Gly-Len-Arg-Glu-Thr-Tyr-Gln-Ala-Leu130-Gly-Val-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Ala-Val-Gly-Ile-Glu140-Lys-Met-Lys-Asp-Ser-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Asn-Asp150-Pro-Ser-Gly-Ile-Thr-Thr-Gly-Asp-Cys-Ser-Ala-Len160-Met-Ala-Glu-Val-Gly-Thr-Tyr-Phe-Asp-Arg-Ala-Ala170-Thr-Ala-Val-Glnγ亞基不含有酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro),它的亞基多肽的氨基酸順序至今還未完全清楚。
      在本說明中,氨基酸,多肽及活性基團(tuán)等均按國際生物化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的規(guī)則以縮寫或代號的形式表示。這些縮寫或代號的例子如下Arg精氨酸Ala丙氨酸Asn天冬酰氨Asp天冬氨酸Cys半胱氨酸 Gln谷氨酰胺 Glu谷氨酸 Gly甘氨酸His組氨酸Ile異亮氨酸 Leu亮氨酸 Lys賴氨酸Met蛋氨酸Phe苯丙氨酸 Pro脯氨酸 Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸 Val纈氨酸本發(fā)明采用從動物、植物、微生物和基因重組微生物中獲得的水解蛋白酶,在酸性,堿性或中性環(huán)境中或借助于鈣、鎂、磷、硒、鋅、錳離子參與的條件下,水解溫度在20~80℃,最佳溫度在30~60℃,采用的水解酶有以下來源如胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶等植物來源木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶,無花果蛋白酶等等基因重組微生物如Novo Nordisk公司的Flavorzyme,Alcalase水解蛋白酶等,水解酶與藻蛋白的投料比1∶1~100,最好1∶25~40,水解時間1~50小時,最好4~20小時。對螺旋藻所含有藻蛋白進(jìn)行一次或多次分步驟水解,以獲得具有生理活性的單一或數(shù)種多肽混合物,一般肽鍵數(shù)不超過50,多數(shù)為2~10小肽。其制備工藝流程按

      圖1或圖2,水解方法,可以一步,也可以為多步驟,或按圖1或圖2方法交叉使用,以獲得最大收率的目的肽。按上述各種方法得到的多肽可按照分離多肽時所常用的方法如溶劑萃取法,分配法及柱層法等進(jìn)行分離和純化,從而得到本發(fā)明所述的各種多肽及各種多肽混合物。
      對本發(fā)明所述的各種多肽混合物進(jìn)行一些分離處理,可得到高F值螺旋藻寡肽。F值(Fischer)是指蛋白質(zhì)分子中支鏈氨基酸(Branchcdchainaminoacids,簡稱BCAA),與芳香族氨基酸(Aromatic amino acids,簡稱AAA)的摩爾比值。高F值寡肽是蛋白質(zhì)水解后形成的一種小分子量的非聚合肽;其中支鏈氨基酸占有較大比例,從而具有獨特的生理功能。從大豆蛋白,乳清蛋白,魚蛋白和玉米醇溶蛋白中獲取高F值寡肽的實驗已經(jīng)有報道。本發(fā)明以螺旋藻作為蛋白源制備高F值螺旋藻寡肽,尚未見報道。
      如此獲得的本發(fā)明多肽通常以游離態(tài)或其鹽的形式存在,且具有與相似應(yīng)的原始天然多肽相類似的生物活性。因此,它們可用作各種藥用制品或保健品。可按常規(guī)方法將它們轉(zhuǎn)化成可作藥用的酸加成鹽或復(fù)合物?;蛘甙烟烊欢嗵侨缏菪宥嗵?、香菇多糖或環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶……等枝接在按所述的一組小肽上,這組小肽鍵數(shù)為2~11。這組小肽根據(jù)其作用可成為腫瘤細(xì)胞親和肽,它們起一種靶向載體作用,經(jīng)其運載的抗腫瘤物質(zhì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有富集現(xiàn)象,提高了藥物的生物利用度,增強了藥物的抗腫瘤療效,使抗腫瘤藥物在低劑量水平起到高劑量的抗腫瘤療效,而又沒有高劑量時對人體正常細(xì)胞的毒副作用,顯著提高治療安全性和有效性。
      用于制備上述成鹽的例子有無機酸(氫溴酸、鹽酸、磷酸),有機酸(甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、水楊酸、苯磺酸、煙酸、熊果酸、抗壞血酸、壬二酸、油酸、亞油酸)。通過加入某些類型的使多肽具有更好生理活性的無機式有機物質(zhì)可以制備出上述復(fù)合物。用于形成這些復(fù)合物的無機物包括鈣、鎂、鋅、硒、鈷等金屬的無機化合物,尤其是這些金屬的磷酸鹽、焦磷酸鹽、棕櫚酸鹽,以及其氫氧化物,其它金屬的多磷酸鹽。所述有機物的物質(zhì)的例子有非抗原性白明膠,天然多糖如螺旋藻多糖、黃芪多糖、香菇多糖、肌醇六磷酸、多聚谷氨酸、肌苷等。
      根據(jù)治療的目的,藥劑的類型可在很寬的范圍內(nèi)選擇,藥用組合物的例子有片劑,粉末,液體,懸浮液,顆粒,膠囊,栓劑,鼻滴液,口腔粘膜吸收劑(如舌下片劑,可咀嚼片劑,錠劑,以及滴液),及軟膏。
      為了將該多糖藥物的制劑加工成片劑,可使藥用載劑,例如賦形劑,如蔗糖、乳糖、氯化鈉、葡萄糖、果糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、膨潤土、纖維素、硅酸等,粘合劑如水、乙醇、糖漿、淀粉溶液、明膠、紫膠、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等,崩解劑如藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布粉末、碳酸鈣、碳酸氫鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、硬脂酸單甘酯、十二烷基硫酸鈉等,崩解抑制劑如蔗糖、氫化油等,吸收促進(jìn)劑如季胺鹽、十二烷基硫酸鈉、十二烷基氮卓酮等,潤濕劑如甘油、丙二醇等,潤滑劑如硬脂酸鹽、聚乙二醇等。在制備片劑時,可用常規(guī)的包衣材料再制成片劑包衣片,以制成糖衣片、明膠膜包衣片、腸溶包衣片,還可制成膜包衣的片劑或雙層片劑。
      為了將該多肽藥物制成丸劑,也可使用制藥領(lǐng)域已知的載體,賦形劑如乳糖、葡萄糖、淀粉、氫化植物油、滑石粉、高嶺土、粘合劑如阿拉伯膠、西黃耆膠、明膠等,崩解劑如,瓊脂、昆布等。
      為了制成膠囊劑,可收本發(fā)明的多肽與上述載體混合,將由此得到的混合物添入藥用規(guī)格的明膠膠囊內(nèi)或軟質(zhì)膠囊內(nèi),以便制成膠囊劑。
      為了加工成注射制劑,要對這些多肽活性組分的溶液,乳液或懸浮液進(jìn)行滅菌消毒,可加入稀釋劑,如水、乙醇、聚乙二醇、吐溫40、吐溫80等。
      為了使所需的制劑滲透到人體血液中,可加入適量的粘合劑、稀釋劑、推進(jìn)劑、吸收劑等制成粉末劑、氣溶膠型和液體型或半固體型制劑。
      為了加工成乳劑、膏劑或凝膠劑,也可使用該領(lǐng)域內(nèi)廣大的藥用輔料,如白凡士林、液體石蠟、甘油、聚乙二醇、硅酮、卡伯膠、十二烷基硫酸鈉等。
      對上述藥物制劑的給藥方式?jīng)]有特殊的限制,可根據(jù)制劑形式,患者性別年齡和其他狀況,癥狀的程度等進(jìn)行選用,例如片劑、丸劑、懸浮劑、乳液、顆粒劑和膠囊劑可口服,注射可靜脈給藥,或與生理鹽水、葡萄糖乳液混合。如果需要可肌肉、皮肉、表皮下給藥、滴鼻劑可通過吸入鼻腔內(nèi)給藥、口腔粘膜吸收型可用于口腔粘膜部位。
      為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明,下面將列舉三個實施例,但并不限制本發(fā)明的范圍。
      實施例一按圖2方法,酶預(yù)處理胰酶、胰蛋白酶U2、木瓜蛋白酶U3按U1∶U2∶U3=1∶3~6∶1,加入去離子水,用9%葡萄糖溶液和0.17%氯化鈣溶液處理,在28℃下保溫2小時,備用。
      取螺旋藻粉1000克,加水6升,充分?jǐn)嚢?,分別用0.1鹽酸溶液或5%碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8,煮沸1分鐘,冷至45℃。將上述酶溶液按酶與底物濃度比E/S=6000U/g量加入螺旋藻混懸液中充分?jǐn)嚢瑁?5℃保溫2~6小時。得酶解液1。將酶解液1煮沸2~10分鐘,調(diào)pH值至7,分別收集濾液和濾渣。在該濾渣中加入1.5~4倍的去離子水,調(diào)pH值至8,按圖1方法,按酶與底物濃度比E/S=6000U/g量加入胰蛋白酶溶液,在45℃充分?jǐn)嚢瑁?~6小時,得酶解液2。將酶解液2煮沸2~10分鐘調(diào)pH值至7,分別收集濾液和濾渣。合并酶解液1和酶解液2濾液,調(diào)pH值至7,按圖1方法,按酶與底物濃度比E/S=4500U/g量加入木瓜蛋白酶溶液在50℃下充分?jǐn)嚢?小時,得酶解液3。將酶解液3調(diào)pH值至7,煮沸2~10分鐘,分別收集濾液和慮渣。將酶解液3加入相當(dāng)于螺旋藻干品重量0.07~0.04%的5%氯化鈉溶液煮沸1分鐘,攪勻后靜置過夜。將充分冷卻的濾液下部沉淀物放出留作它用,上部澄清液即為活性多肽原液。將此原液用Dtaflo PM-30型超慮膜分離,所得濾液含低聚肽4~11%。此低聚肽溶液經(jīng)干燥后可制成為片劑、膠囊,或加入調(diào)味劑后可以制作口服液(需濃縮至0.9~1.0比重)或可以中藥(中藥有效充分)如螺旋藻多糖、黃芪多糖、香菇多糖,或其他藥物如琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、水楊酸、苯磺酸、煙酸、熊果酸、抗壞血酸、壬二酸、油酸、亞油酸。通過加入某些類型的使多肽具有更好生理活性的無機式有機物質(zhì)可以制備出上述復(fù)合物。用于形成這些復(fù)合物的無機物包括鈣、鎂、鋅、硒、鉆等金屬的無機化合物,尤其是這些金屬的磷酸鹽、焦磷酸鹽、棕櫚酸鹽,以及其氫氧化物,其它金屬的多磷酸鹽。所述有機物的物質(zhì)的例子有非抗原性白明膠,配伍制劑。
      蛋白質(zhì)濃度測定,用紫外光215nm和255nm吸收差法,可測定溶液中所含低聚肽的濃度。按下式計算蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=0.144(A215~A255)。蛋白質(zhì)純度檢驗用紫外分光光度法,吸收值A(chǔ)280/A260應(yīng)為1.75。
      實施例二從螺旋藻的藻蛋白中制備具有抗高血壓制藥的活性肽。
      按圖2方法,螺旋藻粉1000g,加水6升成溶液用甲酸溶液調(diào)至pH5.5,煮沸10分鐘。將菠蘿蛋白酶(自制,酶活性>3.5×106μ/gμμ)和木瓜蛋白酶(自制,酶活性>2500μ/g)分別按1∶5~10比例溶于水中加入菠蘿蛋白酶6×106μ和木瓜蛋白酶4×10645℃攪拌保溫3h小時,50℃攪拌保溫1h,然后將酶鮮液煮沸2~10分鐘,調(diào)至pH7(用5%碳酸鈉)。分別收集濾液和濾渣。濾渣可作為下次酶解的原料。在收集濾液中加入硫酸鎂適量,在減壓下尿素濾液,將濃縮液進(jìn)行噴霧干燥成粉。采用該工藝得到的螺旋藻多種多肽混合物具有抗高血壓作用,可按常規(guī)通用的工業(yè)制劑方法制成各種上述制劑。
      實施例三按圖1方法制備高F值螺旋藻寡肽。
      螺旋藻粉1000g,加水6升成溶液用甲酸溶液調(diào)至pH7.5,煮沸10分鐘。冷至70℃,加入Novo Nordisk公司的Alcalase(2.4L)水解蛋白酶6ML,充分?jǐn)嚢?,保?小時,煮沸5分鐘滅菌,得到水解液1,冷卻至50℃,用甲醇溶液(20m Mol/L,pH4.0),或者5%碳酸鈉溶液(視具體情況而定)調(diào)水解pH值至6。加入Novo Nordisk公司的Flaborzyme(1000ml)水解蛋白酶4ML,攪勻保溫2~8h,升溫至85℃滅菌5分鐘,趁熱抽濾。用枸櫞酸加入過濾的水解液中,攪勻,調(diào)pH值至4.8,并將水解液冷卻至60℃。采用活性炭柱,碳/液=4∶10,溫度60,去除芳香族氨基酸,然后用1N氨水和無水乙醇按1∶3比例混合洗脫。收集220nm處有最大吸收的部分洗脫液。將上述洗脫液在80℃下減壓濃縮至比重1∶10,經(jīng)真空干燥,至含水15%以下,再經(jīng)微波干燥至含水分4.5%以下干粉氨基酸自動分析儀和電泳分析,可測定上述主要產(chǎn)品是由支鏈氨基酸組成的寡肽混合物,可制成片劑。膠囊劑,口服液等劑型。用于肝昏迷腦患者的營養(yǎng)支持以及大強度運動員的體力恢復(fù),以及大面積燒傷患者,創(chuàng)傷失血者的營養(yǎng)支持。
      權(quán)利要求
      1.采用化學(xué)與生物酶解相結(jié)合方法,對螺旋藻的藻蛋白進(jìn)行水解,制備出比原來藻蛋白更具有各種生理活性的多種小肽,和高F值螺旋藻寡肽,作為功能保健食品的功能成分或藥物。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1,水解藻蛋白時采用化學(xué)方法是指,在酸性、堿性或中性環(huán)境中,借助鎂、鈣、磷、硒、鋅、錳等離子的水解催化作用。生物酶解的水解蛋白酶是動物來源的如胃蛋白酶、胰蛋白酶,溶菌酶等;植物來源的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶,無花果蛋白酶等等基因重組微生物如NovoNordisk公司的Flavorzyme,Alcalase水解蛋白酶等。
      3.根據(jù)權(quán)利要求書1和2,水解溫度在20~80℃,最佳在35~65℃,水解酶與蛋白酶的投料比1∶1~100,最好是1∶25~40,水解反應(yīng)時間1~50小時,最好4~20小時。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3所得的小肽,其酸加成鹽和其復(fù)合物是具有降血壓,抗腫瘤,降膽固醇、降血脂、降血糖,預(yù)防心血管疾病作用,又有減肥,防止肥胖,用于肝昏迷腦患者的營養(yǎng)支持,大強度運動員的體力恢復(fù),以及大面積燒傷患者,創(chuàng)傷失血者的營養(yǎng)支持等,多種生理活性的藥物組合物。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1,2,3和4的小肽藥物組合物,其特征在于其含有至少一種小肽,其酸加成鹽或其混合物作為權(quán)利要求4所述生理活性作用。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及螺旋藻多肽的制備方法及其制劑應(yīng)用,更具體地說,本發(fā)明采用從動物、植物、微生物和基因重組微生物中獲得的水解蛋白酶,在酸性,堿性或中性環(huán)境中或借助于鎂、鈣、磷、硒、鋅、錳離子參與的條件下,水解螺旋藻蛋白,得到具有多種生理活性的螺旋藻多肽,或其酸加成鹽及其復(fù)合物,或作為活性成分,可作藥用和保健之用途。
      文檔編號A61K38/01GK1204651SQ9810240
      公開日1999年1月13日 申請日期1998年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月8日
      發(fā)明者童朗, 劉毅 申請人:劉毅, 童朗
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