專(zhuān)利名稱(chēng)：堿性橙半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及堿性橙半抗原、人工抗原和抗體的制備 方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堿性橙，化學(xué)名為2，4- 二胺基偶氮苯，俗名“王金黃“，是一種偶氮類(lèi)堿性工業(yè)染 料，用于腈綸、蠶絲、羊毛、二醋纖單寧媒纖維的染色，也可以用于皮革麻的染色和竹、木、紙 張、蚊香的著色及制造色淀、溶劑染料、陽(yáng)離子染料。堿性橙在體內(nèi)代謝成胺類(lèi)，有強(qiáng)致癌性。根據(jù)美國(guó)衛(wèi)生研究所(OTH)化學(xué)品健康 與安全數(shù)據(jù)庫(kù)資料表明攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會(huì)造成急性和慢性的中毒傷害。 根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(G B2760)及《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生 法》的相關(guān)規(guī)定，該物質(zhì)為禁止用作食品添加劑的化學(xué)制品。由于在中性及偏堿性條件下，堿性橙與蛋白質(zhì)吸附較牢固，不易褪色，因此有些不 法商人就將其用于豆制品的染色，使腐竹、豆皮的色澤光亮，欺騙消費(fèi)者，使消費(fèi)者的身體 健康受到嚴(yán)重影響。對(duì)堿性橙殘留的檢測(cè)具有重要的意義。對(duì)堿性橙殘留的檢測(cè)目前主要要有薄層層析(TLC)、高效液相色譜/紫外檢測(cè)器 (HPLC/UVD)、高效液相色譜/光電二級(jí)管陳列(HPLC/PDA)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GS-MS)等方法。這些儀器檢測(cè)方法操作復(fù)雜、需受過(guò)專(zhuān)門(mén)訓(xùn)練的專(zhuān) 業(yè)人員才能操作，而且存在著適用范圍窄、設(shè)備昂貴、成本高等問(wèn)題。目前我國(guó)相應(yīng)的堿性 橙檢測(cè)技術(shù)不完備，很有必要研制更加簡(jiǎn)單快捷方便的檢測(cè)方法和產(chǎn)品。免疫檢測(cè)方法應(yīng)用于堿性橙的檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)單快捷。免疫檢測(cè)方法包括膠體金免疫 層析法、ELISA法，是目前食品安全快速檢測(cè)的兩種重要方法，已經(jīng)在食品安全檢測(cè)中發(fā)揮 著越來(lái)越明顯的作用。免疫檢測(cè)方法都必須首先制備出堿性橙半抗原、抗原及抗體，然后才 能利用這些試劑建立免疫檢測(cè)方法。胥傳來(lái)等公開(kāi)了一種專(zhuān)利《一種堿性橙II完全抗原的合成方法》(申請(qǐng)?zhí)?200910031728. X),以堿性橙II為半抗原，用重氮化法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備 抗體；趙志磊等公開(kāi)了一種專(zhuān)利《堿性橙人工抗原合成及抗體制備方法》(申請(qǐng)?zhí)?200810079538. 0)，以戊二醛為偶聯(lián)劑分別與牛血清白蛋白。但是，堿性橙與很多偶氮類(lèi)燃料很類(lèi)似，其苯環(huán)上的氨基數(shù)目及位置是區(qū)別于其 他染料的特征結(jié)構(gòu)，在半抗原設(shè)計(jì)時(shí)若不保留特征結(jié)構(gòu)，抗體的特異性將受到很大影響。因此，需要尋找新的方法，在半抗原設(shè)計(jì)時(shí)能保留堿性橙的特征結(jié)構(gòu)，保證抗體的 特異性才能獲得理想的檢測(cè)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是填補(bǔ)堿性橙現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種堿性橙人工半抗 原、人工抗原和特異性抗體。
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本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述堿性橙人工半抗原、人工抗原和特異性抗體的制 備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述堿性橙人工半抗原、人工抗原和特異性抗體的應(yīng) 用。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 提供一種堿性橙人工半抗原、人工抗原和特異性抗體，所述堿性橙人工半抗原具 或式(II)所示結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
一種堿性橙人工半抗原，其特征在于具有式(I)或式(II)所示結(jié)構(gòu)其中，式(I)或式(II)中n＝0～3。FSA00000234666000011.tif
2.—種權(quán)利要求1所述堿性橙半抗原的制備方法，其特征在于是以間苯二胺與對(duì)氨基 苯酸或間氨基苯酸通過(guò)重氮化反應(yīng)生成含羧基的半抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將對(duì)氨基苯酸或間氨基苯酸1 3mmol溶于20ml水中，加入IOml0. lmol/1的鹽 酸，加入含1. 15 3. 3mmol的亞硝酸鈉水溶液lmL，反應(yīng)2h，反應(yīng)液為重氮液；(2)將1 3倍于對(duì)氨基苯酸或間氨基苯酸物質(zhì)的量的間苯二胺溶于5mL水中，用 lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6 7，然后逐滴加入步驟(1)制備得到的重氮液，靜置過(guò)夜，離心 所得沉淀即為半抗原。
4.一種堿性橙人工抗原，其特征在于具有式(III)或式(IV)所示結(jié)構(gòu)
5.一種權(quán)利要求4所述抗原的制備方法，其特征在于可用活潑脂法制備，步驟如下(1)將權(quán)利要求1所述的或權(quán)利要求2或3制備得到的半抗原5 IOmg溶解于1 3ml 二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中，加入5 IOmg 二環(huán)己基碳二亞胺和5 IOmg N-羥基琥 珀酰亞胺，反應(yīng)3. 5 5h，離心除去沉淀得上清；(2)將上清滴入2mLpH值為7. 4 9. 6、lmol/L含有10mg/mL載體蛋白的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，反應(yīng)8 12h，用0. 85%的生理鹽水透析4天得所述抗原。
6.一種權(quán)利要求4所述抗原的制備方法，其特征在于還可按照混合酸酐法制備，步驟 如下(1)將權(quán)利要求1所述半抗原5 IOmg溶解于1 3ml二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中， 加入5 IOmg加入氯甲酸異丁酯，攪拌反應(yīng)0. 5 2h，得甲液；(2)將載體蛋白10 20mg溶于1 2mLlmol/L、pH 9. 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液 中，得乙液；(3)將甲液緩慢滴加到乙液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)液用0.85%的生理鹽水透析4天得 抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、 匙孔血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
8.—種權(quán)利要求4所述堿性橙抗原的應(yīng)用，其特征在于是可應(yīng)用制備堿性橙多克隆抗 體或單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于所述堿性橙抗原或堿性橙多克隆抗體或單克 隆抗體應(yīng)用于食品樣品中的堿性橙殘留檢測(cè)方面。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種堿性橙半抗原、人工抗原、抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明以間苯二胺與對(duì)氨基苯酸或間氨基苯酸通過(guò)重氮化反應(yīng)生成含羧基的半抗原；通過(guò)活潑酯法或者混合酸酐法將所述半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原；以所述人工抗原制備得到堿性橙特異性抗體。所述抗體可用于堿性橙免疫檢測(cè)，對(duì)實(shí)現(xiàn)堿性橙的安全監(jiān)控具有重要實(shí)際應(yīng)用意義。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101962343SQ20101025694
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者劉珒, 孫遠(yuǎn)明, 宋利軍, 王強(qiáng), 雷紅濤 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)