專利名稱：呼吸合胞病毒的吸附(g)蛋白衍生的肽的制作方法
相關申請本申請要求1997年9月19日美國臨時申請60/059,684與1998年5月8日美國臨時申請60/084,863的權利，以上兩申請的內容在此作為參考。
RSV含兩種主要的外包膜糖蛋白，融合(F)蛋白與吸附(G)蛋白，它們對病毒的感染性具有重要意義，因此當然地成為設計RSV亞單位疫苗所針對的目標。已知，基于F蛋白的疫苗所產生的RSV中和抗體會因包含G蛋白而顯著增加(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。但是，在試圖理解FI-RSV誘導病情加重的分子基礎時已經發(fā)現，天然RSV吸附(G)蛋白足以引發(fā)非典型性肺炎，其特征是肺嗜酸粒細胞增多伴TH2細胞因子白介素-5(IL-5)產生水平升高(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。實際上，體內去除IL-5顯著降低了G蛋白免疫后被RSV攻擊的小鼠支氣管肺泡的灌洗液細胞中的嗜酸粒細胞應答。對G蛋白的應答被認為是將G蛋白特異性CD4+T細胞系轉移到幼稚受體小鼠內而由T細胞介導的，造成在隨后受攻擊時發(fā)生非典型性肺炎(Alwan等，J.Exp.Med.17981-89(1994))。
體內去除CD4+細胞使接種了肽19結合物的小鼠不發(fā)生肺嗜酸粒細胞增多，而去除CD8+特異性細胞則幾乎沒有作用(圖8)。以上信息表明，在對活RSV攻擊的應答中，RSV G蛋白的肽19與CD4+T細胞介導的肺嗜酸粒細胞增多有關聯，說明是肽19特異性CD4+T細胞引起了肺嗜酸粒細胞增多。在對43名人供血者的外周血細胞的分析中，6人對RSV G蛋白有應答，3人對肽19有應答(圖7)。該信息提示，肽19可能參與了支氣管炎、特異反應和哮喘的發(fā)病過程，這些疾病有時會在血清陰性嬰兒受RSV感染后見到(Welliver和Welliver，Pediatrics inReview 14134-139(1993))。
所以，本發(fā)明涉及改變了的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。在一個具體的實施例中，被加重的病情是非典型性肺炎，具體是肺嗜酸粒細胞增多。在實施例之一中，所述的改變位于RSV G蛋白的氨基酸184-198區(qū)域內。另一實施例中，改變的結果是，與野生型G蛋白相比，改變后的G蛋白或多肽抑制IL-5分泌的引發(fā)。
本發(fā)明還涉及編碼被改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改變的蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。實施例之一中，所述改變位于RSV G蛋白的氨基酸184-198區(qū)域內。
本發(fā)明還包括包含所述核酸分子與調控序列操作性連接的DNA結構。一具體實施例中，本發(fā)明涉及一種嵌合DNA結構，它包含(a)編碼被改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改變的蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情；(b)編碼完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的核酸分子；和(c)與F蛋白和改變的G蛋白操作性連接的調控序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明DNA結構的重組宿主細胞，以及生產改變的RSVG蛋白或多肽的方法，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，所述的方法包括將本發(fā)明的重組宿主細胞維持在適合表達改變的G蛋白或多肽的條件下。
本發(fā)明還涉及生產包含改變后RSV G蛋白或多肽，以及完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的嵌合多肽的方法，所述改變的RSV G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
本發(fā)明還涉及改變的G蛋白或多肽，或表達所述蛋白或多肽的重組宿主細胞的用途，即用于制藥，例如疫苗。
本發(fā)明還進一步涉及包含生理學上認可的介質與改變的RSV G蛋白或多肽的免疫原性組合物，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。一具體實施例中，與包含野生型G蛋白的免疫原性組合物相比，上述免疫原性組合物抑制IL-5分泌的引發(fā)。實施例之一中，所述的改變位于RSV G蛋白的氨基酸184-198區(qū)域內。免疫原性組合物還可以包含完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分。
本發(fā)明還涉及包含免疫有效量改變的RSV G蛋白或多肽的疫苗組合物，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。實施例之一中，所述的改變位于RSV G蛋白的氨基酸184-198區(qū)域內。疫苗組合物還可以包含完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分。具體實施例中，疫苗組合物還包含佐劑。
本發(fā)明還進一步涉及在脊椎動物接種并隨后感染RSV后抑制病情加重的方法，包括給予改變的RSV G蛋白或多肽，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
本發(fā)明還涉及包含生理學上認可的載體和有效量編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的疫苗，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。實施例之一中，所述疫苗還包含轉染促進劑。
本發(fā)明還涉及在脊椎動物體內誘導免疫應答的方法，包括給所述脊椎動物以誘導免疫應答有效量的編碼改變的RSV G蛋白或多肽的DNA，可以同時給予轉染促進劑，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
本發(fā)明還涉及對脊椎動物進行抗RSV免疫的方法，包括給予脊椎動物包含免疫有效量的改變的RSV G蛋白或多肽的組合物，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
本發(fā)明還涉及對脊椎動物進行抗RSV免疫的方法，包括給予脊椎動物包含免疫有效量的編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的組合物，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物后提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
實施例之一中，組合物還包含免疫有效量的完整RSV F蛋白或其免疫原性部分，或免疫有效量的編碼完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的核酸分子。另一實施例中，脊椎動物是RSV血清陰性的人。
圖2是合成肽列表(SEQ ID NO.1-31)，對應于RSV G蛋白的重疊區(qū)。GenosysBiotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成了一系列重疊肽。這些肽跨RSV A2G蛋白的氨基酸48(對應于G蛋白的第二翻譯起始密碼子)至294區(qū)域。用質譜法測定肽的純度。將冷凍干燥的肽溶解在無菌水中，濃度為2mg/ml，保存于-20℃。
圖3是反映用G蛋白衍生肽刺激G蛋白初次免疫后BALB/c小鼠脾細胞的柱狀圖。在第0和4周，給BALB/c小鼠接種1μgG蛋白和StimulonTMQS-21佐劑。二次接種兩周后，取5只小鼠分離出脾細胞，匯集后在抗原存在下培養(yǎng)4天。給予50μg/ml的每種合成肽。給予0.5和2.5μg/ml的天然G蛋白。伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激脾細胞得到的平均cpm為94,746+8005。作為對照，只用介質(Med)或CRM197(CRM)刺激培養(yǎng)物。給出的數據是一式三格的平均值(±SD)。該實驗代表著5次獨立的實驗，每次都顯示質量上相似的結果。
圖4A和4B是顯示培養(yǎng)物上清液中肽誘導細胞因子(IFN-γ和IL-5)分析的柱狀圖。和圖3一樣，將接種了天然G蛋白和StimulonTMQS-21佐劑的BALB/c小鼠脾細胞與肽抗原一起培養(yǎng)。4天后，從一式三格中取100μl上清液匯合，然后用抗原捕捉ELISA分析IFN-γ(圖4A)和IL-5(圖4B)。給出的數據是兩次細胞因子分析的平均OD490。
圖5是肽19在BALB/c小鼠內特異性誘導肺嗜酸粒細胞增多的柱狀圖。接種了G蛋白或19-KLH的小鼠與接受PBS或KLH的對照小鼠相比，有明顯的差異(*)。給出的數據代表了結果相似的三次實驗。
圖6是鑒定肽19內促進嗜酸粒細胞增多應答的T細胞表位的柱狀圖。在第0和4周，給BALB/c小鼠(5只一組)肌內接種純化天然RSV G蛋白1μg與20μgStimulonTMQS-21佐劑；250μg肽19-KLH；250μg肽22-KLH；250μg突變肽19-1-KLH或250μg突變肽19-2-KLH，或鼻內接種含106pfu的50μl活RSV。二次接種2周后，用活RSV攻擊小鼠，7天后，定量分析BAL中的肺嗜酸粒細胞增多。給出的數據是BAL中嗜酸粒細胞的平均百分比(±標準偏差)。
圖7是人PBMC對G蛋白衍生肽的增殖性應答柱狀圖。43名供血者中6人的PBMC對RSV G蛋白有應答，在合成肽19和22存在下培養(yǎng)這些PBMC進行增殖試驗。各肽的濃度位50μg/ml。純化G蛋白的濃度為3μg/ml。PHA刺激全部供血者PBMC的結果在22,945至55,619cpm之間。還單獨以介質培養(yǎng)PBMC，并計算刺激指數。給出的是一式三份培養(yǎng)物得出的平均刺激指數。
圖8是顯示CD4 T細胞介導由RSV G蛋白和肽19-KHL誘導的嗜酸粒細胞增多應答的表格。在第0和4周，給BALB/c小鼠(5只一組)肌內接種純化天然RSV G蛋白1μg與20μg StimulonTMQS-21佐劑；250μg含18μg肽19的KLH和StimulonTMQS-21佐劑，或鼻內接種含106pfu的50μl活RSV。為了去除T細胞亞型，在末次免疫后14天和20天后，腹腔內給予所示的單克隆抗體(或作為對照的大鼠Ig)，劑量分別為每鼠750μg和250μg。末次接種后21天，用活RSV攻擊小鼠，7天后定量分析BAL中的嗜酸粒細胞。用抗CD4和抗CD8熒光抗體進行FACS分析。給出的數據是嗜酸粒細胞占BAL的平均百分比(±標準偏差)，和作為脾淋巴細胞總數的函數的CD4細胞比CD8細胞的百分比。與同樣接種，接受大鼠Ig的對照小鼠相比，差異明顯(**)。
詳細說明RSV G蛋白顯著加強F蛋白保護BALB/c小鼠抵抗攻擊的能力(表)。這提示應將G蛋白加入RSV的亞單位疫苗。然而，G蛋白引發(fā)的肺嗜酸粒細胞增多持久而廣泛，使其不適合用作疫苗。在對接種小鼠受攻擊后進入BAL的白細胞進行的動力學定量分析中可以看出，在接種G蛋白的小鼠中，最大的細胞浸潤(1.42×106個細胞)發(fā)生在第7天(

圖1)。在接種G蛋白后10天的應答過程中，始終觀察到嗜酸粒細胞，在第7天達到最大值，占白細胞總數的65％(圖1B)。
本發(fā)明還涉及合成RSV G蛋白衍生的蛋白和/或多肽，它們不會在隨后受RSV感染時刺激肺嗜酸粒細胞增多。具體地說，在此所述的工作涉及制備包含改變的G蛋白或多肽的組合物和方法，所述的蛋白或多肽可作為免疫原用于疫苗制劑，包括多價疫苗，并可用于主動免疫。這一策略包括改變G蛋白序列特定區(qū)域內的一個或多個氨基酸，形成衍生自RSV G蛋白，具有免疫原性但不會引發(fā)非典型性肺炎(例如肺嗜酸粒細胞增多)或任何形式RSV疾病加重的蛋白或多肽。
野生型(天然)RSV G蛋白的核苷酸和氨基酸序列在本領域是已知的(Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924075-4079(1985)；Satake等，Nucl.Acids.Res.13(21)7795-7810(1985))。在此，“改變”或類似的表達表示不同于野生型序列的氨基酸序列，以及編碼的氨基酸序列不同于野生型氨基酸序列的核苷酸序列。所述的改變包括一個或多個核苷酸或氨基酸的插入，缺失和/或取代。
例如，改變可以是一個或多個核苷酸的插入或缺失，造成移碼突變；至少一個核苷酸改變，造成一個或多個所編碼氨基酸改變；至少一個核苷酸改變，形成一個提前終止密碼子；數個核苷酸缺失，造成核苷酸所編碼的一個或多個氨基酸缺失；插入一個或多個核苷酸，造成基因編碼序列中斷；整個或部分基因復制；整個或部分基因轉座；整個或部分基因重排。一個基因中可能存在一個以上上述突變。這樣的序列改變造成基因所編碼的G蛋白內的改變。例如，如果是移碼突變，移碼可能造成所編碼的氨基酸內的改變，和/或形成一個提前終止密碼子，產生截短的蛋白。
例如，所述改變最好保留天然G蛋白的三維構形。而且，可用本領域的已知技術鑒定出G蛋白功能尤其是免疫原性的必需氨基酸。具體地說，可用的方法包括保守氨基酸鑒定，定點誘變和丙氨酸掃描誘變(例如，Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))，結晶和核磁共振?？蓽y試用這些方法產生的改變多肽的特定生物活性，包括免疫原性，降低肺嗜酸粒細胞增多的能力和抗原性。
具體地說，進行合適的氨基酸改變可以根據以下幾個標準，包括疏水性、堿性或酸性特征、電荷、極性、大小、有否官能團(例如，-SH或糖基化位點)，和芳香性。根據以上特性，將各種氨基酸分類，對本領域技術人員來說是顯而易見的；其他合適的氨基酸改變還可參見Bowie等(Sience 2471306-1310(1990))。
例如，參照氨基酸184-198區(qū)域，所述改變的形式可以是184-198區(qū)域(氨基酸序列AICKRIPNKKPGKKT；SEQ ID NO.19)內的保守性(例如，甘氨酸取代丙氨酸；纈氨酸取代異亮氨酸；天冬酰胺取代谷胺酰胺)定點誘變，這保留了G蛋白該區(qū)域在保護性免疫應答中的作用，但缺失或改變了參與刺激肺嗜酸粒細胞增多的表位(即，生物學等價體)。改變的形式還可以是非保守性突變(例如賴氨酸取代蘇氨酸；丙氨酸取代脯氨酸)，降低或消除不良的嗜酸粒細胞增多刺激。改變的形式還可以是整個184-198區(qū)域或其部分的缺失，而繼續(xù)應用RSV G蛋白的其余部分。為了獲得最佳的翻譯和/或免疫原性，可用接頭區(qū)取代缺失，保留剩余G蛋白或多肽的空間特征?？捎酶鞣N標準誘變劑或誘變方法進行改變，例如涉及噬菌體(例如M13)的定點誘變或用涉及合成寡核苷酸的聚合酶鏈反應(PCR)的技術。
所以，本發(fā)明涉及編碼改變的RSV G蛋白或其部分的核苷酸序列，所述改變的G蛋白或其部分保留了免疫原性。在此，“改變的G蛋白”表示保留了免疫原性的G蛋白或其部分，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在隨后受到RSV攻擊時誘導疾病加重(例如非典型性肺炎，例如肺嗜酸粒細胞增多)。在一具體實施例中，改變的G蛋白具有氨基酸184-198區(qū)域內的改變。
雖然本發(fā)明就RSVG蛋白的氨基酸184-198區(qū)域進行了具體的描述，但在此描述的用于鑒定182-198區(qū)域方法也可以用于野生型G蛋白的其他區(qū)域，以鑒定出可改變的其他區(qū)域。例如，可分析位于在此所研究的氨基酸區(qū)域(48至198)上游(向氨基端)或下游(向羧基端)的區(qū)域，鑒定可進行有益改變的其他區(qū)域?；蛘?，可用不同的重疊肽重新分析氨基酸48-294區(qū)域，鑒定可進行有益改變的其他區(qū)域。
本發(fā)明的核酸分子可以是例如mRNA的RNA或例如cDNA和基因組DNA的DNA。DNA分子可以是雙鏈或單鏈的；單鏈RNA或DNA可以是編碼鏈、有義鏈或非編碼鏈、反義鏈。較好的是，核酸分子包含至少約14個核苷酸，至少約50個更好，至少約200個則還要好。所述的核苷酸序列可以只是編碼改變的G蛋白氨基酸序列的至少一個片段；或者，核苷酸序列可包含改變的G蛋白氨基酸的至少一段的編碼序列以及諸如內含子和3’和5’非編碼序列(例如，包括調控序列)等非編碼序列。此外，核苷酸序列可與標記序列融合，例如與協助多肽分離或純化的多肽的編碼序列融合。這類序列包括但不限于谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和流感血凝素A標記肽的編碼序列。
“核苷酸序列”包括化學合成或重組得到的核苷酸序列。這樣，本發(fā)明包括載體包含的重組DNA。而且，核苷酸序列包括異源宿主細胞內的重組DNA，以及溶液中部分純化或完全純化的DNA。本發(fā)明的核苷酸序列還包括本發(fā)明DNA分子的體內和體外RNA轉錄產物。上述核酸序列可用于例如制造所編碼的改變的G蛋白。
本發(fā)明還包括本發(fā)明核苷酸序列的各種變體，例如編碼改變的G蛋白某些部分、其類似物或衍生物的核苷酸序列，只要所述的部分、類似物或衍生物包含改變的G蛋白。這類變異可以是核苷酸未改變部分的天然變異，例如等位變異，或是非天然變異，例如由各種誘變劑和誘變方法誘導的變異。需要的變異包括但不限于一個或多個核苷酸的增加、缺失和取代，造成保守性或非保守性氨基酸改變，包括氨基酸增加和缺失。
本發(fā)明還涉及上述核酸分子的片段?！捌巍币辉~包括本文所述核苷酸序列的一部分，長度為至少14個連續(xù)核苷酸至至少50個連續(xù)核苷酸，條件是所述片段編碼改變的G多肽；這樣的片段可用作引物。特別好的引物和探針選擇性地與本文編碼改變的G蛋白的核酸分子雜交。例如，可用編碼本文改變的G蛋白的抗原性部分的片段。
本發(fā)明還涉及在中等，更好的是高度嚴謹雜交條件(例如選擇性雜交條件)下與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。合適的嚴謹性條件是本領域技術人員已知的，或者，可以參見標準教科書，例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
所以，本發(fā)明涉及與本發(fā)明改變的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列；特別好的是與本發(fā)明核苷酸序列一致性至少為90％，更好的是一致性至少95％的核苷酸序列。此時，特別好的是所編碼多肽的免疫原性與本發(fā)明改變的G蛋白基本相同的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及改變的RSV G蛋白或多肽。改變的G蛋白或多肽是這樣的RSVG蛋白或其部分，它保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在脊椎動物隨后受到RSV感染時引起疾病加重(例如，非典型性肺炎，例如肺嗜酸粒細胞增多)。在一具體實施例中，改變的G蛋白在氨基酸184-198區(qū)域內至少有一處改變。本發(fā)明改變的G蛋白可以是部分或完全純化的(例如純化至均一)，和/或基本沒有其它蛋白。
改變的G蛋白或多肽還可以是融合蛋白，包含與其它組分融合的改變的G蛋白氨基酸序列的全部或部分。其它組分，例如放射性同位素和抗原性尾端，可選用來協助多肽的分離或純化，或延長多肽的半衰期；例如，六組氨酸尾端允許采用簡便的鎳層析來純化?；蛘?，改變的G蛋白或多肽還可以是這樣的融合蛋白，所含的全部或部分改變的G蛋白氨基酸序列與完整或部分RSV F蛋白氨基酸序列融合(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)817683-7687(1984)；美國專利5,639,853；5,723,130)。
本發(fā)明還包括這樣的改變的G蛋白和多肽，除了在接受改變的G蛋白或多肽的脊椎動物中不引起疾病加重所必需的改變之外，它還包含其它氨基酸改變。例如，本發(fā)明包括的氨基酸改變有，不會改變由于給予改變蛋白所致的疾病的特征的保守性氨基酸改變。本發(fā)明還包括與本發(fā)明改變的G蛋白或多肽的一致性至少約40％的多肽。但是，一致性更低的多肽也可以使用，尤其是，如果它們在蛋白的一個或多個特定結構域表現出高(例如至少40％)一致性時。例如，本發(fā)明包括免疫功能和受體結合活性等特定活性的必需結構域具有高度一致性的改變的多肽。本發(fā)明的多肽可以化學合成或重組得到。
為了確定兩條多肽序列一致性百分比，可排列序列一獲取最佳比較結果(例如，可在第一氨基酸序列內引入空隙)。然后比較對應氨基酸位置的氨基酸殘基。當第一序列內某位置在第二序列對應位置被相同氨基酸殘基占據時，則兩分子在該位置是一致的。兩序列的一致性百分比與序列間相同位置的數量有關(即，一致性％＝相同位置數/總位數×100)。
可通過數學計算確定兩序列的一致性百分比。用于比較兩序列的一個較好的非限定性數學算法實例是Karlin等的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877(1993)。該算法被用在NBLAST和XBLAST程序中，分值＝50，字長＝3，以獲得與本發(fā)明多肽或蛋白分子具有所需一致性的氨基酸序列。為了進行加入空隙的排列以便比較，可用空隙BLAST，Altschul等，Nucleic Acids Res，253389-3402(1997)。在使用BLAST和空隙BLAST程序時，可使用相應程序(例如NBLAST和XBLAST)的默認參數。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比較序列的數學算法另一個優(yōu)選非限定性實例是Myers等的算法，CABIOS(1989)。該算法被用于ALIGN程序(2.0版)，該程序是GCG序列排列軟件包的一部分。在使用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可使用長度為12和4的空隙補償?？捎妙愃埔陨纤鲇谢驔]有空隙的技術測定兩序列的一致性百分比。在計算一致性百分比時，只計數精確匹配的數量。
本發(fā)明還提供表達載體，例如核酸結構，它含有編碼改變的G蛋白或多肽的核酸序列，該序列與至少一段調控序列操作性連接。許多這類載體是可以買到的，其它合適的載體可由熟練技術人員方便地制得?！安僮餍赃B接”指核苷酸序列與調控序列的連接方式使得核酸序列能被表達；這包括直接物理連接和通過接頭或中介序列連接。調控序列是本領域的已知技術，被選來產生改變的G蛋白或多肽。所以，“調控序列”包括啟動子，增強子和其它表達調控元件，參見Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。例如，可以使用天然調控序列或宿主細胞本身的調控序列。應該知道，可根據以下因素來設計表達載體，例如欲轉化宿主細胞的選擇，和/或欲表達蛋白的類型。
例如，可如此產生本發(fā)明改變的G蛋白或多肽將核酸分子或其部分連接到適合在原核細胞和/或真核細胞內表達的載體內(參見Broach等，ExperimentalManipulation of Gene Expression，編輯M.Inouye(Academic Press，1983)p.83；Molecular CloningA Laboratory Mannual，第2版，編輯Sambrook等(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)第16和17章)。通常，表達結構含有一個或多個選擇標記，包括但不限于編碼二氫葉酸還原酶的基因和產生新霉素、四環(huán)素、氨卞青霉素、氯霉素、卡那霉素和鏈霉素抗性的基因。
表達結構可包含調控序列，它與編碼改變的G蛋白或多肽的核酸分子操作性連接，還可以直接或通過聚核苷酸接頭與編碼完整或部分RSV F蛋白的核酸分子連接。上述表達結構的表達將產生包含改變的G蛋白或多肽與完整或部分F蛋白或多肽的嵌合體；如果結構中使用了聚核苷酸接頭，F多肽和改變的G多肽將通過一個或多個氨基酸連接。制備和表達F/G嵌合體的一般方法可參見例如美國專利5,194,595(Wathen)，其中的說明內容在此作為參考。
本發(fā)明還提供了用所述載體轉染的原核和真核宿主細胞。例如，可用本發(fā)明載體轉染的細胞包括但不限于細菌細胞，例如大腸桿菌(例如大腸桿菌K12株)，鏈霉菌，假單胞菌，粘質沙雷氏菌和鼠傷寒沙門氏菌；昆蟲細胞(桿狀病毒)，包括嗜露覃菌；真菌細胞，例如酵母；植物細胞和動物細胞，例如胸腺細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，HEp-2細胞，Vero細胞和COS細胞。
這樣，編碼本發(fā)明改變的G蛋白或多肽的核苷酸序列可用來通過微生物或真核細胞加工產生重組蛋白。將聚核苷酸序列連接到例如表達載體等基因結構內，轉化或轉染到真核(酵母，禽類，昆蟲，植物或哺乳動物)或原核(細菌)宿主細胞內是用于產生其它常見蛋白的標準方法。病毒載體包括但不限于腺病毒和委內瑞拉馬腦炎載體。此外，目前用牛痘病毒(VV)在哺乳動物細胞系中或傳遞到動物模型中表達各種RSV蛋白(Olmstead等，PNAS 837462-7466(1986)；Wertz等，J.Virol.634767-4776(1989))。與此類似，可用改變的RSV G蛋白的cDNA插入VV內胸腺嘧啶激酶基因形成的類似結構來合成改變的G蛋白或多肽。例如，可用Ball(Proc.Nalt，Acad.Sci.USA 83246-250(1986))或Olmstead等(Proc.Nalt，Acad.Sci.USA 837462-7466(1986))說明的方法從牛痘病毒載體表達改變的G蛋白或F蛋白/改變的G蛋白嵌合體。通過微生物方法或組織培養(yǎng)技術，可用類似的方法或其修改法制備本發(fā)明的重組蛋白。所以，本發(fā)明涉及用重組技術產生改變的G蛋白或多肽。
除體外產生本發(fā)明改變的G蛋白或多肽的上述宿主細胞之外，許多系統(tǒng)適合體內表達或傳遞改變的G蛋白和多肽。這些系統(tǒng)應用減毒病原例如細菌或病毒作為傳遞因子。這些減毒活病原中插入了異源核酸節(jié)段，節(jié)段的核酸序列編碼所需的本發(fā)明改變的G蛋白或多肽。用這些系統(tǒng)，所需的改變的G蛋白或多肽是由減毒活細菌或病毒在脊椎動物體內表達的。
減毒活病原的例子包括但不限于減毒活細菌，例如美國專利4,837,151所述的沙門氏菌，它特別適合經口傳遞；和美國專利5,643,576所述的減毒活委內瑞拉馬腦炎病毒，它特別適合鼻內或吸入傳遞。
可用多種方法從重組細胞培養(yǎng)物中分離或純化(例如，純化至均一)本發(fā)明的蛋白或多肽。這包括但不限于陰離子或陽離子交換層析，乙醇沉淀，親合性層析和高效液相層析(HPLC)。使用的具體方法取決于多肽的性質和宿主細胞的選擇；合適的方法對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明還涉及結合改變的G蛋白或多肽的抗體。例如，多克隆抗體和單克隆抗體，包括非人的和人抗體，人源化抗體，嵌合抗體和它們的抗原結合性片段(Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，N.Y.(1994)；EP申請173,494(Morrison)；國際專利申請WO86/01533(Neuberger)和美國專利5,225,539(Winters))，它們結合本發(fā)明改變的G蛋白。哺乳動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠或家兔可用免疫原形式的改變的G蛋白進行免疫。使蛋白或肽具有免疫原性的技術包括與載體偶聯或本領域已知的其他技術。蛋白或多肽可與佐劑一同給予。免疫進程可通過檢測血漿或血清內抗體效價來監(jiān)測?？梢悦庖咴鳛榭乖脴藴蔈LISA或其它免疫試驗檢測抗體水平。
免疫后，可獲取抗肽的抗血清，并根據需要從中分離出多克隆抗體。也可以用本領域熟知的標準技術制備單克隆抗體(Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbar等，Immunology Today 472(1983)；和Cole等，MonoclonalAntibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))?！翱贵w”在此包括抗體片段，例如Fab和F(ab)2。本文所述的抗體可通過本領域已知的方法用來抑制本文所述改變的G蛋白的活性，尤其是在體外或細胞提取物中?！耙种啤痹诖酥溉魏纬潭攘炕蛸|上的減少，包括完全喪失。此外，可以使用連有標記例如放射性標記的抗體檢測來自例如組織樣品或細胞培養(yǎng)物的細胞內有否表達的蛋白，以及在免疫吸附方法例如ELISA中用于分離改變的G蛋白或多肽?？煞治龅慕M織樣品包括人組織，例如已分化和未分化的細胞。例如肺、骨髓、胸腺、腎、肝、腦、胰、成纖維細胞和上皮細胞。
本發(fā)明還包括包含改變的G蛋白或多肽的藥物組合物。例如，可將本發(fā)明改變的G蛋白或多肽或其前藥與生理學上認可的介質一起配制成藥物組合物(例如免疫原性組合物)。具體的生理學上認可的介質包括但不限于水、鹽緩沖液、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇)和葡萄糖溶液。選定介質中活性成分的最佳濃度可憑經驗根據熟知的方法來確定，這取決于最終所需的藥劑。將外源肽引導到處理部位的方法包括但不限于透皮、肌內、腹腔內、靜脈、皮下、經口和鼻內。其它合適的引入方法包括基因治療、可重復加載(rechargeable)或可生物降解的裝置、氣霧劑和緩釋聚合物裝置。改變的G蛋白可與其它免疫原偶聯后給予，其它免疫原包括完整或部分RSV F蛋白；改變的G蛋白或多肽可與其它免疫原分開、先后或同時給予。例如，改變的G蛋白或多肽可與完整或部分RSV F蛋白形成混合物一同給予。
改變的G蛋白或多肽(或混合物、其融合蛋白或嵌合體)可作為抗原用來在脊椎動物(例如哺乳動物宿主)中激發(fā)對抗原的免疫應答。例如，抗原可以是完整的改變的G蛋白或其免疫原性部分，或是改變的G蛋白或多肽與完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分的嵌合體。本文涉及包含改變的G蛋白或多肽的組合物，這包括包含改變的G蛋白或多肽以及完整或部分RSV F蛋白的組合物。
本發(fā)明的方法包括給予脊椎動物免疫有效量的疫苗組合物，所述的疫苗組合物包含改變的G蛋白或多肽與各種合適的佐劑所成的混合物。在此，“佐劑”指各種足以加強或改善對疫苗抗原的免疫應答的物質。在此，“免疫有效量”的疫苗組合物指適合激發(fā)免疫應答的劑量，具體劑量取決于待治療脊椎動物的年齡、體重和醫(yī)療狀況。熟練技術人員很容易確定合適的劑量。疫苗組合物可以包含在藥學上或生理學上認可的載體中給予，所述載體例如生理鹽水或多元醇例如甘油或丙二醇。
合適的佐劑包括植物油或其乳液，表面活性劑，例如十六烷基胺、氨基酸十八烷酯、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴二甲基二十八烷基銨、N，N-二十八烷基-N’-N’-二(2-羥基乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和復合多元醇；聚胺，例如吡喃，硫酸葡聚糖，聚IC，聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，tuftsin；免疫刺激復合物；乳油；礦物凝膠；鋁化合物，例如氫氧化鋁和磷酸鋁；MPLTM(3-O-脫?；鶈瘟姿狨，RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，MT)；霍亂毒素的脫毒突變體和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素；裸DNA CpG基序；和StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)。本發(fā)明改變的G蛋白或多肽還可以加入脂質體或ISCOMS(免疫刺激復合物)，并可使用其它活性成分。本發(fā)明的抗原還可以與淋巴因子聯合給予，所述淋巴因子包括但不限于IL-2，IL-3，IL-12，IL-15，IFN-γ和GM-CSF。
本發(fā)明的組合物和疫苗可通過各種途徑給予人或動物，包括腸胃外，動脈內，皮內，透皮(例如用緩釋聚和物)，肌內，腹腔內，靜脈內，皮下，經口和鼻內。疫苗中所用改變的G蛋白的量取決于給予途徑和脊椎動物對象的生理特征。本領域熟練技術人員應該能夠調整和操縱所用劑量范圍和傳統(tǒng)載體抗原，以適合本發(fā)明的疫苗。本發(fā)明的疫苗是用來治療未成年或成年脊椎動物的，尤其是人。
為了減弱或加強免疫應答，可將本發(fā)明改變的G蛋白或多肽與載體分子偶聯。合適的載體蛋白包括細菌毒素，即，可安全給予哺乳動物且作為載體具有免疫效應的細菌毒素。例如百日咳，白喉，和破傷風類毒素和無毒突變蛋白(交叉反應性物質(CRM))，例如白喉類毒素的無毒變體，CRM197。包含至少一個T細胞表位的天然毒素或類毒素的片段也可作為抗原的載體。制備抗原與載體分子偶聯物的方法是本領域熟知的，可參見例如Wong，Chemistry of ProteinConjugation(CRC Press Inc.，Ann Arbor，MI(1991))；Bernatowicz和Matsueda，Analytical Biochemistry 15595-102(1986)；Frisch等，Bioconjugate Chem.7180-186(1996)；和Boeckler等，J.Immunological Methods 1911-10(1996)。
此外，如果整個肽19區(qū)(氨基酸184-198)缺失，可在缺失區(qū)插其它生物(包括但不限于3型副流感病毒)的抗原的一個或多個表位，以形成二價疫苗。
本發(fā)明還涉及包含編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子和生理學上認可的載體的疫苗，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時提供保護，而不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。這樣的疫苗在此稱為核酸疫苗或DNA疫苗，可用于脊椎動物的基因免疫。
“基因免疫”在此指給脊椎動物特別是人接種抗病原特別是RSV的核酸疫苗，由此保護脊椎動物抵抗RSV。本文中的“核酸疫苗”或“DNA疫苗”是一種核酸結構，它包含編碼多肽抗原，特別是本文所述改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子。所述的核酸結構還可以包含轉錄啟動元件，增強元件，剪接信號，終止和聚腺甘酸化信號，以及其它核酸序列。
“抗RSV保護”在此指在脊椎動物中形成免疫應答，該免疫應答是保護性(部分或完全)的，能夠抵抗RSV所致疾病的發(fā)生。受到抗RSV疾病保護的脊椎動物會感染RSV，但感染程度比沒有免疫的動物低；也可能感染RSV，但不表現出疾病癥狀；或者可能感染RSV，但表現出的疾病癥狀比沒有免疫的動物少?；蛘撸艿娇筊SV疾病保護的脊椎動物即使接觸病毒也完全不受RSV感染。然而，無論如何，核酸疫苗不會在脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
核酸疫苗可用標準方法來制備。例如，可用已知方法將編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸(例如DNA)插入表達載體，形成核酸疫苗(參見，Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，2nd版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))。
用標準方法給脊椎動物接種核酸疫苗(即給予核酸疫苗)。給脊椎動物接種可通過皮下，靜脈，腹腔內，透皮，肌內，局部，口服，直腸，鼻內，頰，陰道，吸入噴霧劑，或植入制劑儲存體，其中包含常規(guī)無毒、生理學上認可的運載體或載體。或者，可用粒子加速儀(“基因槍”)給脊椎動物接種核酸疫苗。給予的形式(例如膠囊、片劑、溶液，乳液)部分取決于給予的途徑。例如，就黏膜給予而言，可使用滴鼻液，吸入劑或栓劑。
核酸疫苗可與各種合適的佐劑聯合給予。佐劑需足量給予，該量足以增強對核酸疫苗的應答。佐劑可在接種核酸疫苗之前給予(例如之前1天以上)；在接種核酸疫苗的同時給予(例如將佐劑與核酸疫苗混合，然后將混合物給予脊椎動物)；或在接種核酸疫苗后給予(例如之后1天以上)。佐劑還可以多次給予(例如，接種核酸疫苗前和接種核酸疫苗后)。在此，“聯合”包括各種時間段，包括本文具體指明的時間和本文具體指明的時間段的組合，在此期間可給予佐劑以加強對核酸疫苗的免疫應答(例如，針對核酸疫苗所編碼的抗原的抗體效價升高，或針對RSV的抗體效價升高)。佐劑與核酸疫苗可在大致相同的部位給予脊椎動物；例如，佐劑與核酸疫苗都在脊椎動物肢體上某標記部位給予。
在一具體實施例中，核酸結構與一轉染促進劑共同給予。一優(yōu)選實施例中，轉染促進劑是二辛烷基甘氨酰精胺(DOGS)(PCT公開WO96/21356)。另一實施例中，轉染促進劑是bupivicaine(美國專利5,593,972)。
本發(fā)明還提供了在脊椎動物體內誘導免疫應答的方法，包括給予脊椎動物誘導免疫應答有效量的本文所述免疫原性組合物，疫苗或核酸疫苗。一具體實施例中，所述的脊椎動物是血清陰性脊椎動物，例如血清陰性的人。本發(fā)明還提供免疫脊椎動物(例如RSV血清陰性的人)以抵抗RSV的方法，包括給予脊椎動物包含免疫有效量改變的RSVG蛋白或多肽的組合物，所述蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情?；蛘?，組合物包含編碼免疫有效量改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。本發(fā)明還涉及免疫接種脊椎動物的方法，包括給予脊椎動物本文所述的疫苗或核酸疫苗。
總之，本文數據顯示，再度刺激時，肽19(AICKRIPNKKPGKKT)(SEQ IDNO.19)刺激CD4+T細胞擴增，引起與嗜酸粒細胞誘導和募集相關的細胞因子IL-5的分泌，由此引發(fā)肺嗜酸粒細胞增多(Coffman等，Science 245308-310(1989))。
不想局限于理論，在此提出一個免疫引發(fā)模型，其中，一個或多個肽19內的Th細胞表位控制著隨后的免疫應答的性質，導致向Th2表型的深度傾斜(skewing)。先前，改變肽序列已經證明T細胞受體(TCR)-MHC相互反應中的肽組分能夠調整Th1和Th2表型之間免疫應答的性質(Pfieffer等，J.Exp.Med.1811569-1574(1995)；Murray等，Eur.J.Immunol.242337-2344(1994))。但是，仍有可能，肽19所含的15個氨基酸包含一個以上T細胞表位，各有不同的激發(fā)Th1或Th2應答的能力。支持這一假設的是，對肽19的序列分析顯示，它具有3個潛在T細胞表位，都受限于MHC II類的I-Ed，它們相鄰排列在關鍵的1，4，6和9位錨著殘基處(分別是I，K或R，I和K)(肽19的氨基酸187，189和192)(Rammensee等，Immunogenetics 41178-228(1995))。根據通過生物化學分離MHC-結合肽或通過肽結合試驗得到的已知配體，以上推定序列都符合II類結合(Rammensee等，Immunogenetics 41178-228(1995))。將肽19(AICKRIPNKKPGKKT)(SEQ ID NO.19)突變成能破壞這些潛在T細胞表位的MHC-結合錨著區(qū)的序列((AICGRGPNGKPGKKT)(突變體1；SEQ ID NO.32)或(AGCGRGPGGKPGKGT)(突變體2；SEQ ID NO.33)，則該肽完全喪失了使小鼠易發(fā)肺嗜酸粒細胞增多的能力(圖6)。
本發(fā)明的數據確定了包含G蛋白氨基酸184-198的肽與肺嗜酸粒細胞增多易感性之間的關聯。這樣，對血清陰性群體來說，該結果贊成構建G蛋白氨基酸184-198區(qū)域內基因被改變的RSV疫苗。該疫苗不會使受體易發(fā)非典型性肺炎，但保留了抵抗RSV隨后攻擊的保護能力。HLA型與對肽19反應性的關聯為該氨基酸序列在支氣管炎，特異性反應或哮喘這些在血清陰性嬰兒感染RSV后時有所見的疾病發(fā)作期的作用提供了更深刻的理解(Welliver和Welliver，Pediatrics inReview 14134-139(1993))。這樣，對血清陰性群體來說，最好的RSV疫苗策略應包含這樣的組分，它們不會引發(fā)免疫致病性結果，但可獲得平衡的免疫應答，從而激發(fā)保護性的CD4+和CD8+細胞類型。圖4A和4B中的數據確認了一系列激發(fā)IFN-γ分泌并具有以上作用的肽(即，肽10，14，16和18)。與此類似，該數據提示了一系列能夠激發(fā)PBMC增殖并足以在沒有肽19序列存在下提供抗RSV攻擊保護的肽(例如，對供血者100來說，是肽2，4，9，15和29)。
以下實施例用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明的范圍。本文引用的參考文獻的內容均在此作為參考。
實施例材料與方法小鼠雌性BALB/c(H-2d)小鼠，7-9周齡，購自Taconic Farms，Inc.(Germantown，NY)。所有小鼠都籠養(yǎng)在American Association for Accreditation of LaboratoryAnimal Care設計的設備中。疫苗抗原的制備與使用用RSV A2毒株感染HEp2-細胞(ATCC CCL23)，離心澄清培養(yǎng)物上清液去除細胞碎片，制得病毒粒子。由培養(yǎng)在Vero細胞(ATCC CCL81)中的RSV A2毒株純化RSV F和G蛋白。根據現有記載(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))，用G蛋白特異性單克隆抗體L7(雜交瘤，ATCC HB10233)，通過免疫親合層析分離G蛋白。經ELISA和SDS-PAGE測定，所得的G蛋白純度＞95％。免疫時，每只小鼠在第0和4周肌內接種含1μg純化G蛋白和20μg佐劑StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)的0.1ml PBS，除非另作說明。以離子交換層析純化F蛋白，用3μg F蛋白，以100μg氫氧化鋁(Al(OH)3)為佐劑進行接種。在RSV接種和攻擊中，給予50μl含1-2×106噬斑形成單位(pfu)的感染性RSV A2。用等體積HEp-2細胞裂解液進行模擬接種。肽抗原的制備與使用由Genosys Biotechnologies，Inc.(The Woodlands，TX)合成一系列對應于RSVG蛋白重疊區(qū)的合成肽(圖2)。所得的肽系列涵蓋RSV A2 G蛋白的氨基酸48-294(Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824075-4079(1985))。這些肽經質譜測定的純度高于90％。將凍干肽在無菌水中溶解成2mg/ml，保存于-20℃。用50μg/ml肽體外刺激人外周血單核細胞(PBMC)或用G蛋白初次免疫過小鼠的脾細胞。
用Imject活化偶聯試劑盒(Pierce Chemical，Rockford，IL)將選定的肽與馬來酰亞胺活化的匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯。由于偶聯機制的基礎是KLH內馬來酰亞胺基團與肽內SH基團間的化學反應，所以在肽22的羧基末端添加一個半胱氨酸。用Elliman’試劑(Pierce Chemical)測定肽內巰基的減少來定量檢測各種肽的偶聯程度。以上反應中的偶聯程度(通常每mg KLH結合50-80μg肽)優(yōu)于過去肽與KLH通過該技術(Tsao等，Anal.Biochemistry 197137-142(1991))的偶聯。為了研究各種肽對嗜酸粒細胞增多的誘導，在第0和4周，用250μg與KLH結合的各種肽，以20μg StimulonTMQS-21為佐劑，加入0.1PBS中肌內免疫各小鼠。二次接種2周后，通過肌內給予50μl含1-2×106pfu感染性RSV A2進行攻擊(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。7天后，通過頸椎脫臼處死小鼠，進行支氣管灌洗(BAL)。測定感染性RSV的效價系列稀釋RSV感染的小鼠的肺勻漿上清液，用于感染HEp-2細胞單層。溫育2小時后，吸出接種物，每測試格覆蓋以含1％Sephadex G-75的培養(yǎng)基。繼續(xù)溫育3天后，去除凝膠覆蓋，測試格用80％乙醇固定。用RSV G蛋白的單克隆抗體和與辣根過氧化酶偶聯的山羊抗小鼠第二mAb鑒定RSV噬斑。加入底物，0.05％4-氯萘酚/0.09％過氧化氫的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，進行顯色。計數RSV噬斑形成單位(pfu)，將效價表示為pfu/g肺組織。
用含純化自RSV A2毒株的天然融合(F)和/或吸附(G)蛋白的多種疫苗之一肌內注射初次免疫BALB/c小鼠。3組小鼠分別用3,000，300或30ng F蛋白/劑次進行初次免疫。另3組小鼠用1,000，100或10ng G蛋白/劑次初次免疫。再有3組小鼠用含3000+1000，300+100或30+10ng F與G蛋白的組合疫苗初次免疫。全部疫苗均以氫氧化鋁(AlOH，100μg/劑次)為佐劑。對照鼠RSV A2毒株感染，或肌內注射PBS/AlOH。初次免疫后4周，用RSVA2毒株攻擊全部小鼠。4天后，處死小鼠，測定肺組織中感染性病毒的數量(表)。
表小鼠肺內RSV效價的測定抗原(ng) GMT RSVaF(3000)+G(1000)＜1.6±0.2F(300)+G(100) ＜2.1±0.7F(30)+G(10)＜2.8±0.9bF(3000)＜2.1±0.5F(300) ＜2.5±0.1F(30) 4.1±0.8G(1000)3.5±0.5G(100) 4.7±0.2G(10) 4.7±0.2PBS5.1±0.2RSV＜1.6±0.1a.GMT是RSV/g肺組織的幾何平均效價(log10)±1標準偏差。GMT RSV是在鼻內攻擊4天后測定的。
b.接種純F(30)，純G(10)或PBS的組，P＜0.05。支氣管肺泡灌洗進行支氣管肺泡灌洗(BAL)用含1ml冰冷卻的12mM鹽酸利多卡因的RPMI溶液灌注氣管，然后抽出，重復至少5次(Hancock等，Vaccine 13391-400(1995))。然后離心BAL懸浮液沉淀出細胞。用0.2％的臺盼藍PBS溶液染色分成等份的細胞，測定白細胞數量。接著，離心細胞，轉移到玻片上，用Diff-Quik(DadeInternational Inc.，Miami，FL)固定并染色。通過分析每玻片至少400細胞計數各白細胞群。表示的結果為每組5只小鼠的平均百分比(±SD)。體內清除T細胞亞型在重組G蛋白柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)上，從雜交瘤培養(yǎng)物上清液中純化抗鼠CD4，GK1.5(ATCC TIB207)和抗鼠CD8，53-6.72(ATCC TIB105)的單克隆抗體(mAb)。作為對照，從Calbiochem(San Diego，CA)購得純化的大鼠IgG。在末次免疫后的第14天和第20天，以每鼠750μg和250μg的劑量給予mAb。然后用活RSV攻擊小鼠，7天后，通過分析BAL細胞測定肺嗜酸粒細胞的量。在FACScan(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上進行流動細胞計數，評估清除的效果。用購自Pharmaingen(San Diego，CA)的PE抗小鼠CD4(L3T4)和FITC抗小鼠CD8(Ly-2)進行標準流動細胞計數。脾免疫細胞的體外擴增根據現有記載(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))，用天然G蛋白與StimulonTMQS-21二次接種小鼠，2周后從5個一組的小鼠中分離出脾臟，制成單細胞懸液。用氯化銨裂解去除紅細胞，用臺盼藍排除法測定所得脾細胞的量。在96格平底培養(yǎng)板上培養(yǎng)細胞，一式三份，濃度為每格2.5×105個細胞，培養(yǎng)基含RPMI1640，并補充以2mM谷胺酰胺；100U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素；5×10-4Mβ-巰基乙醇；10mM HEPES；1％正常小鼠血清(Biocell Labs，Inc.，RanchoDominguez，CA)。在培養(yǎng)基中加入50μg/ml肽抗原。作為對照，分別加入最終濃度為0.5μg/ml的純化G蛋白，10μg/ml白喉類毒素交叉反應性蛋白(CRM197)和1μg/ml伴刀豆蛋白A(ConA)。37℃，5％CO2培養(yǎng)4天后，用1μCi3H-胸腺嘧啶脈沖處理18小時。然后收獲細胞，用液相閃爍計數法測定摻入DNA的3H-胸腺嘧啶。
收集正常成年供血者肝素化人血液，通過Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)離心分離。細胞與上述肽培養(yǎng)在含10％AB-血清(Biocell)的PRMI1460中。作為對照，細胞在培養(yǎng)基中與CRM197(30μg/ml)，PHA(5μg/ml)一起培養(yǎng)，或單獨培養(yǎng)。細胞因子試驗匯合一式三格的上清液，用抗原-捕捉ELISA檢測IFN-γ和IL-5。簡而言之，最大吸附(maxisorb)板(Nunc)上涂以含捕捉IFN-γ的R4-6A2(3μg/ml)或捕捉IL-5的TRFK.5(2.5μg/ml)單克隆抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)50μl。用含5％FBS和10％奶粉(wt/vol)的Tris緩沖液封閉非特異性結合位點。將培養(yǎng)物上清液加到測試格中，一式兩份，室溫培養(yǎng)2小時。用生物素化的抗體XMG1.2(IFN-γ)(1μg/ml)和TRFK.4(IL-5)(2μg/ml)檢測結合的細胞因子。細胞因子試驗中使用的4種單克隆抗體都來自Pharmacia(San Diego，CA)。用鏈霉親合素-堿性磷酸酶以及含NADP，黃遞酶，醇脫氫酶和INT紫的底物系統(tǒng)測定細胞因子的量。加入0.3M硫酸令底物顯色，在Dynatech(Chantilly，VA)ELISA讀數儀上，于490nm處測定光密度(OD490)。為了確保線性，用重組IFN-γ(Genzyme，Cambridge，MA)和IL-5(Pharmacia，San Diego，CA)得出各細胞因子的標準曲線。給出的是每種抗原的平均OD490。肺嗜酸粒細胞增多的誘導在第0和4周，給7-9周齡的雌性BALB/c小鼠肌內接種含20μg StimulonTMQS-21佐劑；1μg純化G蛋白，250μg KLH，250μg與肽19或22偶聯的KLH；或游離肽19或22的0.1ml PBS。用購自Peirce Chemical，Rockford，IL的Imject活化偶聯試劑盒(產品編號77111)將肽與馬來酰亞胺活化KLH偶聯。通常，每次偶聯反應，將80-100μg肽與1mgKLH結合。這樣，由于每鼠每次接種接受250μgKLH，這就相當于接種了20-25μg相關肽。二次接種2周后，用50μl 1-2×106PFU感染性RSV A2鼻內攻擊。7天后，頸椎脫臼處死小鼠，進行支氣管肺泡灌洗。離心細胞，轉移到玻片上，用Diff-Quik(Dade Diagnostics)固定和染色。分析每片至少400細胞，計數與白細胞總數相關的嗜酸粒細胞的相對比例。表示的結果(圖5)是每組5只小鼠的平均百分比(±SD)。統(tǒng)計學分析用JMP統(tǒng)計學軟件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，用Tukey-Kramer HSD多重比較檢驗測定不同組之間的顯著差異。結果本文描述了以上工作的結果，即天然G蛋白和一系列G蛋白氨基酸48至294上重疊肽(圖2)所激發(fā)的免疫應答。氨基酸48對應于RSV G蛋白的第二翻譯起始密碼子。在第0和4周肌內(IM)接種天然G蛋白的BALB/c小鼠，在活RSV鼻內(IN)攻擊后第7天，表現出最大的支氣管肺泡灌洗(BAL)液中嗜酸粒細胞增多(占白細胞總量的65％)。相反，實驗感染或初次免疫感染過的小鼠的BAL液中嗜酸粒細胞不到2％(圖1B)。
接種G蛋白的BALB/c小鼠脾細胞的體外刺激試驗顯示，對包含G蛋白氨基酸184-198的肽發(fā)生的優(yōu)勢性增殖應答(圖3)。增殖比背景水平高16倍，且大大超過用其它G蛋白衍生肽獲得的增殖。此外，對肽19的應答強度與用純化天然G蛋白所得的相當。所以，以上數據說明，RSV G蛋白激發(fā)BALB/c小鼠初次免疫脾細胞增殖的能力完全包含在蛋白質的184-198氨基酸節(jié)段內。
分析了培養(yǎng)物上清液與輔助T細胞亞型相關的細胞因子，最高水平的IFN-γ和IL-5出現在肽19刺激之后。而且，該水平與用天然G蛋白激發(fā)所得相當，或更高(圖4A和4B)。以上數據說明，氨基酸184-198區(qū)域包含了BALB/c小鼠T細胞所識別的RSV G蛋白內的優(yōu)勢表位。
初步研究表明，接種G蛋白的BALB/c小鼠的BAL中，肺嗜酸粒細胞最高值出現在攻擊后7天，為65±5.4％。為了證實肽19在激發(fā)小鼠肺嗜酸粒細胞增多中的直接作用，將肽19與肽22進行了比較。后一肽似乎只激發(fā)產生IFN-γ，而不激發(fā)產生IL-5(圖4A和4B)。
為了確保足夠的免疫原性，將肽與馬來酰亞胺活化的KLH偶聯。與只用佐劑接種的小鼠(2.5±2.0％)相比，用肽19-KLH(39.5±8.0％)或G蛋白(63±1.9％)初次免疫的小鼠，發(fā)生統(tǒng)計學意義上明顯的肺嗜酸粒細胞增多(圖5)。相反，肽22-KLH只引起背景水平的嗜酸粒細胞增多(4.9±3.3％)，盡管數據顯示肽22具有免疫原性。末次接種后2周，接種肽19-KLH或肽22-KLH的小鼠抗RSV G蛋白IgG效價的幾何平均值分別為1517和5611。所以，雖然對兩種肽偶聯物都產生體液免疫，但嗜酸粒細胞異常增多的誘導僅限于接種肽19的小鼠。用非偶聯肽19或22接種都不激發(fā)可測得的體液免疫應答，產生的嗜酸粒細胞相對百分比(分別為6.5±5.2％和2.5±2.5％)與PBS/StimulonTMQS-21對照沒有顯著差異。
為了評估肽19作為致肺嗜酸粒細胞增多誘因，對在MHC II類結合位點的關鍵性1，4，6和9錨著區(qū)發(fā)生氨基酸取代的肽19突變體進行了評估。這些突變消除了致小鼠肺嗜酸粒細胞增多的能力(圖6)。結合圖5，以上數據表明，肽19的氨基酸序列與誘導小鼠受隨后攻擊時肺嗜酸粒細胞增多之間直接相關。
為了確定與肽19-KLH相關的嗜酸粒細胞增多是否是由CD4+細胞介導的，用針對CD4或CD8表面分子的mAb進行了一系列缺失試驗。FACS分析是在攻擊后7天，對接種小鼠脾臟的脾門淋巴細胞群進行的(圖8)。
去除CD4+細胞，在接種G/StimulonTMQS-21或肽19-KLH/StimulonTMQS-21的小鼠內顯著降低了BAL中的嗜酸粒細胞增多(圖8)。具體地說，用抗CD4 mAb治療分別將嗜酸粒細胞從67.2±8.5％和29.6±13.3％降至8.1±4.7％和0.75±0.6％。相應的抗CD8 mAb治療對嗜酸粒細胞增多誘導作用甚微，接種G和肽19-KLH的小鼠的嗜酸粒細胞水平分別保持在63.8±6.4％和32.8±10.3％。如圖8所示，用RSV試驗性感染的小鼠的BAL中，只有0.7％嗜酸粒細胞。所以，以上數據說明，對接種了G蛋白或肽19的BALB/C小鼠受攻擊時肺嗜酸粒細胞增多應答而言，CD4+細胞是必需的。
測試了一組供血者外周血單核細胞與純化G蛋白的反應性，以鑒定最近已被感染的個體。接著，獲取表現出對G蛋白增殖應答的6名供血者的細胞，在圖2中合成肽存在下培養(yǎng)(圖7)。發(fā)現供血者100對肽19有強烈的增殖應答(平均刺激指數，8.5)。此外，供血者9和20也對肽19有增殖應答，平均刺激指數均為3倍。等價性雖然，參照優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的說明與描述，本領域熟練技術人員知道，在形式和細節(jié)上可進行多種改變，這些都屬于后文權利要求書的精神和范圍內。
權利要求
1.一種改變的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
2.根據權利要求1所述的改變的G蛋白或多肽，所述加重的病情是非典型性肺炎。
3.根據權利要求2所述的改變的G蛋白或多肽，所述的非典型性肺炎是肺嗜酸粒細胞增多。
4.根據權利要求1所述的改變的G蛋白或多肽，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
5.根據權利要求1所述的改變的G蛋白或多肽，所述改變所在區(qū)域的氨基酸序列為丙氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，或其生物等價體。
6.根據權利要求1所述的改變的G蛋白或多肽，所述的改變造成改變的G蛋白或多肽相對于野生型G蛋白抑制IL-5分泌的引發(fā)。
7.編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
8.根據權利要求7所述的核酸分子，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
9.根據權利要求7所述的核酸分子，所述改變所在區(qū)域的氨基酸序列為丙氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，或其生物等價體。
10.一種核酸結構，包含與調控序列操作性連接的權利要求7所述的核酸分子。
11.一種嵌合核酸結構，包含a)編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情；b)編碼完整或部分RSVF蛋白的核酸分子；和c)與a)和b)操作性連接的調控序列。
12.一種重組宿主細胞，包含權利要求10所述的核酸結構。
13.一種重組宿主細胞，包含權利要求11所述的核酸結構。
14.一種產生改變的RSV G蛋白或多肽的方法，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，該方法包括將權利要求12所述的重組宿主細胞維持在適合改變的G蛋白或多肽表達的條件下。
15.一種產生嵌合多肽的方法，嵌合多肽包含改變的RSV G蛋白或多肽與完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，該方法包括將權利要求13所述的重組宿主細胞維持在適合所編碼嵌合蛋白表達的條件下。
16.一種免疫原性組合物，包含生理學上認可的介質和改變的RSV G蛋白或多肽，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
17.根據權利要求16所述的免疫原性組合物，該免疫原性組合物相對于野生型G蛋白造成IL-5分泌的引發(fā)被抑制。
18.根據權利要求16所述的免疫原性組合物，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
19.一種免疫原性組合物，包含生理學上認可的介質，完整或部分RSV F蛋白和改變的RSV G蛋白或多肽，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
20.根據權利要求19所述的免疫原性組合物，它相對于野生型G蛋白造成IL-5分泌的引發(fā)被抑制。
21.根據權利要求19所述的免疫原性組合物，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
22.根據權利要求19所述的免疫原性組合物，所述改變所在區(qū)域的氨基酸序列為丙氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，或其生物等價體。
23.一種疫苗組合物，包含免疫有效量的改變的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
24.根據權利要求23所述的疫苗組合物，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
25.根據權利要求24所述的疫苗組合物，所述改變所在區(qū)域的氨基酸序列為丙氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，或其生物等價體。
26.一種疫苗組合物，它包含免疫有效量的完整或部分RSV F蛋白，免疫有效量的改變的RSV G蛋白或多肽，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
27.根據權利要求26所述的疫苗組合物，所述的改變位于氨基酸184-198區(qū)域內。
28.根據權利要求27所述的疫苗組合物，所述改變所在區(qū)域的氨基酸序列為丙氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-甘氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸，或其生物等價體。
29.根據權利要求23所述的疫苗組合物，它還包含佐劑。
30.根據權利要求26所述的疫苗組合物，它還包含佐劑。
31.權利要求1所述改變的G蛋白或多肽的用途，它被用于制造疫苗等藥物。
32.一種疫苗，它包含生理學上認可的載體和有效量的編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
33.根據權利要求32所述的疫苗，它還包含轉染促進劑。
34.一種誘導脊椎動物體內免疫應答的方法，包括給予所述脊椎動物誘導免疫應答有效量的編碼改變的RSV G蛋白或多肽的DNA和轉染促進劑，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
35.一種抑制脊椎動物接種后再度RSV時誘導病情加重的方法，包括給予改變的RSV G蛋白或多肽，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，可提供保護但不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
36.一種免疫脊椎動物抗RSV的方法，包括給予所述脊椎動物包含免疫有效量改變的RSV G蛋白或多肽的組合物，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
37.根據權利要求36所述的方法，所述的組合物還包含免疫有效量的完整或部分RSV F蛋白。
38.根據權利要求36所述的方法，所述的脊椎動物是RSV血清陰性的人。
39.一種免疫脊椎動物抗RSV的方法，包括給予所述脊椎動物包含免疫有效量編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的組合物，所述改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情。
40.根據權利要求39所述的方法，所述的組合物還包含免疫有效量的編碼完整或部分RSV F蛋白的核酸分子。
41.根據權利要求39所述的方法，所述的脊椎動物是RSV血清陰性的人。
42.一種疫苗組合物，它包含免疫有效量的減毒活病原體，病原體內插入有異源核酸節(jié)段，所述核酸節(jié)段是一段編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸序列，使得所述疫苗在給予脊椎動物后，改變的G蛋白或多肽得以表達并具有免疫原性，但不會在該脊椎動物隨后感染RSV時誘導病情加重。
43.根據權利要求42所述的疫苗組合物，所述的減毒活病原體是減毒細菌。
44.根據權利要求43所述的疫苗組合物，所述的減毒活細菌是沙門氏菌。
45.根據權利要求42所述的疫苗組合物，所述的減毒活病原體是減毒病毒。
46.根據權利要求45所述的疫苗組合物，所述的減毒活病毒是減毒的委內瑞拉馬腦膜炎病毒。
47.一種免疫脊椎動物抗RSV的方法，包括給予所述脊椎動物包含免疫有效量減毒活病原體的組合物，所述病原體內插入有異源核酸節(jié)段，所述核酸節(jié)段是一段編碼改變的RSV G蛋白或多肽的核酸序列，使得所述疫苗在給予脊椎動物后，改變的G蛋白或多肽得以表達并具有免疫原性，但不在該脊椎動物隨后感染RSV時誘導病情加重。
48.根據權利要求47所述的方法，所述的減毒活病原體是減毒細菌。
49.根據權利要求48所述的方法，所述的減毒活細菌是沙門氏菌。
50.根據權利要求47所述的方法，所述的減毒活病原體是減毒病毒。
51.根據權利要求50所述的方法，所述的減毒活病毒是減毒的委內瑞拉馬腦膜炎病毒。
52.一種改變的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列選自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
53.一種免疫原性組合物，它包含生理學上認可的介質和改變的RSV G蛋白或多肽，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列選自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
54.免疫原性組合物，它包含免疫有效量的改變的RSV G蛋白或多肽，所述的改變的G蛋白或多肽保留了免疫原性，當加入免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時，可提供保護，但不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列選自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改變的RSV G蛋白或其部分,它保留了免疫原性,當加入到免疫原性組合物或疫苗并給予脊椎動物時,不會在該脊椎動物隨后感染RSV時加重病情(例如非典型性肺炎,例如肺嗜酸粒細胞增多)。具體實施例中,所述改變的G蛋白包含位于氨基酸184－198區(qū)域內的改變。本發(fā)明還公開了包含改變的RSV G蛋白,還可以另含RSV F蛋白的免疫原性組合物和疫苗。
文檔編號A61K48/00GK1322250SQ98810491
公開日2001年11月14日 申請日期1998年9月17日 優(yōu)先權日1997年9月19日
發(fā)明者G·E·漢考克, P·W·特伯貝 申請人:美國氰胺公司