專利名稱：甲肝－麻疹二聯(lián)疫苗及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物及其冷凍干燥制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備所說的甲型肝類-麻疹二聯(lián)疫及其冷凍干燥制劑的方法。
自1991年由聯(lián)合中國兒童基金會(huì)和世界衛(wèi)生組織等國際組織發(fā)起并推行“兒童疫苗計(jì)劃”(Children’s vaccine initiative,CVI)以來，世界上許多從事疫苗研究與開發(fā)的實(shí)驗(yàn)室和公司都在致于新疫苗的研制。這些新疫苗應(yīng)該是多價(jià)的、熱穩(wěn)定的，并且是可以以口服或氣霧形式接種的。從臨床應(yīng)用角度看，人們希望通過使用聯(lián)合疫苗，經(jīng)一次注射即可免疫接種能夠有效地預(yù)防兩種或多種疾病的兩種或多種病毒和/或細(xì)菌抗原，以降低接種費(fèi)用、減少保健醫(yī)生和防疫部門的工作量、簡(jiǎn)化計(jì)劃免疫檔案的保管，從而改善目前嬰幼兒童免疫接種率低的現(xiàn)狀。近年來，已被批準(zhǔn)的新型聯(lián)合疫苗是全細(xì)胞白百破(白喉、破傷風(fēng)類毒素和百日咳聯(lián)合制劑)與流感嗜血桿菌B組合而成的四聯(lián)疫苗。另外，鑒于用同一個(gè)注射器投用混合疫苗制品的可行性，有關(guān)原則也已應(yīng)用于在人體不同部位同時(shí)接種不同疫苗制劑的所謂“混合與配比”程序。然而，迄今為止尚沒有涉及甲肝疫苗與其他病毒減毒活疫苗如麻疹疫苗組合以制備二聯(lián)病毒活疫苗的報(bào)導(dǎo)，特別是還沒有在同一敏感宿主細(xì)胞株內(nèi)，相繼接種兩種病毒以制備二聯(lián)病毒減毒活疫苗的報(bào)導(dǎo)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，所說的二聯(lián)疫苗組合物含有彼此互不干擾的，分別具有預(yù)防有效的病毒滴度的甲型肝炎減毒活病毒和麻疹減毒活病毒，并且含有或不含病毒疫苗保護(hù)劑。
根據(jù)本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，其中甲型肝炎活疫苗的有效病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹活疫苗的有效病毒滴度為103.5-5.0TCID50/ml。
根據(jù)本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，所說的二聯(lián)疫苗組合物是冷凍干燥形式的。
根據(jù)本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，其中所說的病毒活疫苗保護(hù)劑由重量/體積比(w/v)為0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明膠、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸鈉、0.05-0.1％的抗壞血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％山梨醇和0.5-1％的肌醇組成。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法，該方法包括將按常規(guī)方法增殖得到的病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml的甲型肝炎減毒活疫苗原液與病毒滴度為103.5-5.0TCID50/ml的麻疹減毒活疫苗原液按適當(dāng)比例混合。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供利用同一宿主細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法，該方法包括以下步驟1)分別提供按常規(guī)方法傳代減毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒種和減毒的麻疹活疫苗病毒毒種；2)用步驟1)中提供的減毒的甲型肝炎活疫苗病毒接種人胚肺二倍體細(xì)胞并在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所說的細(xì)胞以增殖病毒，當(dāng)甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的陽性感染率達(dá)到75％以上時(shí)，再次接種步驟1)提供的麻疹減毒活疫苗病毒并繼續(xù)培養(yǎng)之；3)當(dāng)甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的陽性率達(dá)到90％以上，并且90％以上的二倍體基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)麻疹病毒所致的典型細(xì)胞病變時(shí)，收獲細(xì)胞并分離細(xì)胞培養(yǎng)物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活病毒疫苗原液。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲型肝炎病毒感染二倍體細(xì)胞基質(zhì)的感染率是用標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光法監(jiān)測(cè)的。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的方法進(jìn)一步包括將按步驟3)得到的含甲型肝炎-麻疹減毒二聯(lián)活疫苗病毒原液按大約1∶1的比例與適當(dāng)?shù)牟《净钜呙绫Ｗo(hù)劑混合，并按常規(guī)方法冷凍干燥之。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的病毒活疫苗保護(hù)劑基本上由重量/體積比(w/v)為0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明膠、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸鈉、0.05-0.1％的抗壞血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％的山梨醇和0.5-1％的肌醇組成。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備如上文限定的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活疫苗的冷凍干燥制劑的方法，該方法包括1)分別提供具有有效病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，以得到混合的懸液形式的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)病毒活疫苗；2)在步驟1)中所述的二聯(lián)病毒活疫苗原液中，按大約1∶1(v/v)的比例加入如上文限定的病毒活疫苗保護(hù)劑并均勻混合之；3)冷凍干燥步驟2)中得到的疫苗組合物。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的步驟3)包括首先將所說的疫苗組合物于大約-20至-50℃的溫度下預(yù)冷凍3至6小時(shí)，然后在適當(dāng)?shù)膬龈裳b置中于28-35℃下真空干燥10至20小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲肝病毒有效滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒有效滴度為103.5-5.0TCID50/ml。
本發(fā)明提供由彼此不干擾的，分別有適當(dāng)?shù)牟《镜味鹊募仔透窝诇p毒活病毒和麻疹減毒活病毒組成的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，該二聯(lián)疫苗組合物可以含有或不含有病毒活疫苗保護(hù)劑。
麻疹是一種由麻疹病毒經(jīng)呼吸道傳播的，并且經(jīng)初次免疫和加強(qiáng)免疫接種后即可獲得終生免疫效果的嚴(yán)重傳染病。一般在嬰兒8-9月令進(jìn)行初次免疫接種，并在12月令左右進(jìn)行再次加強(qiáng)接種，從而使被接種者獲得終生免疫力。由于兒童計(jì)劃免疫(EPI)工作的推行，麻疹將成為繼脊髓灰質(zhì)炎后第二個(gè)在全球范圍被徹底消滅的傳染病。目前在中國普遍使用的麻疹疫苗是基于麻疹病毒株長(zhǎng)-47或滬-191的活疫苗，并且大多是利用雞胚原始細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)的。然而，我們的研究表明，使用人胚肺二倍體細(xì)胞單層或細(xì)胞懸液作為麻疹病毒傳代增殖的基質(zhì)細(xì)胞將有利于病毒的增殖和病毒抗原性的保留。
另一方面，如眾所周知，甲型肝炎是一種由自然界廣泛存在的甲型肝炎病毒引起的全球性高發(fā)病率急性傳染病。近年來，我們的實(shí)驗(yàn)室使用自己開發(fā)的減毒甲型肝炎病毒株H-V-1作為種子病毒，并利用人胚肺二倍體細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)了甲肝減毒活疫苗的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，取得了大量研究與生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。到目前為止，已使用該疫苗接種易感人群達(dá)8000萬人份以上，其不僅具有極好使用安全性，而且一次免疫接種的保護(hù)率可達(dá)95％以上，二次免疫接種的保護(hù)率達(dá)到100％。
我們?cè)陂L(zhǎng)期研究和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，人二倍體細(xì)胞不僅是甲型肝炎病毒的良好宿主，而且也是麻疹疫苗病毒株的良好宿主。特別是，我們發(fā)現(xiàn)麻疹病毒在人胚肺二倍體宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖速度更快。具體地說，我們已不可預(yù)先地發(fā)現(xiàn)，在人胚肺二倍體細(xì)胞基質(zhì)上首先接種甲肝減毒活疫苗毒種后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中將細(xì)胞培養(yǎng)大約2-3周，當(dāng)甲型肝炎病毒增殖到足夠高的病毒滴度(例如大約105.5-6.5TCID50/ml)時(shí)，接種麻疹減毒活病毒并繼續(xù)培養(yǎng)。大約一周后，兩種活病毒幾乎同時(shí)達(dá)到相應(yīng)的高增殖水平。然后可分離得到含有兩種減毒活病毒的二聯(lián)疫苗原液。這一發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了我們使用在同一宿主細(xì)胞株(例如人胚肺二倍體細(xì)胞株)增殖兩種減毒活疫苗病毒株，以制備甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的基礎(chǔ)。
當(dāng)然也可以分別制備兩種有適當(dāng)病毒滴度的病毒疫苗原液，并按適當(dāng)?shù)谋壤旌蟽煞N減毒的活病毒原液，以制得懸液形式的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗。這里所說的適當(dāng)病毒滴度，一般是指甲肝病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒滴度為103.5- 5.0TCID50/ml。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供利用同一宿主或基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法，該方法包括1)分別提供按常規(guī)方法傳代減毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒種和減毒麻疹活疫苗病毒毒種；2)用步驟1)中提供的減毒的甲型肝炎活疫苗病毒接種人胚肺二倍體細(xì)胞并在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所說的細(xì)胞以增殖病毒，當(dāng)甲型肝炎疫苗感染細(xì)胞的陽性感染率達(dá)到75％以上時(shí)，接種步驟1)中提供的麻疹減毒活疫苗病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)之；3)當(dāng)甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的陽性率達(dá)到90％以上，并且90％以上的二倍體基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)麻疹病毒所致的典型細(xì)胞病變時(shí)，收獲細(xì)胞并分離細(xì)胞培養(yǎng)物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活病毒疫苗原液。
為了制備本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗，首先按照已知方法分別制備甲型肝炎減毒活疫苗病毒原液和麻疹減毒活疫苗病毒原液。為此，例如可以按照中國專利92114998.0中描述的方法，制備基于甲型肝炎H-V-1病毒株的減毒活疫苗種子病毒(毒種)。同時(shí)，按照中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制定的生物制品規(guī)程(1995版)，使用長(zhǎng)-47或滬-191麻疹病毒株制備種子病毒。
甲型肝炎病毒可在許多培養(yǎng)的組織細(xì)胞例如人胚肺二倍體細(xì)胞內(nèi)增殖，但增殖速度相對(duì)較慢，而且不會(huì)引起形態(tài)學(xué)上明可見的細(xì)胞病變。相反，麻疹病毒不僅可在許多原代或繼代細(xì)胞內(nèi)增殖，而且增殖周期相對(duì)較短，在同樣時(shí)間內(nèi)病毒的增殖產(chǎn)率較高，并且可產(chǎn)生典型的融合巨細(xì)胞細(xì)胞樣病變。特別是我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，人胚肺二倍體細(xì)胞是上述甲型肝炎疫苗病毒株和麻疹疫苗病毒株的敏感主細(xì)胞，因此我們選用人胚肺二倍體細(xì)胞作為甲肝病毒和麻疹病毒的優(yōu)選的共同宿主細(xì)胞株，用于制備本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗。
為此目的，首先按常規(guī)方法將人胚肺二倍體細(xì)胞株擴(kuò)增傳代至足夠的細(xì)胞密度，例如在培養(yǎng)容器內(nèi)生長(zhǎng)成致密的細(xì)胞單層。以0.02至10感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)向該細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)接種甲肝減毒活疫苗毒種，于大約32-35℃條件下培養(yǎng)，并使用已知的免疫熒光法直接監(jiān)測(cè)病毒感染細(xì)胞的感染率。約2-3周后，當(dāng)被病毒感染的細(xì)胞中75％以上呈現(xiàn)免疫熒光陽性時(shí)，更換含有2-8％小牛血清的MEM維持液，并按0.01-10m.o.i.接種麻疹減毒活疫苗毒種。
接種后，將相繼感染甲型肝炎病毒和麻疹病毒株的人胚肺二倍體細(xì)胞置于33-35℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛程度每3-5天更換一次培養(yǎng)基，并逐日觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。當(dāng)80-100％被感染細(xì)胞出現(xiàn)麻疹病毒感染所致的典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并且甲肝病毒感染陽性率達(dá)到90％以上時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物移至2-8℃無菌環(huán)境下冷釋放1-3天。然后低溫(-20℃以下)冷凍收存細(xì)胞。
或者，作為另一種可代用的操作方法，亦可在甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的免疫熒光反應(yīng)陽性率達(dá)到75％以上時(shí)棄去維持液，并用平衡鹽溶液(BSS)洗沖細(xì)胞以除去小牛血清。然后換成含有0.01-0.25％(w/v)人血清白蛋白的Eagle氏MEM或其他適宜的培養(yǎng)基(例如199綜合培養(yǎng)基)，并按0.01至10m.o.i.接種除去了小牛血清的新鮮麻疹病毒活疫苗毒種。將所得培養(yǎng)物置于33-35℃下培養(yǎng)并逐日取樣觀察麻疹病毒感染所致的典型CPE。當(dāng)CPE發(fā)展到80-100％，并且甲肝病毒感染的細(xì)胞陽性率達(dá)到90％以上時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)置于2-8℃條件下冷釋放1-3天，然后收集并低溫(-20℃以下)冷凍保存之。
然后，經(jīng)三次凍融和超聲處理，破碎按上述方法制備的細(xì)胞，離心除去細(xì)胞碎片并收集上清液，即得到懸液形式的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗。
當(dāng)然，也可以在分別制得有適當(dāng)病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液后，按照適當(dāng)?shù)捏w積比例混合兩種有所需病毒滴度的減毒活疫苗原液，以制得懸液形式的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗。這里所說適當(dāng)病毒滴度一般是指甲肝病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒滴度為103.5-5.0TCID50/ml。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備如上文限定的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活疫苗的冷凍干燥制劑的方法，該方法包括1)分別提供甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，并按適當(dāng)?shù)谋壤旌现?，得到混合的懸液形式的甲型肝?麻疹二聯(lián)病毒活疫苗原液；2)在步驟1)中所述的病毒活疫苗原液中，按大約1∶1(v/v)的比例加入如上文限定的病毒活疫苗保護(hù)劑并均勻混合之；3)冷凍干燥步驟2)中得到的疫苗組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了冷凍干燥的甲肝一麻疹二聯(lián)疫苗及其生產(chǎn)方法。為此，可以按照中國專利申請(qǐng)98120633.6中所述的方法，將如此制得的懸液形式的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗制備成冷凍干燥制劑，以避免由于懸液態(tài)疫苗必須于低溫冷藏條件下(即通過所謂“冷鏈”)運(yùn)輸、貯存和使用，而使病毒活疫苗的大規(guī)模推廣使用，特別是在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)展地區(qū)及熱帶和亞熱帶地區(qū)推廣使用時(shí)所受到的限制。
為了將按上述方法制得的懸液形式的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗制備成冷凍干燥制劑，可以將已制得的懸液形式的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗制劑與凍干病毒活疫苗保護(hù)劑按照大約1∶1(v/v)的比例混合。于無菌條件下分裝后，將所得混合物置于適當(dāng)?shù)睦鋬龈稍镅b置內(nèi)進(jìn)行凍干處理，以得到本發(fā)明的凍干形式的甲型肝炎-麻疹減毒活疫苗組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的冷凍干燥包括首先將懸液形式的甲型肝炎-麻疹減毒活疫苗組合物于大約-30℃至-50℃，最好于大約-40℃的溫度下預(yù)冷凍3至6小時(shí)，然后于大約28至35℃的溫度下真空干燥約10至20小時(shí)，以得到冷凍干燥的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的冷凍干燥保護(hù)劑基本上由重量/體積比(w/v)為0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明膠、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸鈉、0.05-0.1的抗壞血酸、0.5-2.8％的尿素、0.2-1的山梨醇和0.5-1％的肌醇組成。
在如上文所述的本發(fā)明的活病毒疫苗保護(hù)劑中，人血清白蛋白和明膠主要發(fā)揮蛋白質(zhì)和膠體支架作用，為懸液或凍干后的活病毒提供空間支持和部分營養(yǎng)保護(hù)作用。海藻糖具有穩(wěn)定細(xì)胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、抵御高溫破壞的功能。研究證明，在海藻糖存在下干燥處理的抗體、酶、病毒等生物材料，當(dāng)重新水合后均能恢復(fù)其活力(RoserB.,FoodSci & Techno1.2(7):166-169,1991；Roser B.,Biopharm.4(8):47-53,1991；Roser B.,ColaceC.,New Scientist,138:24-28,1993)。利用海藻糖干燥處理小兒麻痹疫苗已獲得了成功。谷氨酸鈉等堿性氨基酸鹽、尿素、山梨醇和肌醇，以及抗壞血酸，在本發(fā)明的凍干保護(hù)劑中則主要起到調(diào)整pH、穩(wěn)定水合狀態(tài)或脫水過程中的滲透壓，以及抗氧化等作用。
然而應(yīng)特別提出的是，我們的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)用于某些無包膜的病毒，如甲型肝炎病毒，麻疹病毒，以及脊髓灰質(zhì)炎病毒時(shí)，所說的凍干保護(hù)劑中可以不含有人血清白蛋白，而仍可具有良好的冷凍干燥效果。因此，在制備本發(fā)明甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗凍干制劑時(shí)，所使用的凍干保護(hù)劑中也可以不加入價(jià)格較昂貴的人血清白蛋白。
可以在適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，按常規(guī)試劑配制方法配制本發(fā)明的病毒疫苗保護(hù)劑，但在混入海藻糖、明膠、山梨醇或肌醇之前，應(yīng)將這些物質(zhì)于37℃下預(yù)加熱24-48小時(shí)，并且在分裝待凍干的疫苗前0.5-2小時(shí)將保護(hù)劑與待凍干疫苗以大約1∶1(v/v)的比例混合均勻。可使用常規(guī)冷凍干燥裝置將分裝好的上述混合液于-30至-50℃下預(yù)凍3至6小時(shí)，然后于28至35℃下真空干燥10至20小時(shí)。凍干過程中，疫苗凍干混合物的共融溫度低于-40℃。
為了證實(shí)本發(fā)明的病毒疫苗保護(hù)劑在冷凍干燥的病毒活疫苗生產(chǎn)中的保護(hù)作用，及其對(duì)冷凍干燥的病毒活疫苗儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響，我們以本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)病毒活疫苗為例，對(duì)其在加入和不加入本發(fā)明凍干保護(hù)劑的條件下，凍干前和凍干后的病毒滴度，以及凍干保護(hù)劑對(duì)疫苗的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了一系列的比較試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的病毒活疫苗保護(hù)劑不僅在冷凍干燥處理過程中對(duì)病毒活性具有極好的保護(hù)作用，而且可以顯著地提高甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗在凍干狀態(tài)下和提高的溫度下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗具有極好的特異性。我們使用按本發(fā)明方法制備的冷凍干燥的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗，分別進(jìn)行體外甲肝病毒純毒試驗(yàn)和麻疹病毒純毒試驗(yàn)。結(jié)果表明，本發(fā)明的冷凍干燥的二聯(lián)疫苗樣品中，甲肝病毒和麻疹病毒在與它們的相應(yīng)抗血清標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后，均被高效價(jià)特異性抗體完全中和。
我們使用恒河猴為被試對(duì)象所進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步表明，本發(fā)明的冷凍干燥形式的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)有極好的使用安全性和免疫原性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在給成年健康恒河猴注射適當(dāng)量的本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗8周后，未見動(dòng)物出現(xiàn)麻痺和其他任何神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查也未見任何異常改變。另外，對(duì)活體動(dòng)物在靜脈接種本發(fā)明的二聯(lián)疫苗前、后所做的連續(xù)肝臟組織病理學(xué)檢查和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)測(cè)定，也未發(fā)現(xiàn)任何有意義的陽性病理學(xué)反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在接種二聯(lián)疫苗后，第二周出現(xiàn)血清抗HAVIgM和抗麻疹病毒IgM抗體，但到第8周時(shí)逐漸消失。而特異性抗HAV和抗麻疹病毒血凝抑制(HI)抗體則在第二周出現(xiàn)50％陽性率，第4周兩種血凝抑制抗體的陽性率均達(dá)到100％。另外，分別檢測(cè)動(dòng)物接種疫苗前和接種疫苗后8周血清的甲肝和麻疹病毒中和抗體滴度，顯示均大于1∶2血清稀釋度。
最后，為了證明人體內(nèi)接種本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的適用性，我們進(jìn)一步對(duì)8-12月令的健康嬰兒進(jìn)行了同時(shí)接種甲型肝炎減毒活疫苗(H-L-1)和凍干的麻疹減毒活疫苗(長(zhǎng)-47)的臨床觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有275名受試對(duì)象在72小時(shí)觀察期間內(nèi)均未出現(xiàn)局部紅腫過敏反應(yīng)，而且在長(zhǎng)達(dá)72天的觀察期間內(nèi)也未見有明顯的全身性不良反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示，單獨(dú)接種任何一種疫苗和聯(lián)合使用兩種疫苗后，兩組間所產(chǎn)生的抗甲型肝炎病毒抗體和抗麻疹病毒抗體陽性率無顯著性差異。接種后兩組受試者所產(chǎn)生的兩種抗體的幾何平均滴度(GMT)也沒有顯著性差異。
因此，可以據(jù)此推測(cè)，有可能將彼此互不干擾的甲型肝炎疫苗和麻疹疫苗制成二聯(lián)甚至多聯(lián)疫苗制劑，并納入兒童計(jì)劃免疫。例如，特別是對(duì)于甲型肝炎的高發(fā)病地區(qū)的嬰幼兒可在10-13月令時(shí)，注射預(yù)防有效量的本發(fā)明的甲型-麻疹二聯(lián)疫苗，以完成甲型肝炎的初次免疫和麻疹的加強(qiáng)免疫，從而達(dá)到早期預(yù)防兩種疾病的目的。
實(shí)施例1甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的制備首先按常規(guī)方法使用Eagle氏極限基本培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞。約5天后，待細(xì)胞增殖形成致密單層時(shí)，以大約4.5m.o.i.向所得細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)接種如中國專利92114998.0中所述的甲型肝炎病毒L-A-1減毒株。補(bǔ)加維持液(加有5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基)后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，使之適應(yīng)傳代。連續(xù)培養(yǎng)3周，每周更換一次新鮮培養(yǎng)基，并以直接免疫熒光法(IF)定時(shí)監(jiān)測(cè)甲肝病毒的增殖水平。3周后，當(dāng)被感染的細(xì)胞中的75％呈現(xiàn)免疫熒光陽性時(shí)，再次更換維持液，并按大約4.5m.o.i.接種麻疹病毒長(zhǎng)-47減毒株。
然后將相繼感染了甲型肝炎病毒和麻疹病毒的人胚肺二倍體細(xì)胞置于34℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每4天更換一次培養(yǎng)基，并逐日取細(xì)胞樣品于高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)大約50％細(xì)胞出現(xiàn)麻疹病毒所致的典型細(xì)胞病變時(shí)，離心(2000rpm,4℃,15分鐘)分離細(xì)胞并用Eagle氏MEM培養(yǎng)基洗掉殘留的小牛血清。然后將細(xì)胞重新懸浮于不含小牛血清的Eagle氏MEM培養(yǎng)基(疫苗夜)中，繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞病變發(fā)生率達(dá)到100％，并且甲肝病毒感染細(xì)胞的陽性率達(dá)到95％時(shí)，終止培養(yǎng)并將細(xì)胞培養(yǎng)物置于4℃下冷釋放約72小時(shí)。將冷釋放后的細(xì)胞培養(yǎng)物置于-20℃下保存。
將低溫凍存的細(xì)胞反復(fù)凍融三次，并超聲處理10分鐘以破碎細(xì)胞。離心(2000rpm,4℃,15分鐘)除去細(xì)胞碎片后，收集上清即得到懸液態(tài)的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗。實(shí)施例2甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗凍干制劑的制備首先按下述方法配制用于制備甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗凍干制劑的病毒疫苗保護(hù)劑將醫(yī)用明較0.8g溶加于300ml蒸餾水中，加熱煮沸使之溶解后，于大約116℃高壓蒸汽滅菌40分鐘，然后室溫冷卻至30℃。向所得明膠溶液內(nèi)加入1.0g使用0.22mm濾器過濾除菌的人血清白蛋白(長(zhǎng)春生物制品所生產(chǎn))，并充分?jǐn)嚢杈鶆?。然后，分別取海藻糖8.0g、谷氨酸鈉1.0g、抗壞血酸0.1g、尿素2.5g、山梨醇8g和肌醇0.6g、并依次加入到大約500ml蒸溜水中。然后在振動(dòng)攪拌下將此混合物于37℃預(yù)加熱24小時(shí)。次日，將混合物冷卻至室溫(25℃)后與上述明膠-血清白蛋白溶液混合，加入蒸餾水補(bǔ)足體積并用0.1N HCL調(diào)PH至7.0。再次過濾除菌后得到所需的病毒活疫苗凍干保護(hù)劑。
將此凍干保護(hù)劑與按實(shí)施例1所述方法制備的懸液態(tài)甲肝-麻疹二聯(lián)活疫苗按1∶1體積混合，無菌分裝于開口小瓶(2ml/瓶)內(nèi)并置于密閉的真空冷凍干燥器(FS150-SS20C型，F(xiàn)ull Co.,USA)內(nèi)進(jìn)行凍干處理。首先將疫苗組合物于大約-40℃下預(yù)凍4小時(shí)，然后升溫至32℃真空干燥15小時(shí)，從而得到冷凍干燥的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗。實(shí)施例3冷凍干燥的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的貯存穩(wěn)定性本實(shí)施例通過對(duì)本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗于凍干前和凍干后。以及在4℃、室溫(25℃)和37℃條件下貯存不同時(shí)間后所作的病毒滴度分析，說明本發(fā)明甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗凍干保護(hù)劑在疫苗凍干過程中和冷凍干燥后對(duì)疫苗的保護(hù)作用。
取連續(xù)五批(HM 1-5)二聯(lián)疫苗樣品，于凍干前和凍干后，以及凍干的疫苗在4℃、25℃、37℃溫度下貯存不同時(shí)間后，分別檢測(cè)二聯(lián)疫苗中甲肝病毒和麻疹病毒的滴度。
由于麻疹病毒感染人胚肺二倍體細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，所以在測(cè)定甲肝病毒滴度時(shí)應(yīng)首先中和麻疹病毒。為此，對(duì)二聯(lián)凍干疫苗樣品進(jìn)行10×系列稀釋，取10-2稀釋度的樣品0.1ml并加入按使用說明書稀釋的抗麻疹病毒血清(中國藥品生物制品撿定所監(jiān)制)0.9ml，混合后置4℃下保溫過夜以中和麻疹病毒。再次對(duì)此被中和后的疫苗樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，并用10-5稀釋度的病毒液接種預(yù)培養(yǎng)的人胚肺二倍體細(xì)胞。按前述方法培養(yǎng)4周后收獲細(xì)胞，常規(guī)破碎細(xì)胞并離心收集溶胞產(chǎn)物。然后用ELSA和IF法檢測(cè)甲肝病毒滴度，并用Reed-Muench方法計(jì)算TCID50值。
為了檢測(cè)本發(fā)明甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗的麻疹病毒滴度，首先分別將疫苗樣品和麻疹病毒參照品(中國藥品生物制品檢定所)進(jìn)行10×系列稀釋，用10-4稀釋度的病毒懸液(1ml)接種FL細(xì)胞(一種人羊膜細(xì)胞系)并于34℃培養(yǎng)細(xì)胞1周，然后按上述常規(guī)方法檢測(cè)麻疹病毒滴度。
本實(shí)施例的結(jié)果如下列表1和表2中所示。
表1甲肝-麻二聯(lián)癌苗凍干前和凍干后病毒滴度比較
>*表中所給出的數(shù)據(jù)為單位體積的病毒滴度值(Log TCID50/ml)。表2凍干甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗在不同溫度下的貯存穩(wěn)定性
*表中所給出的數(shù)據(jù)為單位體積的病毒滴度值(Log TCID50/ml)。
從表1和表2所示的結(jié)果可以看出，在病毒疫苗凍干保護(hù)劑存在下，本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的病毒滴度凍干后比凍干前雖有所下降，但所有五批樣品中兩種病毒滴度的下降值均不大于0.5Log TCID50/ml。另外，本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗的凍干制劑于4℃下貯存12個(gè)月，室溫(25℃)下貯存3個(gè)月，以及37℃下貯存7天，兩種病毒的滴度幾乎沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的改變。因此，我們有理由相信，本發(fā)明所使用的病毒疫苗凍干保護(hù)劑對(duì)于二聯(lián)疫苗的凍干過程中，以及凍干后的貯存穩(wěn)定性均具有良好的保護(hù)作用。特別是本發(fā)明的二聯(lián)疫苗在經(jīng)凍干處理后，其貯存穩(wěn)定性甚至好于甲肝或麻疹病毒單價(jià)減毒活疫苗的凍干制品(參見中國專利申請(qǐng)98120633.6)。實(shí)施例4證明二聯(lián)減毒活疫苗安全性和免疫原性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以敏感動(dòng)物恒河猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)動(dòng)物接種本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗前、后的臨床表現(xiàn)并檢查肝臟和腦組織病理學(xué)改變，以及血清血凝抑制抗體(或中和抗體)的滴度變化，借以評(píng)價(jià)二聯(lián)疫苗的使用安全性和免疫原性。
每組5只體重1.5-4.5kg的血清抗HAV和抗麻疹病毒抗體陰性成年恒河猴，以靜脈內(nèi)途徑接種甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗樣品1.0ml，同時(shí)向每只動(dòng)物每側(cè)顱內(nèi)丘腦部位穿刺接種疫苗樣品0.5ml。接種后觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)麻痺和其他神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)異常表現(xiàn)，連續(xù)觀察21天。于接種后0、4和8周進(jìn)行肝組織穿刺對(duì)動(dòng)物肝臟組織進(jìn)行活體組織病理學(xué)檢查；同時(shí)于接種后0、2、3、4、6和8周采血檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)水平，以及血清抗甲肝病毒和抗麻疹病毒抗體。其中分別以兩種單價(jià)疫苗作為陽性對(duì)照。最后一次組織穿刺和采血后，麻醉下處死動(dòng)物并分離動(dòng)物腦組織，以進(jìn)行腦組織病理學(xué)檢查。
為了檢測(cè)動(dòng)物血清中和抗體滴度(活性)，將兩種已知疫苗病毒分別稀釋至102Log TCDI50/ml病毒滴度。在用本發(fā)明的二聯(lián)減毒疫苗接種動(dòng)物前后，分別采集動(dòng)物血清，于56℃加熱30分鐘將血清滅活，按不同稀釋度稀釋血清并與等體積上述病毒稀釋液混合，以中和血清中的抗病毒抗體。然后用所得中和反應(yīng)產(chǎn)物分別接種人胚肺二倍體細(xì)胞和FL細(xì)胞，并于接種細(xì)胞后7天和28天按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法判定結(jié)果。
本實(shí)施例的結(jié)果如下列表3和表4中所示。其中表3中給出接種1,3,5三個(gè)批號(hào)的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗后0至4周血清SGPT水平(以改良法檢測(cè)，＞25單位/ml為SPGT異常升高)，以及血清抗HAV抗體和抗麻疹病毒血凝抑制(HI)抗體陽性率(數(shù)據(jù)以5只動(dòng)物中抗體陽性動(dòng)物數(shù)的形式給出)。表3動(dòng)物接種二聯(lián)疫苗后0-4周血清轉(zhuǎn)氨酶水平和抗甲肝及抗麻疹抗體陽性率
所給出的數(shù)據(jù)為5只動(dòng)物中在接種后相應(yīng)周數(shù)時(shí)呈陽性抗體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)。表4 動(dòng)物接種甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗前和接種后血清中和抗體滴度<
所給出的數(shù)據(jù)分別為4只或8只動(dòng)物中在相應(yīng)血清稀釋度下呈陽性抗體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)。
從表3和表4所示結(jié)果可以看出，在接種本發(fā)明的甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗4周后，所有被試動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)氨酶均為陰性。而且，活體組織學(xué)檢查表明，所有被試動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)肝組織的異常病理學(xué)改變。臨床觀察和腦組織理學(xué)檢查也未見任何外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物在接種甲肝-麻疹二聯(lián)疫苗后8周血清抗甲型肝炎病毒中和抗體在1∶8稀釋條件下均為陽性。另外，我們還檢測(cè)了動(dòng)物在接種疫苗后作為原發(fā)性感染指征的血清lgM抗體的改變，結(jié)果顯示接種后2周血清lgM呈陽性反應(yīng)，但到第8周時(shí)LgM逐漸消失(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例5證明甲肝-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗安全性和免疫原性的人體試驗(yàn)為了進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的人體臨床適用性，本實(shí)施例進(jìn)一步觀察了人體同時(shí)接種甲肝和麻疹兩種病毒疫苗的臨床效果。
選擇8至12月令健康嬰兒共275人，隨機(jī)分成三組單價(jià)甲肝減毒活疫苗接種組(H)、單價(jià)麻疹減毒活疫苗接種組(M)，和甲肝與麻疹減毒活疫苗聯(lián)合接種組(HM)。所使用的甲肝減毒活疫苗(L-A-I)和麻疹減毒活疫苗(長(zhǎng)-47)(均由衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品所生產(chǎn))的病毒滴度分別為6.5 Log TCID50/ml和4.0Log TCID50/ml。按常規(guī)每人臂部皮下注射甲肝疫苗1.0ml和/或麻疹疫苗0.2ml。接種后72小時(shí)內(nèi)定時(shí)觀察受試者注射部位的局部反應(yīng)及42天內(nèi)的全身反應(yīng)(體溫變化)，并按弱、中、強(qiáng)記錄出現(xiàn)陽性反應(yīng)的人數(shù)。免疫接種后4和8周采血檢測(cè)血清GPT(正常值≤120單位)。使用ELISA試劑盆(Ablott Kit ELISA，美國亞培公司)檢測(cè)血清抗甲肝病毒抗體和抗麻疹HI抗體。
結(jié)果顯示，同時(shí)接種甲肝和麻疹疫苗的103人中，除1.94％出現(xiàn)弱全身反應(yīng)，0.97％出現(xiàn)中度全身反應(yīng)(相應(yīng)的H組中，弱和中度全身反應(yīng)均為0.07％)外，其它被試者均未出現(xiàn)任何局部和全身性反應(yīng)。
抗體滴度分析結(jié)果顯示，在接種單價(jià)甲肝疫苗或聯(lián)合接種甲肝和麻疹疫苗8周后，HM組抗甲肝抗體陽性率為92.27％。H組為93.66％，兩間無顯著性差異(X2=0.021,P＞0.05)。兩組受試者的抗體幾何平均滴度(GMT)分別為5.333±1.025和5.105±0.778，兩組間也無顯著性差異(t=0.165,P＞0.05)。
另外，在接種單價(jià)麻疹疫苗或聯(lián)合接種甲肝和麻疹疫苗8周后，HM組抗麻疹病毒HI抗體陽性率為98.05％,M組為96.66％，兩組間抗體陽性率無顯著性差異(X2=0.021,P＞0.05)。兩組受試者的抗體幾何平均滴度(GMT)分別為16.43±0.289和14.25±0.311，兩組間也無顯著性差異(t=0.165,P＞0.05)。
權(quán)利要求
1．甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，所說的二聯(lián)疫苗組合物含有彼此互不干擾的，分別具有預(yù)防有效的病毒滴度的甲型肝炎減毒活病毒和麻疹減毒活病毒，并且含有或不含病毒疫苗保護(hù)劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，其中甲型肝炎活疫苗的有效病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹活疫苗的有效病毒滴度為103.5-5.0TCID50/ml。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，所說的二聯(lián)疫苗組合物是冷凍干燥形式的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)疫苗組合物，其中所說的病毒活疫苗保護(hù)劑由重量/體積比(w/v)為0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明膠、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸鈉、0.05-0.1％的抗壞血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％山梨醇和0.5-1％的肌醇組成。
5．生產(chǎn)甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法，該方法包括將按常規(guī)方法增殖得到的病毒滴度為105.5-6.5TCID50/ml的甲型肝炎減毒活疫苗原液與病毒滴度為103.5-5.0TCID50/ml的麻疹減毒活疫苗原液按適當(dāng)比例混合。
6．利用同一宿主細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)甲型肝炎-麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法，該方法包括以下步驟1)分別提供按常規(guī)方法傳代減毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒種和減毒的麻疹活疫苗病毒毒種；2)用步驟1)中提供的減毒的甲型肝炎活疫苗病毒接種人胚肺二倍體細(xì)胞并在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所說的細(xì)胞以增殖病毒，當(dāng)甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的陽性感染率達(dá)到75％以上時(shí)，再次接種步驟1)提供的麻疹減毒活疫苗病毒并繼續(xù)培養(yǎng)之；3)當(dāng)甲型肝炎病毒感染細(xì)胞的陽性率達(dá)到90％以上，并且90％以上的二倍體基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)麻疹病毒所致的典型細(xì)胞病變時(shí)，收獲細(xì)胞并分離細(xì)胞培養(yǎng)物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活病毒疫苗原液。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的甲型肝炎病毒感染二倍體細(xì)胞基質(zhì)的感染率是用標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光法監(jiān)測(cè)的。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的方法進(jìn)一步包括將按步驟3)得到的含甲型肝炎-麻疹減毒二聯(lián)活疫苗病毒原液按大約1∶1的比例與適當(dāng)?shù)牟《净钜呙绫Ｗo(hù)劑混合，并按常規(guī)方法冷凍干燥之。
9．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的病毒活疫苗保護(hù)劑基本上由重量/體積比(w/v)為0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明膠、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸鈉、0.05-0.1％的抗壞血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％的山梨醇和0.5-1％的肌醇組成。
10．制備根據(jù)權(quán)利要求6至9中的任何一項(xiàng)的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)活疫苗的冷凍干燥制劑的方法，該方法包括1)分別提供具有有效病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，以得到混合的懸液形式的甲型肝炎-麻疹二聯(lián)病毒活疫苗；2)在步驟1)中所述的二聯(lián)病毒活疫苗原液中，按大約1∶1(v/v)的比例加入如權(quán)利要求9所限定的病毒活疫苗保護(hù)劑并均勻混合之；3)冷凍干燥步驟2)中得到的疫苗組合物。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說的步驟3)包括首先將所說的疫苗組合物于大約-20至-50℃的溫度下預(yù)冷凍3至6小時(shí)，然后在適當(dāng)?shù)膬龈裳b置中于28-35℃下真空干燥10至20小時(shí)。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說的甲肝病毒有效滴度為105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒有效滴度為103.5-5.0TCID50/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有預(yù)防有效的病毒滴度的甲型肝炎－麻疹二聯(lián)減毒活疫苗及其冷凍干燥制劑。本發(fā)明還公開了基于同一宿主細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)甲型肝炎－麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的方法,以及利用病毒疫苗保護(hù)劑生產(chǎn)所說的甲型肝炎－麻疹二聯(lián)減毒活疫苗的冷凍干燥制劑的方法。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1217212SQ98124548
公開日1999年5月26日 申請(qǐng)日期1998年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月12日
發(fā)明者王鵬富, 劉景曄, 李光譜, 南一范, 王美樺, 王瑋, 郭建君, 謝寶生, 宋宗明, 屈翠波, 劉麗莎, 黃金鳳, 萬宗舉 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所