專利名稱：抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來自銅綠色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的新型抗原，涉及其在醫(yī)藥、特別是在疫苗制備和診斷中的用途。
銅綠色假單胞菌是一種棒狀的革蘭氏陰性好氧性游動細菌。它是一種環(huán)境中廣泛存在的胞外條件性病原菌，在受試者上引起明顯致病性和死亡率。在帶有囊性纖維化、燒灼傷、慢性支氣管炎、支氣管擴張和癌癥的受試者中有特別明顯的感染。
免疫應(yīng)答的鑒定、候選疫苗的尋找以及用于診斷試驗的合適成分均使人們的注意力集中到銅綠色假單胞菌的組成成分上。銅綠色假單胞菌的外膜含有毒素，包括脂多糖內(nèi)毒素、磷脂和蛋白質(zhì)。多種銅綠色假單胞菌的外膜蛋白質(zhì)(Opr)已按字母命名系統(tǒng)命名。雖然已用這種方式表征了數(shù)種蛋白質(zhì)，其中的一些蛋白質(zhì)僅短暫表達，且高度依賴于可獲得的養(yǎng)分、培養(yǎng)條件及抗生素的存在。目前，稱為F、H2和I的三種主要的Opr已在所有銅綠色假單胞菌菌株中識別為有共同的抗原性，且以高拷貝數(shù)表達。
我們目前已鑒定了一種來自銅綠色假單胞菌外膜制劑的蛋白質(zhì)，我們稱之為Pa60。此蛋白質(zhì)的氨基末端序列不與其它先前表征過的蛋白南(Genbamk數(shù)據(jù)檢索)顯示任何序列同源性。此蛋白質(zhì)有抗原性，且能引起導(dǎo)致銅綠色假單胞菌加速消除的防御性免疫應(yīng)答。
因此，在本發(fā)明的一個方面中提供了來自銅綠色假單胞菌的蛋白質(zhì)抗原，如SDS-PAGE測得，其分子量范圍為約60KDa至約65KDa，在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)具有下列N末端序列？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A；和優(yōu)選地
？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V- ？-N-A完整蛋白質(zhì)的一部分或片段自身可以有抗原性，因此在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗原性片段。特別的，該抗原性片段包含如上所述的N-末端序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，片段的序列上的某些變化是可能的，其仍保留抗原性特性?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法檢測片段和/或其變體的抗原性。這些變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)或其片段可以以純化或經(jīng)分離的制劑形式單獨提供，或作為與其它銅綠色假單胞菌抗原蛋白質(zhì)的混合物的部分提供。
因此，在第三方面本發(fā)明提供了一種抗原組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種蛋白質(zhì)和/或其一種或多種抗原性片段。這種組合物可用于銅綠色假單胞菌的檢測和/或診斷。在一個實施方案中，組合物包括一種或多種額外的銅綠色假單胞菌抗原。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌的方法，其包括(a)將待檢測的樣本與本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)、或其抗原性片段或一種抗原組合物接觸；且(b)檢測針對銅綠色假單胞菌的抗體的存在。
特別的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物可用于檢測IgG抗體。適當(dāng)?shù)?，待檢測的樣本為生物學(xué)樣本，如血液或唾液樣本。
在第五方面，本發(fā)明提供了在檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌中本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物的用途。優(yōu)選的，檢測和/或診斷在體外進行。
本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物可以作為試劑盒的部分的形式提供，用于銅綠色假單胞菌的體外檢測和/或診斷。因此，本發(fā)明的第六方面中提供用于檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌的試劑盒，其包括本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物。
另外，本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)或其抗原性片段可用于誘導(dǎo)一種針對銅綠色假單胞菌的免疫反應(yīng)。因此，在又一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的一種抗原、其片段或本發(fā)明的抗原組合物在醫(yī)學(xué)上的用途。
在又一方面，本發(fā)明提供了一種能在受試者中引發(fā)免疫反應(yīng)的組合物，其包含一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其一種或多種抗原性片段。適當(dāng)?shù)兀摻M合物為一種疫苗組合物，任選地，其包含一種或其它合適的佐劑。這種疫苗組合物可以是預(yù)防性或治療性的疫苗組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物可包括一種或多種佐劑。佐劑的例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，包括無機性膠體諸如氫氧化鋁或油包水型乳劑，諸如弗氏不完全佐劑。其它有用的佐劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。
在又一方面，本發(fā)明提供了(a)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其一種或多種抗原性片段在制備一種致免疫組合物，優(yōu)選地為疫苗中的用途；(b)這種致免疫組合物在誘導(dǎo)受試者免疫反應(yīng)中的用途；和(c)一種用于在受試者中治療或預(yù)防銅綠色假單胞菌感染的方法，其包括如下步驟向受試者施用一種有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)、至少一種抗原性片段或抗原組合物，優(yōu)選的為疫苗。
本發(fā)明各個方面的優(yōu)選的特點對于每一其它方面在細節(jié)上已作必要的修正。
本發(fā)明參照下列實施例加以描述，其不應(yīng)認(rèn)為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。
實施例中的涉及附圖

圖1Pa60的SDS-PAGE分析。實施例1蛋白質(zhì)純化從過夜培養(yǎng)的100個瓊脂平板上收集銅綠色假單胞菌菌株385(Pa385)的菌，方法是刮平板后，洗板兩次，4℃下10,000×g離心10分鐘。用經(jīng)緩沖的Zwittergent3-14去污劑提取外膜組分，且用乙醇沉淀。
冷凍干燥外膜提取物，重懸于出發(fā)緩沖液(20mM Tris，pH8.5)。將此制劑經(jīng)Q2柱(Bio Rad)陰離子交換層析和氯化鈉梯度洗脫蛋白質(zhì)。從柱上洗脫的級分用分析型SDS-PAGE初步鑒定蛋白質(zhì)組成。由此測定Pa60的洗脫分布圖，使之從隨后的柱層析中收集含有Pa60的級分用于進一步純化。將這些級分對蒸餾水透析，冷凍干燥，重懸于最少量的蒸餾水中，且進一步溶于4倍體積的十二烷基硫酸鈉(SDS)還原緩沖液(62.5mM Tris，pH6.8，10％(V/V)甘油，2％(W/V)SDS，5％(V/V)β-巰基乙醇，1.2×10-3％(W/V)溴酚藍)。將SDS制備物在37℃溫育至少30分鐘后，上樣于電泳柱的堆積膠。
Pa60用制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳純化(PAGE)。利用聚合在28mm(內(nèi)徑)柱中9％T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N，N′ -亞甲基-雙丙烯酰胺)分離膠和10ml 4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS堆積膠通過BioRad 491型制備槽進行制備型SDS-PAGE。從柱中洗脫的級分經(jīng)過冷凍干燥加以濃縮，且用分析型SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)成分。利用這些條件分離的Pa60所含的SDS隨后用磷酸鉀沉淀去除。合并含有Pa60的級分且透析，然后用于測定蛋白質(zhì)濃度。
利用分析型SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)的分析鑒定，方法是用10-15％的梯度丙烯酰胺凝膠或用均質(zhì)12.5％的丙烯酰胺凝膠，且用考馬斯藍或銀染。用Pierce微量BCA檢驗確定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果通過上述方法成功地從銅綠色假單胞菌蛋白質(zhì)中分離了Pa60。圖1顯示此蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上的位置。實施例2 Pa60的N-末端測序通過從SDS-PAGE凝膠上切割出含有該蛋白質(zhì)的區(qū)域制備用于N-末端氨基酸分析的Pa60。將凝膠片段送到生物分子資源中心，澳大利亞國立大學(xué)，堪培拉，澳大利亞和MUCAB中心，Macquarie大學(xué)，North ryde，NSW，澳大利亞。結(jié)果獲得了N-末端氨基酸序列，鑒定了前十九個氨基酸中的十六個。鑒定了其余的殘基和用可能的鑒定不能確定處之可能的氨基酸。
序列12345678910確定的 EEK L或然的T P TTA可能的S A L/SAI/D W11 12 13 14 15 16 17 18 19確定的VV NA或然的A AP可能的F/L G/S ND于是獲得帶有如下確定氨基酸的序列1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A如果包括或然的氨基酸，則得到如下序列1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A實施例3在大鼠模型中免疫接種后的細菌消除特定的無致病原雄性大鼠于第1天接受淋巴結(jié)內(nèi)(IPP)免疫接種后，于第14天受到活菌攻擊。麻醉鎮(zhèn)靜動物。通過中線腹部切口暴露小腸，利用27號針頭向每一淋巴結(jié)膜下注射抗原。免疫接種蛋白質(zhì)(Pa60)是這樣制備的將每毫升200或800μg蛋白質(zhì)與1∶1的比例之弗氏不完全佐劑(IFA)和磷酸緩沖鹽液(PBS)乳化。向每只動物施用總接種量分別為10或40μg的蛋白質(zhì)。免疫接種14天后用活菌(細菌數(shù)5×105CFU)攻擊動物4小時。細菌在5％CO2和37℃條件下在營養(yǎng)瓊脂平板上生長過夜，回收、清洗且重懸于PBS中達到要求的濃度。經(jīng)氣管內(nèi)導(dǎo)管將細菌導(dǎo)入肺部，4小時后將大鼠處以安死術(shù)。收集血液，且將等份血清貯存于-20℃用于抗體分析。用5×2ml PBS沖洗肺進行灌洗，收集洗液(BAL)用于鑒定細菌數(shù)。肺灌洗后，移出肺，勻漿后鑒定細菌數(shù)。制備切片用于測定肺灌洗液中不同的細胞數(shù)。肺灌洗液中總細胞數(shù)目通過臺盼藍染色計算，用血細胞計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果用Pa60免疫接種且用Pa385同系菌株的活菌于第14天攻擊的大鼠顯示增強的細菌清除。用10μg或40μg Pa60免疫的大鼠在4小時后從BAL和肺回收的菌數(shù)均低于非免疫組(表1)。
在Pa60免疫接種動物中存在更多數(shù)目的吞噬細胞，且在這些動物中與增強的細菌清除相關(guān)(表2)表1用Pa60免疫接種和用銅綠色假單胞菌(菌株385)攻擊后的肺清除
表2細菌攻擊后BAL中吞噬細胞數(shù)量
實施例4臨床診斷研究來自墨爾本皇家兒童醫(yī)院的已經(jīng)診斷為囊性纖維化的孩子為本研究提供了樣本。支氣管肺泡灌洗液(BAL)血清自患者為嬰兒的診斷時開始收集3-4年以上。依銅綠色假單胞菌的臨床狀況將樣本分成幾組組1非囊性纖維化對照(年齡與帶有喘鳴的孩子相對應(yīng))；組2銅綠色假單胞菌陰性；組3銅綠色假單胞菌上呼吸道分離物，下呼吸道陰性；組4下呼吸道中消除的銅綠色假單胞菌(隨后BAL樣本中陰性)；和圖5BAL連續(xù)樣本中銅綠色假單胞菌陽性。
用酶聯(lián)免疫吸附試驗(EIISA)在BAL和血清樣本中檢測針對Pa60的抗體。用濃度為每毫升1μg的純化的Pa60包被多吸附(Polysorb)微量滴定孔。在溫育步驟之間用含有0.05％Tween 20的PBS洗板5次。用脫脂牛奶在PBS-0.05％Tween 20中封閉孔60分鐘。將孔與由用于分析的封閉緩沖液稀釋的血清或BAL樣品溫育90分鐘。所用的偶聯(lián)的免疫球蛋白為免抗人IgG、IgA和IgM，且孔與偶聯(lián)的免疫球蛋白溫育90分鐘。然后將板顯色。用人IgG、IgA和IgM定量抗體。結(jié)果當(dāng)出現(xiàn)銅綠色假單胞菌感染時同時觀察到抗體滴度增加。非囊性纖維化對照組和非感染的囊性纖維化組病人對Pa60的滴度可忽略不計。特別是在帶有來自BAL(組5)的連續(xù)銅綠色假單胞菌培養(yǎng)物患者中可觀察到針對Pa60的IgG滴度增加。表3來自囊性纖維化和非囊性纖維化孩子的血清和支氣管肺泡灌洗液的Pa60-特異性抗體
實施例5用Pa60體液免疫后用銅綠色假單胞菌肺部攻擊大鼠用Pa60如此免疫DA大鼠向大鼠腸淋巴結(jié)(IPP)施用10μgPa60。Pa60以在弗氏不完全佐劑中乳化的形式輸送。IPP后14天，全部經(jīng)免疫的大鼠用溶于磷酸緩沖鹽液中的10μgPa60于氣管內(nèi)(IT)接受加強免疫。IT加強免疫7天后，經(jīng)IT施用5×108CFU活銅綠色假單胞菌攻擊免疫組和未處理的對照組。于攻擊后4小時處死大鼠，收集樣本用于分析。結(jié)果細菌清除在支氣管肺泡灌洗液(BAL)和肺組織中的細菌回收
*數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)方差均值(±SEM)表示+動物數(shù)目用IPP免疫且于第14天IT加強免疫的大鼠從BAL和肺組中均可顯著清除銅綠色假單胞菌。
針對感染的白細胞募集
*數(shù)據(jù)代表標(biāo)準(zhǔn)方差均值(±SEM)用Pa60免疫的大鼠，遭受細菌攻擊后更為迅速的向肺中募集白細胞。幾乎全部于BAL中回收的白細胞均為多形核嗜中性白細胞(PMN)或巨噬細胞。向支氣管肺泡空間早期募集白細胞與細菌清除相關(guān)?？贵w反應(yīng)用Pa60體液免疫后血清和BAL中的抗體血清中的抗體
*以ELISA單位表示IgG、IgA和IgM。
在經(jīng)免疫的大鼠中檢測針對Pa60的血清抗體。有IgG、IgA和IgM的明顯滴度。BAL中的抗體
>*以ELISA單位表示IgG、IgA和IgM。
在經(jīng)免疫的動物BAL中檢測針對Pa60的抗體。特異于Pa60的IgG和IgA均有明顯滴度。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名AUSPHARM國際有限公司(B)街道First Floor，OSPREY HOUSE(C)城市LOWER SQUARE，ISLEWORTH(D)州MIDDLESEX(E)國家英國(F)郵政編碼(ZIP)TW76BN(ii)發(fā)明名稱抗原(iii)序列數(shù)目4(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朩O PCT/GB98/00217(2)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(vi)原始來源(A)生物銅綠色假單胞菌(xi)SEQ ID No1的序列描述Xaa Glu Glu Lys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Val1 5 10 15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No2的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(vi)原始來源(A)生物銅綠色假單胞菌(xi)SEQ ID No2的序列描述Xaa Glu Glu Lys Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Xaa Ala Pro Val Val1 5 10 15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No3的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(vi)原始來源(A)生物銅綠色假單胞菌(xi)SEQ ID No3的序列描述Xaa Glu Glu Lys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Val1 5 10 15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No4的信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(vi)原始來源(A)生物銅綠色假單胞菌(xi)SEQ ID No4的序列描述Xaa Glu Glu Lys Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Xaa Ala Pro Val Val1 5 10 15Xaa Asn Ala
權(quán)利要求
1.一種來自銅綠色假單胞菌的外膜蛋白質(zhì)抗原，其具有范圍從約60KDa至約65KDa的分子量，如SDS-PAGE所測。
2.如權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)抗原，其具有如下的N-端序列？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
3.如權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)抗原，其具有如下的N-端序列？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
4.一種如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)的抗原性片段。
5.如權(quán)利要求4的抗原性片段，其包括序列？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
6.如權(quán)利要求5的抗原性片段，其包括序列？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
7.一種抗原組合物，其包括如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)，或至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段。
8.如權(quán)利要求7的抗原組合物，其還包含一種或多種其它銅綠色假單胞菌抗原。
9.如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物在檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌中的用途。
10.一種檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌的方法，其包括(a)將如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物與待測樣品接觸；和(b)檢測針對銅綠色假單胞菌的抗體。
11.一種在罹受囊性纖維化的受試者中診斷銅綠色假單胞菌的方法，其包括(a)將如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物與獲自受試者的生物學(xué)樣品接觸；和(b)檢測針對銅綠色假單胞菌的抗體。
12.如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法，其中樣本為粘液樣本，如唾液。
13.一種如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物在檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌中的用途。
14.如權(quán)利要求10至12中任一項的方法或如權(quán)利要求3的用途，其中檢測和/或診斷在體外進行。
15.一種用于檢測和/或診斷銅綠色假單胞菌的試劑盒，其包含如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物。
16.一種在受試者中能引發(fā)免疫反應(yīng)的組合物，其包含如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物。
17.如權(quán)利要求16的組合物，其是一種疫苗組合物，任選地還包括一種或多種佐劑。
18.如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物在醫(yī)藥中的用途。
19.如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物在制備致免疫組合物優(yōu)選為疫苗中的用途。
20.如權(quán)利要求19中定義的致免疫組合物在受試者中誘發(fā)免疫反應(yīng)的用途。
21.一種在受試者中治療或預(yù)防銅綠色假單胞菌感染的方法，其包括向受試者施用有效量的如權(quán)利要求1至3中任一項定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求4至6中任一項定義的抗原性片段或者如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中定義的抗原組合物的步驟。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中受試者罹受囊性纖維化。
23.如權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)、一種或多種抗原性片段或抗原組合物以疫苗的形式施用。
24.一種含有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
25.一種含有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
全文摘要
提供了一種來自銅綠色假單胞菌(P.aeruginosa)的抗原。也提供了該抗原在檢測/診斷銅綠色假單胞菌中的用途以及其在產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答中的用途。
文檔編號A61P31/04GK1244203SQ9880197
公開日2000年2月9日 申請日期1998年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月24日
發(fā)明者A·W·克里普斯, J·基德, M·鄧克利, R·L·克蘭西 申請人:奧斯法姆國際有限公司