專利名稱：可生物降解的聚合物支架結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及在組織工程中可生物降解的聚合物支架結(jié)構(gòu)的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及在大孔之間具有高水平互連的新的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
損傷，遺傳畸形和疾病的骨治療經(jīng)常需要植入移植物。已知自體移植和異體移植是最安全的移植；但是，由于供應(yīng)源有限，疾病傳播的危險(xiǎn)以及這些移植物遇到的排斥，合成的生物材料也已經(jīng)廣泛地用作植入體。在這些生物材料中有一些觀察到了體內(nèi)并發(fā)癥，如機(jī)械不匹配(應(yīng)力屏蔽)和出現(xiàn)磨損碎片導(dǎo)致植入體周圍骨萎縮，骨質(zhì)疏松或骨溶解的(Woo等人，1976；Terjesen等人，1988)。
組織工程(TE)確定的一條新途徑最近引起了很大興趣。組織工程包括開發(fā)能夠與生物組織特定地相互作用產(chǎn)生功能性組織等當(dāng)物的新一代生物材料?；诘那疤崾强梢詮牟∪朔蛛x細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)展，并且接種到從特定的生物材料制備的支架結(jié)構(gòu)形成稱為“TE構(gòu)建體”的支架結(jié)構(gòu)/生物組成。然后，將該構(gòu)建體移植進(jìn)同一病人，作為替代組織起作用。當(dāng)供體器官的得到受限制，或在一些情況中(例如，年輕病人)獲得的天然替代物不適當(dāng)時(shí)，一些這樣的系統(tǒng)可用于器官組織替代中。支架結(jié)構(gòu)本身可以作為遞送來自生長因子，基因和藥物的生物活性成分的載體。這一革命性的外科方法具有廣泛的用途，對(duì)病人的情況和健康護(hù)理系統(tǒng)的發(fā)展都有好處。
組織工程在骨組織的生長上的應(yīng)用包括收集生骨干細(xì)胞，接種它們，并允許在體外生長產(chǎn)生新的組織。然后，新得到的組織可以用作自體移植體?？缮锝到獾木埘?特別是聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(1actide-co-glycolide))已經(jīng)用作幾個(gè)不同的細(xì)胞群體，例如軟骨細(xì)胞(正如Freed等人，在生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志，2711-13，1993中所述)，肝細(xì)胞(正如Mooney等人，在生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志29，959-965，1995中所述)，和最新的骨髓起源細(xì)胞(如Ishaug等人，在生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志3617-28，1997和Holy等人，在細(xì)胞和材料，7，223-234，1997中所述)的組織工程的支架結(jié)構(gòu)。具體地，制備了這些聚酯的多孔結(jié)構(gòu)，并且用細(xì)胞接種；但是，當(dāng)在這些多孔結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)骨髓起源的細(xì)胞時(shí)，骨的向內(nèi)生長只發(fā)生在3-D聚合物支架結(jié)構(gòu)的外部邊緣內(nèi)(Ishaug等人，出處同上；Holy等人，出處同上)。所以，在這些情況中制備的聚合物支架結(jié)構(gòu)是不適合提供適用于移植或用作自體移植體的組織需要的細(xì)胞生長的。
發(fā)明概要已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以在小梁骨中可見的互連大小范圍是毫米級(jí)的大孔為特征的聚合物支架結(jié)構(gòu)在組織工程中特別有用，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S作為三維組織發(fā)育的關(guān)鍵的細(xì)胞向內(nèi)生長。利用結(jié)合相轉(zhuǎn)換和顆粒瀝濾的技術(shù)的新方法可以制備這樣的聚合物支架結(jié)構(gòu)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包括大小范圍0.5毫米到3.5毫米的并且具有相似于人小梁骨中發(fā)現(xiàn)的互連的孔特征的大孔的聚合物支架結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了制造聚合物支架結(jié)構(gòu)的方法，包括如下步驟結(jié)合液體聚合物和顆粒以形成顆粒聚合物混合物；在聚合物非溶劑中浸沒顆粒聚合物混合物產(chǎn)生固化顆粒-聚合物混合物；和在顆粒溶劑中浸沒固化顆粒-聚合物混合物足夠的時(shí)間允許溶解顆粒。
在本發(fā)明的另一方面，提供了生長組織的方法，在這一方法中，在三維聚合物支架結(jié)構(gòu)中組織生長彌漫性侵入至少2.5倍于支架結(jié)構(gòu)中的平均大孔大小的深度，該方法包括如下步驟將組織細(xì)胞接種在聚合物支架結(jié)構(gòu)中，所述的支架結(jié)構(gòu)包含具有0.5-3.5毫米大小范圍的大孔，包括連接大孔的大孔性和微孔性通道；和培養(yǎng)細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了生物相容性聚合物小梁，包括具有至少50％孔隙度的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)，所述的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)包括具有直徑范圍約0.5-3.5毫米的大孔，并且包括在所述的大孔之間的互連。
在本發(fā)明的另一方面，提供了組織生長的方法，該方法中組織在三維聚合物小梁中生長并彌漫性侵入至少2.5倍于支架結(jié)構(gòu)的平均孔大小的深度，該方法包括如下步驟合成包括孔隙度至少50％的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)的聚合物的生物相容性小梁，所述的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)包括直徑范圍約0.5-3.5毫米的大孔和所述大孔之間的大孔性和微孔性互連；將組織細(xì)胞接種在聚合物支架結(jié)構(gòu)上；和培養(yǎng)組織細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了培養(yǎng)三維組織的方法，包括用組織細(xì)胞接種大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)細(xì)胞，所述的支架結(jié)構(gòu)包括互連的大孔，至少50％的大孔的孔直徑范圍約0.5-3.5毫米。
附圖的簡(jiǎn)要說明參考附圖和計(jì)算機(jī)數(shù)字化的顯微圖，本發(fā)明的實(shí)施方案得到了更詳細(xì)的說明，其中

圖1是說明如下文確定的不同成分的聚合物孔系統(tǒng)一部分的圖解；圖2是顯示各向同性和各向異性的區(qū)域的股骨頸中骨小梁的光學(xué)顯微圖(來自TobinWJ，在J.Bone Jt Surg37A(1)57-72，1955的修飾的光學(xué)顯微圖)。
圖3A是本發(fā)明的聚合物的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬1.8厘米)；圖3B是圖3A的聚合物支架結(jié)構(gòu)的20微米切片的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬度3.5毫米)；圖3C是圖3A的聚合物支架結(jié)構(gòu)的孔壁的掃描電子顯微圖。
圖4A是當(dāng)以每秒1％變形的速度進(jìn)行壓縮測(cè)試時(shí)，說明聚合物的壓力/強(qiáng)度曲線的圖；圖4B是說明聚合物濃度對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)的機(jī)械特性的影響的圖。第一個(gè)彈性區(qū)的楊氏模量稱為Y1，第二個(gè)彈性區(qū)的楊氏模量稱為Y2；圖5是利用在DMSO中的0.05克/毫升濃度的PLGA7525制備的支架結(jié)構(gòu)的孔壁結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖圖6是利用在DMSO中的0.2克/毫升濃度的PLGA7525制備的支架結(jié)構(gòu)的孔壁結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖7A是利用小于0.35毫米的顆粒獲得的PLGA75/25支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖7B是利用0.54-0.8毫米的顆粒獲得的PLGA75/25支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖7C是利用0.8-2.0毫米的顆粒獲得的PLGA75/25支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖8是在缺乏顆粒時(shí)制備的PLGA75/25膜的掃描電子顯微圖；圖9A是在T混合物=11℃，和T非溶劑=0℃時(shí)獲得的PLGA75/25泡沫的掃描電子顯微圖；圖9B是在T混合物=-20℃和T非溶劑=0℃時(shí)獲得的PLGA75/25泡沫的掃描電子顯微圖。
圖9C是在T混合物=-20℃，和T非溶劑=40℃時(shí)獲得的PLGA75/25泡沫的掃描電子顯微圖；圖10是涂覆PLGA75/25支架結(jié)構(gòu)的葉狀CaP的掃描電子顯微圖；圖11是培養(yǎng)42天的Dex+支架結(jié)構(gòu)的共焦顯微圖(視場(chǎng)寬度=1.8毫米)；圖12是利用四環(huán)素染色的Dex+支架結(jié)構(gòu)的紫外光照射的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬度=2.0厘米)；圖13是骨鈣蛋白免疫標(biāo)記的支架結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬度=1.1厘米)；圖14是蘇木精和曙紅染色的Dex+培養(yǎng)的支架結(jié)構(gòu)切片的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬度=0.8厘米)；圖15是蘇木精和曙紅染色的Dex-培養(yǎng)的支架結(jié)構(gòu)切片的光學(xué)顯微圖(視場(chǎng)寬度=0.6厘米)；圖16A是現(xiàn)有技術(shù)中利用小于0.35毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25膜支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖16B是現(xiàn)有技術(shù)中用大小為0.54-0.8毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25膜支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
圖16C是現(xiàn)有技術(shù)中用大小為0.8-2.0毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25膜支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
圖16D是利用小于0.35毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25中間體支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；圖16E是利用大小范圍0.54-0.8毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25中間體支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
圖16F是利用大小范圍0.8-2.0毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25中間體支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
圖16G是利用小于0.35毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25骨狀支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
圖16H是利用大小范圍0.54-0.8毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25骨狀支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖；和圖16I是大小范圍0.8-2.0毫米的顆粒產(chǎn)生的PLGA75/25骨狀支架結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微圖。
發(fā)明的詳細(xì)說明圖1是顯示通過大孔性互連而互相連接的兩個(gè)大孔的聚合物支架結(jié)構(gòu)的一部分的圖解說明。兩個(gè)大孔也通過微孔通道(也稱為微孔)與周圍的大孔連接。用于本發(fā)明生產(chǎn)的聚合物支架結(jié)構(gòu)的敘述中的這些和其它幾個(gè)術(shù)語定義如下。
支架結(jié)構(gòu)作為組織工程或相關(guān)應(yīng)用的細(xì)胞載體而設(shè)計(jì)的裝置。這一裝置優(yōu)選地具有供細(xì)胞定居的多孔的形態(tài)。在我們的特定實(shí)例中，支架結(jié)構(gòu)具有開孔形態(tài)。
大孔由聚合物壁隔開的聚合物支架結(jié)構(gòu)內(nèi)的空間。大孔通常的直徑是0.5-3.5毫米。
孔壁隔開大孔的聚合物支柱(strut)。當(dāng)聚合物支柱形成各向異性的束時(shí)，其中大孔的互連將同一束中的支柱相互分開，孔壁的結(jié)構(gòu)定義為“片狀”。當(dāng)支柱是各向同性的，沒有形成束并且主要由大孔性互連將它們廣泛地相互隔開時(shí)，孔壁定義為“支柱狀”。當(dāng)制成切片時(shí)，片狀和支柱狀孔壁結(jié)構(gòu)具有納孔。
微孔性互連(也稱為微孔或微孔通道)在片狀孔壁中發(fā)現(xiàn)的空間。聚合物的每個(gè)支柱或片層是由稱為微孔的延伸平行孔結(jié)構(gòu)相互分開的。這些孔的大小小于200微米。微孔負(fù)責(zé)整個(gè)支架結(jié)構(gòu)的互連性。大孔性互連在片狀排列孔壁之間或聚合物支柱之間的通道。它們主要負(fù)責(zé)大小范圍200微米到2毫米的大孔的互連性。
納孔在聚合物塊中發(fā)現(xiàn)的空間。來自孔壁支柱或孔壁片層結(jié)構(gòu)的大塊聚合物物質(zhì)的橫斷面具有圓的凹腔，這些凹腔可能或可能沒有在整個(gè)聚合物大塊物質(zhì)中穿孔。這些納孔可能是聚合物大塊中陷入的非溶劑產(chǎn)生的，或聚合物大塊的自我催化降解產(chǎn)生的。納孔分布在支架結(jié)構(gòu)的壁中。當(dāng)它們穿越整個(gè)大塊物質(zhì)時(shí)，它們只負(fù)責(zé)大孔的全面互連性。
互連相互連接大孔的流動(dòng)通道。互連包括大孔性互連(通道)，微孔性互連(通道)，和上面定義的穿越整個(gè)塊物質(zhì)的納孔。
本發(fā)明提供了包括大孔和互連的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)。大孔的直徑范圍0.5-3.5毫米，互連如小梁骨中所見。本文公開的聚合物支架結(jié)構(gòu)的形態(tài)(也稱為泡沫結(jié)構(gòu))是基于小梁骨的形態(tài)的。
小梁骨是骨中代謝最活躍的位點(diǎn)(如Rodan GA,骨13，S3-S6 1992所述)。小梁骨的特有的開孔狀幾何結(jié)構(gòu)有利地影響了骨形成和再吸收，所以在骨組織工程中是相當(dāng)令人感興趣的確實(shí)，理想的骨組織工程的支架結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)也應(yīng)該允許快速的骨形成和再吸收。所以骨小梁的形態(tài)可作為模型制造本文公開的新聚合物支架結(jié)構(gòu)。
骨小梁的結(jié)構(gòu)取決于發(fā)現(xiàn)骨的解剖學(xué)位點(diǎn)，和較小程度地取決于病人的年齡。
Martin RB(生物醫(yī)學(xué)工程CRC重要綜述，10(3)，179-222，1984)描述骨小梁為“間斷的壁和支柱的復(fù)合系統(tǒng)”的。在小梁之間發(fā)現(xiàn)的空間稱為“髓空間”。小梁的方向是無規(guī)則的；但是，有時(shí)可以看見小梁的幾何結(jié)構(gòu)是球狀結(jié)構(gòu)，并且該球狀結(jié)構(gòu)是在骨上作用了壓力之后的。小梁的方向給定的區(qū)域是各向異性的，而小梁隨機(jī)放置的區(qū)域是各向同性的(例如，圖2)。
Whitehouse和Dyson(出處同上)以及Martin(出處同上)詳細(xì)地?cái)⑹隽斯晒侵行×汗堑目紫抖?。?.1表示了Whitehouse和Dyson確定的所有股骨區(qū)域的不同孔隙度和小梁寬度。
表1.1股骨小梁骨孔隙度和小梁寬度
已經(jīng)研究了小梁骨的結(jié)構(gòu)，如小梁寬度，孔隙度，各向異性和通常的模式如連接性和星體積。小梁骨公開的光學(xué)和掃描電子顯微圖表明小梁(即孔)勾勒的髓空間是1到幾毫米范圍，并且由大小范圍為約0.3到1毫米的孔互連。
當(dāng)本發(fā)明中形成的聚合物生產(chǎn)的小梁的用途是生理應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選地從任何生物相容性聚合物制備聚合物支架結(jié)構(gòu)。術(shù)語“生物相容性”，正如本文所用，指對(duì)細(xì)胞沒有毒性和允許細(xì)胞定居其上的聚合物。適當(dāng)?shù)木酆衔锏睦影ň?丙交酯)，各種比例的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚苯乙烯，聚(乙交酯)，聚(丙烯酸酯)，聚(異丁烯酸甲酯)，聚(羥基乙基異丁烯酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(碳酸酯)，聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)，聚(酸酐)，聚(乙烯)，聚(丙烯)，聚(羥基丁酸酯)，聚(羥基戊酸酯)，聚(氨基甲酸酯)，聚醚氨酯，聚醚型氨基甲酸酯，多芳基化合物，聚(酰亞胺)，聚(酸酐-共-酰亞胺)，聚(氨基酸)和聚(磷腈)。在與細(xì)胞移植相關(guān)的本發(fā)明的支架結(jié)構(gòu)的應(yīng)用中，可生物降解的脂族聚酯如聚乳酸(polylactic acid)及其衍生的聚合物代表了特別有用的一類聚合物，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于人的臨床。在這點(diǎn)上，用作支架結(jié)構(gòu)的優(yōu)選的聚合物是PLGA，特別是含有高于50％聚(DL-交酯)的混合物如PLGA8515和PLGA7525。
本發(fā)明的支架結(jié)構(gòu)的適當(dāng)用途是根據(jù)聚合物組成和結(jié)構(gòu)變化的。例如，可生物降解的聚合物支架結(jié)構(gòu)適用于體外的用途和/或體內(nèi)的細(xì)胞移植。在移植人體內(nèi)之前，基質(zhì)可以作為支持物或支架結(jié)構(gòu)以在體外培養(yǎng)細(xì)胞。支架結(jié)構(gòu)也可以直接用于體內(nèi)，而沒有預(yù)先接種細(xì)胞。在兩種用途(有或沒有預(yù)先的細(xì)胞接種)中，本發(fā)明的可生物降解聚合物基質(zhì)特別實(shí)用于三維組織的生長，并且可用于結(jié)締組織，如骨，軟骨，牙周組織，以及牙齒組織和其它器官，如肝或胸的組織的生長。
本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)的明顯特征是存在的大孔至少50％的直徑范圍為0.5-3.5毫米，這是在人小梁骨中發(fā)現(xiàn)的代表性范圍。優(yōu)選地，大孔的直徑至少1.0毫米，最優(yōu)選地，大孔的直徑范圍約1.0-3.5毫米。除了其大孔結(jié)構(gòu)，支架結(jié)構(gòu)的特征中還有高水平的互連度，互連度增強(qiáng)了細(xì)胞在支架結(jié)構(gòu)中的滲透和將營養(yǎng)流動(dòng)到細(xì)胞。至少0.35毫米的大孔性互連在聚合物支架結(jié)構(gòu)中提供了“開放細(xì)胞”的環(huán)境，這對(duì)于促進(jìn)組織在支架結(jié)構(gòu)中全面生長，即三維組織生長是重要的。
大孔是由可能或可能不基于片層結(jié)構(gòu)的有孔聚合物壁勾勒的?？妆诘目偤穸炔淮笥诩s0.4毫米，優(yōu)選地不大于約0．3毫米?？妆诘幕ミB程度是取決于加工的溫度的其它因子的。
一個(gè)驚人的和出乎意料的結(jié)果是通過大孔和微孔性互連，每個(gè)大孔與大量的鄰近大孔流動(dòng)聯(lián)系。
本文敘述了利用新的相轉(zhuǎn)換顆粒瀝濾的方法在不同溫度獲得具有不同孔壁結(jié)構(gòu)的支架結(jié)構(gòu)。
如利用Northern Eclipse成象分析軟件估計(jì)，對(duì)于所有獲得的支架結(jié)構(gòu)，聚合物支架結(jié)構(gòu)的孔隙度至少是50％的水平，優(yōu)選地水平高于50％。本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)的孔隙度水平也與“開放細(xì)胞”特性相關(guān)，在大孔之間產(chǎn)生了明顯的重疊(產(chǎn)生大孔通道)，確定了本發(fā)明的支架結(jié)構(gòu)的高度互連特性，進(jìn)一步增強(qiáng)了它作為細(xì)胞生長的支架結(jié)構(gòu)的用途。在這點(diǎn)上，孔隙度水平優(yōu)選地大于約75％，而最優(yōu)選的孔隙度水平大于85％。
本發(fā)明的支架結(jié)構(gòu)的特征使它特別適用于組織工程，更值得注意地可用于細(xì)胞移植，因?yàn)樗峁┝思?xì)胞以三維方式通過支架結(jié)構(gòu)的互連大孔網(wǎng)絡(luò)可以定居的生物相容性的支架結(jié)構(gòu)。這在考慮任何產(chǎn)生組織，特別是需要新血管生成的組織如骨組織的細(xì)胞的移植時(shí)是重要的。另外，當(dāng)用于細(xì)胞移植時(shí)，支架結(jié)構(gòu)是可生物降解的，其降解是可以控制的，所以細(xì)胞生長可以和支架結(jié)構(gòu)的降解同時(shí)進(jìn)行。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，為了進(jìn)一步增強(qiáng)用作細(xì)胞生長的支架結(jié)構(gòu)的特性，可以修飾本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)。通常影響用作細(xì)胞生長的支持物的結(jié)構(gòu)的修飾也適用于修飾本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)。這樣的修飾的作用是增強(qiáng)生物學(xué)應(yīng)答，并且包括例如利用膠原，磷酸鈣，糖蛋白，蛋白質(zhì)，肽，碳水化合物和多糖，或通過酸/堿處理修鉓表面。另外，聚合物支架結(jié)構(gòu)可以作為增強(qiáng)細(xì)胞功能的活性分子如蛋白質(zhì)，生長因子的遞送的存儲(chǔ)器。
利用顆粒瀝濾方法和相轉(zhuǎn)換方法結(jié)合的新方法可以制造本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)。在開始的步驟中，將選定的聚合物支架結(jié)構(gòu)制備成液體聚合物。如本文所用，術(shù)語液體聚合物指單獨(dú)或混合另一液體的液體形式的聚合物。這可以通過混合溶劑中的聚合物形成聚合物溶液進(jìn)行。通常用于制備聚合物溶液的任何溶劑可以用于這一目的，包括二甲亞砜(DMSO)，二氯甲烷，乙酸乙酯，氯仿，丙酮，苯，2-丁酮，四氯化碳，氯仿，正庚烷，正己烷和正戊烷。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的，非細(xì)胞毒性溶劑如DMSO可優(yōu)選地用于制備溶液，從而對(duì)細(xì)胞生長沒有不利影響。在聚合物溶液中的聚合物的濃度將隨著用于制造支架結(jié)構(gòu)的聚合物的特性而變化?；蛘撸訜峋酆衔锏饺埸c(diǎn)也可以形成液體聚合物。
然后，將液體聚合物與適當(dāng)大小的與方法中的顆粒瀝濾相相關(guān)的顆?；旌?。具有相當(dāng)于聚合物支架結(jié)構(gòu)中大孔的需要直徑的直徑的顆粒是適當(dāng)?shù)?，具體地，顆粒具有的直徑范圍0.5-3.5毫米。更優(yōu)選地，顆粒具有的直徑大于1.0毫米，最優(yōu)選地顆粒具有的直徑在1.0和2.0毫米之間。適當(dāng)?shù)呐c聚合物混合的顆粒的例子包括，多糖(如葡萄糖)，有機(jī)和無機(jī)鹽，適當(dāng)大小的蛋白質(zhì)和脂，它們可以溶解于不是聚合物的溶劑的溶劑(即聚合物非溶劑)。與聚合物溶液混合的顆粒的量同樣隨著用于制造本發(fā)明的支架結(jié)構(gòu)的聚合物的特性而變化。
當(dāng)已經(jīng)完全將顆粒與液體聚合物混合形成顆粒聚合物混合物時(shí)，將聚合物進(jìn)行相轉(zhuǎn)換步驟，在此步驟中將聚合物從液體轉(zhuǎn)換成固體。將顆粒聚合物混合物浸沒在聚合物非溶劑，即聚合物不溶于其中的溶劑中完成這一步驟。這樣的聚合物非溶劑包括例如，水，乙醇，1-4二噁烷和腈。
為了獲得特定形態(tài)的固體聚合物支架結(jié)構(gòu)，在相轉(zhuǎn)換步驟中可以將聚合物混合物放置于模子中。優(yōu)選地，例如通過冷凍聚合物顆粒漿液可以將液體聚合物固定在顆粒周圍。這樣，可不使用模子，并且從所有外表面同時(shí)發(fā)生了相轉(zhuǎn)換過程。例如當(dāng)聚合物溶劑是DMSO時(shí)，將聚合物冷卻到小于或等于12℃的溫度，這是DMSO的冷凍溫度。也可以利用冷卻溫度如小于0℃的溫度。在方法的這一步驟中利用低溫(例如，-20℃或-80℃)的結(jié)果是隨后形成了不同形態(tài)的聚合物支架結(jié)構(gòu)(例如實(shí)施例4)，如較厚的表層結(jié)構(gòu)，如實(shí)施例1所述，這種結(jié)構(gòu)在用作三維細(xì)胞生長的支架結(jié)構(gòu)之前是可以除去的。除了冷卻，也可以利用其它穩(wěn)定聚合物-顆?；旌衔锏姆椒?，例如膠凝化(增加黏度)。
在聚合物混合物從液體轉(zhuǎn)換成固體相之后，將聚合物進(jìn)行顆粒瀝濾。在方法的這一步驟中，將聚合物浸沒在顆粒溶劑，即，溶解完全分散于聚合物的顆粒但不溶解聚合物本身的溶劑中。當(dāng)然，適當(dāng)?shù)念w粒溶劑取決于顆粒和聚合物的特性。適當(dāng)?shù)念w粒溶劑的例子包括水，乙醇，1-4二噁惡烷和腈。特定的溶劑的溫度可能根據(jù)對(duì)得到的聚合物的支架結(jié)構(gòu)的最小影響而變化。但是，該溫度通常在顆粒溶劑的冷凍點(diǎn)和聚合物的玻璃轉(zhuǎn)變溫度之間，從而聚合物在非溶劑溫度的影響下不會(huì)熔融或變得粘稠。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)顆粒溶劑是水，聚合物是PLGA7525時(shí)，利用的顆粒溶劑溫度在0℃和45℃之間。
將聚合物浸沒在顆粒溶劑中適當(dāng)時(shí)間，以使分散在整個(gè)聚合物支架結(jié)構(gòu)中的顆粒完全溶解。通常，至少需要24小時(shí)才能達(dá)到聚合物支架結(jié)構(gòu)中的顆粒完全溶解，而優(yōu)選地至少48小時(shí)。為了加快顆粒的有效溶解，在溶解過程中需要以頻繁的間隔將聚合物浸沒在新鮮的溶劑中，例如約8-9小時(shí)的間隔或利用循環(huán)溶劑浴。
在利用同時(shí)是聚合物非溶劑和顆粒溶劑的溶劑時(shí)，相轉(zhuǎn)換和顆粒瀝濾過程可以在一個(gè)步驟中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中利用了雙蒸餾水(ddH2O)。
在適當(dāng)顆粒溶解時(shí)期之后可以從顆粒溶劑中移取聚合物支架結(jié)構(gòu)，在使用之前可以真空干燥或在乙醇(如70％乙醇)中消毒，漂洗，和在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，備用。如果不是立即使用聚合物支架結(jié)構(gòu)，需要在干燥器中干燥存儲(chǔ)，防止滯留水分和聚合物可能的降解。
本發(fā)明的方法有利地產(chǎn)生具有獨(dú)特特征的聚合物支架結(jié)構(gòu)，特別是產(chǎn)生了具有互連的大孔網(wǎng)絡(luò)的聚合物支架結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的兩步驟方法的另一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是它提供了控制得到的聚合物支架結(jié)構(gòu)的形態(tài)的放大手段。用另一句話說，本方法提供了兩個(gè)階段，顆粒瀝濾和相轉(zhuǎn)換，在這兩個(gè)階段中影響聚合物支架結(jié)構(gòu)的形態(tài)。例如，在本方法的顆粒瀝濾和相轉(zhuǎn)換階段可以改變大孔的大小和分布并且由顆粒大小和分布，和在較小的程度上由加工支架結(jié)構(gòu)的溫度控制大孔的大小和分布。另外，改變相轉(zhuǎn)換的速度可以影響互連的形成和大小。改變一系列變量包括溫度，聚合物非溶劑的類型和聚合物的濃度可以改變相轉(zhuǎn)換的速度。所以，支架結(jié)構(gòu)的最后形態(tài)是可以控制的。優(yōu)選地，得到的形態(tài)相似于人的小梁骨的形態(tài)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了利用本文敘述的聚合物支架結(jié)構(gòu)培養(yǎng)三維生長的細(xì)胞的方法。本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)的新的互連大孔結(jié)構(gòu)特別適用于組織工程，特別是骨組織工程，其是目前利用的骨修復(fù)治療的一個(gè)有前途的替代方法。在這點(diǎn)上，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法可以將骨髓派生的細(xì)胞接種到聚合物支架結(jié)構(gòu)中(如Maniatopoulos，細(xì)胞組織研究254，317-330，1988中所述)。將細(xì)胞接種到聚合物支架結(jié)構(gòu)上并且在適當(dāng)?shù)纳L條件下培養(yǎng)。將適于建立生長的培養(yǎng)基提供給培養(yǎng)物。
如上所述，各種類型的細(xì)胞可以在本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)中全面生長。但是，本發(fā)明的聚合物支架結(jié)構(gòu)特別適用于生骨細(xì)胞，建立骨基質(zhì)的細(xì)胞的生長。在組織工程中，細(xì)胞可以是任何起源的。有利地，細(xì)胞是人起源的。本發(fā)明的在本發(fā)明的三維聚合物支架結(jié)構(gòu)中生長細(xì)胞的方法使得接種的例如生骨細(xì)胞在體外時(shí)期滲透聚合物支架結(jié)構(gòu)以制成骨基質(zhì)，這些細(xì)胞彌漫分布在聚合物支架結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)中，特別是分布的深度至少2.5倍于平均大孔大小的深度。生骨細(xì)胞的滲透和作為結(jié)果的骨基質(zhì)的確立可以通過機(jī)械的，超聲波的，電場(chǎng)或電子手段增強(qiáng)。
下面的特定實(shí)施例敘述的是本發(fā)明的實(shí)施方案，它們只作為例子，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1-制備PLGA7525聚合物支架結(jié)構(gòu)利用固有黏度0.87dL/g的PLGA7525(從Birmingham聚合物公司得到)可以制備本發(fā)明的PLGA7525聚合物支架結(jié)構(gòu)。將1毫升在DMSO中的0.1克/毫升PLGA7525與2克葡萄糖結(jié)晶(顆粒大小范圍0.8毫米到2毫米)在鋁模中混合。將PLGA7525-DMSO混合物冷卻到-20℃。將PLGA7525-DMSO混合物的這一溫度稱為T混合物。然后，在0℃，將冷凍的PLGA7525塊浸沒在聚合物的非溶劑，ddH2O的冰-水混合液中。水的這一溫度稱為T非溶劑。將塊保留在ddH2O中48小時(shí)，在這過程中約每8小時(shí)更換ddH2O。然后，從水中移取得到的支架結(jié)構(gòu)，在0.01毫米汞柱下真空干燥72小時(shí)，并且在真空下在干燥器中4℃儲(chǔ)藏直到使用。然后，全面分析利用上面的條件獲得的支架結(jié)構(gòu)。
如圖3A所示，利用解剖顯微鏡在低倍數(shù)(16×)下觀察2毫米厚的聚合物支架結(jié)構(gòu)切片的大孔結(jié)構(gòu)。在整個(gè)聚合物支架結(jié)構(gòu)中，可以觀察到均一分布了大小范圍約0.8-1.5毫米的互連大孔。大孔具有橢圓形態(tài)和含有微孔的厚孔壁(約300微米的厚度)。
然后，在Tissue-Tek浸沒培養(yǎng)基(Miles#4583)中浸沒聚合物支架結(jié)構(gòu)，在-20℃，在恒冷切片機(jī)中切片。在玻璃片(VWR Canlab)上收集一系列20微米厚的切片(50個(gè)切片)。利用解剖顯微鏡，在低倍數(shù)(16×)下將切片照相，并且掃描。圖3B是鑒定支架結(jié)構(gòu)的孔成分，大孔，大孔性互連(通道)和微孔性互連(通道)的掃描支架結(jié)構(gòu)切片。在聚合物支架結(jié)構(gòu)的外表面觀察到了聚合物薄膜(即，表層)。將圖像轉(zhuǎn)換成TIFF膠片，利用Northern Eclipse成像分析軟件，在PC計(jì)算機(jī)上分析。利用“單個(gè)測(cè)量”菜單測(cè)量每個(gè)掃描切片的孔壁大小(面積，周長，直徑等等)。利用“數(shù)據(jù)測(cè)量”途徑計(jì)算每個(gè)掃描玻片的孔壁支柱的面積和數(shù)目。
利用上面提到的掃描圖象的倍數(shù)確定象素/毫米比例，通過校正系統(tǒng)將這些測(cè)量數(shù)據(jù)從象素單位轉(zhuǎn)換成毫米。大孔的大小是利用軟件工具在聚合物支架結(jié)構(gòu)切片的數(shù)字化圖象上從一個(gè)孔壁到鄰近的孔壁手劃一條線確定的。正如利用Northern Eclipse圖象分析軟件確定的，得到的聚合物支架結(jié)構(gòu)的特征如下大孔大小1.79+/-0.42毫米大孔性互連 0.37+/-0.1 5毫米孔壁厚度0.29+/-0.13毫米微孔0.10+/-0.05毫米孔隙度 86.7+/-2.43％利用汞孔隙度計(jì)(Quantachrome Autoscan 60)同樣估計(jì)了聚合物基質(zhì)的孔隙度。將具有5立方厘米細(xì)胞主干體積的固體透度計(jì)用于0.015到0.020克范圍的樣品。從汞侵入的體積計(jì)算孔的體積的值。從汞侵入體積計(jì)算的孔隙度為89.6％。利用Northern Eclipse圖象分析軟件估計(jì)的孔隙度(～87％)基本等同于汞孔隙度計(jì)測(cè)量的～90％的孔隙度，當(dāng)分析孔直徑大于～75微米的聚合物支架結(jié)構(gòu)時(shí)，汞孔隙度計(jì)方法是不精確的。
同樣可以利用掃描電子顯微鏡(SEM)分析制備的聚合物支架結(jié)構(gòu)。將支架結(jié)構(gòu)以約2毫米的厚度制成橫斷面切片，并且在氬氣下用金噴灑涂覆(Polaron儀器公司，Doylestown，PA)。在日立2500SEM上，加速電壓15kV進(jìn)行掃描電子顯微成象。利用SEM顯微圖確定了大孔的直徑約1到1.5毫米，雖然并不總是觀察到每個(gè)大孔之間清楚的分離能夠說明這些聚合物支架結(jié)構(gòu)的非常開放的互連結(jié)構(gòu)。
正如圖3C所示，利用SEM證實(shí)了如光學(xué)顯微鏡下觀察到的孔壁的微孔特性。
聚合物支架結(jié)構(gòu)的機(jī)械測(cè)試如下。制備了1.5厘米直徑和高度的圓柱形聚合物支架結(jié)構(gòu)，利用Instron機(jī)械測(cè)試儀測(cè)試。在單軸伺服水力測(cè)試機(jī)器(Instron1331型裝載框架，具有Series 2150控制器)進(jìn)行機(jī)械實(shí)驗(yàn)。將1千克載荷室(Sensotec,31/4680型)用于所有壓縮測(cè)試。利用DC線性變化差示轉(zhuǎn)化器(LVDT，intertechnology SE374型)測(cè)量調(diào)節(jié)器的偏差。在數(shù)字儲(chǔ)存示波器(Gould，1425型)上測(cè)試的過程中，展示了來自載荷室和LVDT的信號(hào)。將信號(hào)輸入加速蘋果Ⅱe計(jì)算機(jī)的16道，12位模擬-數(shù)字(A/D)轉(zhuǎn)換器中。這些實(shí)驗(yàn)捕獲數(shù)據(jù)的速度是430對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)/秒。聚合物支架結(jié)構(gòu)的壓縮發(fā)生的速度是0.1毫米/秒。正如圖4A所示，壓縮強(qiáng)度對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)變形百分?jǐn)?shù)的曲線顯示了兩個(gè)模量。第一個(gè)彈性區(qū)的楊氏模量(稱為Y1)是0.76±0.12MPa,第二個(gè)彈性區(qū)的楊氏模量(稱為Y2)是0.18±0.016MPa。
實(shí)施例2-聚合物濃度對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)的影響利用實(shí)施例1中詳細(xì)描述的方案確定DMSO中PLGA7525的濃度對(duì)得到的聚合物支架結(jié)構(gòu)的影響。如實(shí)施例1所述當(dāng)所有其它條件維持恒定時(shí)，利用三個(gè)不同的DMSO中PLGA7525的濃度(0.05克/毫升，0.1克/毫升和0.2克/毫升)制造聚合物基質(zhì)。
利用剃刀將制備的每個(gè)聚合物支架結(jié)構(gòu)切成一半。發(fā)現(xiàn)不管DMSO中PLGA7525的起始濃度多少，每個(gè)上面都有表層結(jié)構(gòu)。測(cè)定3個(gè)不同的聚合物支架結(jié)構(gòu)的機(jī)械特征，并且在圖4B中說明。觀察到在利用0.05毫克/毫升的DMSO中的PLGA制備的聚合物支架結(jié)構(gòu)中楊氏模量有明顯的下降，而最硬的支架結(jié)構(gòu)是利用2毫克/毫升的PLGA7525獲得的。
在光學(xué)顯微鏡和SEM下觀察這些支架結(jié)構(gòu)。在光學(xué)顯微鏡下，在三個(gè)聚合物支架結(jié)構(gòu)之間可以檢測(cè)到結(jié)構(gòu)上沒有差異。但是，當(dāng)在SEM下觀察時(shí)，利用在DMSO中的0.05克/毫升PLGA產(chǎn)生的支架結(jié)構(gòu)比利用在DMSO中的0.2克/毫升PLGA具有更多的片層壁結(jié)構(gòu)和更多的微孔性互連(參見圖5)，后者觀察到了較少的微孔孔互連(參見圖6)。
實(shí)施例3-顆粒對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)的影響如下確定改變與PLGA聚合物混合的葡萄糖顆粒的量和大小對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)的影響。保持實(shí)施例1所述的所有其它條件恒定，將不同量的葡萄糖顆粒(0.5克，1克和2克)分別與1毫升聚合物溶液混合。利用篩過的顆粒(標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試篩，VWR，West Chester,PA)同樣測(cè)定顆粒大小對(duì)最后支架結(jié)構(gòu)的形態(tài)的影響1)NaCl結(jié)晶(＜0.35毫米)，2)蔗糖結(jié)晶(0.54毫米<結(jié)晶大?。?.8毫米)和3)葡萄糖結(jié)晶(0.8毫米＜結(jié)晶大?。?毫米)。通過光學(xué)顯微鏡觀察得到的聚合物支架結(jié)構(gòu)。當(dāng)將聚合物溶液與顆?；旌蠒r(shí)，可以看見對(duì)于小量的顆粒(即，0.5克/毫升)，聚合物溶液沒有完全浸沒在顆粒床中。在相轉(zhuǎn)換成膜結(jié)構(gòu)后得到這一聚合物溶液層，其相似于沒有利用顆粒時(shí)看到的。更大的顆粒溶液密度(即，2.0克/毫升)完全浸潤了聚合物溶液，以致得到的支架結(jié)構(gòu)中分布了大孔，而沒有這一膜結(jié)構(gòu)。
大孔的大小直接與利用的顆粒的大小成比例，例如，大孔大小是～0.33毫米，利用的顆粒＜0.35毫米(例如圖7A)，和大孔的大小0.75毫米，利用的顆粒大小范圍是0.54到0.8毫米(例如，圖7B)。最后對(duì)于大于0.8毫米的顆粒，觀察到的大孔是～1.4毫米(例如，圖7C)。當(dāng)沒有顆粒與聚合物-DMSO溶液混合時(shí)，如圖8說明，得到的聚合物結(jié)構(gòu)是含有微孔的厚表層組成的中空的圓筒。這一表層非常相似于正常相轉(zhuǎn)換方法得到的膜結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4-加工溫度對(duì)聚合物支架結(jié)構(gòu)的影響研究了在T非溶劑(0℃)恒定時(shí)，三個(gè)不同的T混合物(11℃，-20℃和-80℃)的影響。利用1)T混合物=11℃和2)T混合物=-20℃和T混合物＝-80℃獲得了兩種主要不同的支架結(jié)構(gòu)。利用T混合物=11℃和T非溶劑＝0℃獲得的支架結(jié)構(gòu)是無表層的，顯示了非常開放的結(jié)構(gòu)。正如圖9A所示，大孔大小似乎是擴(kuò)展了，利用SEM估計(jì)為～2.72毫米?？妆诰哂休^少的微孔，但具有較多的大孔性互連，提供給支架結(jié)構(gòu)一個(gè)更開放的結(jié)構(gòu)。對(duì)于T混合物=-20℃和-80℃獲得的支架結(jié)構(gòu)都具有表層結(jié)構(gòu)。對(duì)于T混合物=-20℃，大孔似乎小于更高的T混合物獲得的支架結(jié)構(gòu)上的大孔，通過SEM估計(jì)約為～1.8毫米?？妆谑瞧瑢樱罂仔曰ミB較少，但微孔性互連較多(例如，圖9B)。觀察到更低的T混合物時(shí)大孔大小降低。在T混合物=11℃和T混合物=-20℃產(chǎn)生的支架結(jié)構(gòu)之間，大孔大小的差異特別重要，而在T混合物=-20℃和T混合物=-80℃產(chǎn)生的支架結(jié)構(gòu)之間觀察到了較小的大孔大小的差異。當(dāng)大孔大小隨著T混合物縮減時(shí)，孔壁的結(jié)構(gòu)也如上所述改變了。T混合物的差異可能已經(jīng)影響聚合物沉淀的速度，所以影響孔壁結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。
同時(shí)在T混合物恒定-20℃時(shí)，研究了不同的T非溶劑(40℃，20℃和0℃)。在這種情況下，在所有支架結(jié)構(gòu)之間的主要不同是它們的孔壁厚度。與勾勒每個(gè)大孔的聚合物支柱相比，更低的T非溶劑產(chǎn)生更厚和更復(fù)雜的孔壁，而更高的T非溶劑產(chǎn)生薄和緊密的孔壁。圖9B和圖9C顯示了在T非溶劑=0℃和40℃時(shí)的支架結(jié)構(gòu)的不同形態(tài)。在T非溶劑=0℃和T非溶劑=20℃產(chǎn)生的支架結(jié)構(gòu)可以觀察到最大的結(jié)構(gòu)差異。在T非溶劑=20℃或40℃獲得的支架結(jié)構(gòu)觀察到了更小的差異。更低的T非溶劑(0℃)提供片層孔壁(例如，圖9B)，更高的T非溶劑(40℃)提供了支柱狀孔壁形態(tài)(例如，圖9C)。
通過SEM估計(jì)了在不同T非溶劑產(chǎn)生的支架結(jié)構(gòu)的孔壁的厚度。在T非溶劑=0℃時(shí)，估計(jì)孔壁為0.29毫米，而在T非溶劑=20℃時(shí)，孔壁的大小約為0.10毫米；在T非溶劑=20℃和40℃之間沒有測(cè)量到明顯的差異。將上面提到的各種溫度產(chǎn)生的所有支架結(jié)構(gòu)切片，測(cè)量孔大小和孔壁厚度。利用Northern Eclipse成象分析軟件估計(jì)它們的孔隙度。獲得下面的結(jié)果
實(shí)施例5-聚合物支架結(jié)構(gòu)的表面修飾通過酸/堿處理；膠原沉積；和磷酸鈣沉積可以進(jìn)一步表面修飾實(shí)施例1所述獲得的支架結(jié)構(gòu)。方法和結(jié)果如下；利用酸/堿處理增強(qiáng)表面電荷和改變表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。將支架結(jié)構(gòu)維持在幾種乙酸濃度(0.1M，1M，5M)下24小時(shí)。將支架結(jié)構(gòu)也維持在各種濃度的NaOH下24小時(shí)，觀察表面聚合物鏈的水解。在SEM下，5M乙酸或0.1MNaOH處理24小時(shí)的支架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，出現(xiàn)了納孔。
設(shè)計(jì)膠原沉積實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)聚合物表面的細(xì)胞粘連。在0.1％膠原中維持支架結(jié)構(gòu)1小時(shí)，5小時(shí)，8小時(shí)和24小時(shí)。
進(jìn)行磷酸鈣沉積實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)支架結(jié)構(gòu)表面的細(xì)胞粘連。在37℃，在完全補(bǔ)充的培養(yǎng)基(如實(shí)施例6所述)維持支架結(jié)構(gòu)1星期。通過Von Kossa染色可以看見支架結(jié)構(gòu)表面上的磷酸鈣結(jié)晶。
進(jìn)一步進(jìn)行CaP沉積實(shí)驗(yàn)，其中在室溫下，將支架結(jié)構(gòu)浸在1.5毫摩爾/升的Na2HPO4中2小時(shí)，進(jìn)一步在飽和的Ca2+溶液中平衡過夜。然后，在SEM下觀察支架結(jié)構(gòu)，觀察到在支架結(jié)構(gòu)上有葉狀形態(tài)的結(jié)晶(圖10)。
實(shí)施例6-在聚合物支架結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)骨髓起源的細(xì)胞如上所述制備PLGA7525聚合物支架結(jié)構(gòu)在0.1克/毫升二甲亞砜(DMSO，BDH，多倫多，ON)中的PLGA7525溶液中將2克/毫升葡萄糖結(jié)晶分散。在11℃冷凍聚合物漿液。然后，沉淀聚合物，在40℃，在ddH2O中，從沉淀的聚合物萃取葡萄糖結(jié)晶。干燥支架結(jié)構(gòu)到質(zhì)量恒定(10微米Hg,72小時(shí))，在70％EtOH消毒1/2小時(shí)，在α-MEM中漂洗3次，在37℃，在無菌的α-MEM中平衡6天。
利用其它文章(如Maniatopoulos等人，出處同上，和Davies等人，細(xì)胞和材料，13-15，1991所述)所述的方案和培養(yǎng)基，將第一代初級(jí)骨髓起源細(xì)胞接種到0.25立方厘米的支架結(jié)構(gòu)上。簡(jiǎn)要地說，從幼小成年雄性Wistar大鼠(約150克)的兩個(gè)股骨收集骨髓派生的細(xì)胞，放入完全補(bǔ)充的培養(yǎng)基(FSM)補(bǔ)充了15％胎牛血清，50％毫克/毫升抗壞血酸，10毫摩爾/升β-甘油磷酸和抗生素(0.1毫克/毫升青霉素G，0.05毫克/毫升慶大霉素和0.3毫克/毫升兩性霉素)；10-8摩爾/升地塞米松(Dex)的α-MEM加入只有Dex+培養(yǎng)物的FSM。
在培養(yǎng)物中維持細(xì)胞6天，在第2天和第5天利用FSM再補(bǔ)充。在第6天將Dex-細(xì)胞利用PBS中的0.01％胰蛋白酶胰蛋白酶化，同時(shí)將可見鈣化信號(hào)的Dex+培養(yǎng)物利用PBS中0.01％胰蛋白酶和10微摩爾/升乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶化。然后在獨(dú)立的預(yù)浸濕的支架結(jié)構(gòu)上以7.5×105個(gè)細(xì)胞/支架結(jié)構(gòu)接種Dex-細(xì)胞。在37℃和5％CO2維持培養(yǎng)物42天，并且每2-3天再補(bǔ)充FSM。在Dex+細(xì)胞培養(yǎng)物的FSM中每次再補(bǔ)充Dex的濃度是10-8M。
在α-MEM中溶解鹽酸四環(huán)素粉末(Sigma，St.Louis，MO)制備90毫克/毫升的儲(chǔ)備液。制備含有15％胎牛血清，50毫克/毫升抗壞血酸，10毫摩爾/升α磷酸甘油和9毫克/毫升的四環(huán)素的α-MEM的新的含四環(huán)素的完全補(bǔ)充培養(yǎng)基(TFSM)。利用TFSM在40天的時(shí)候最后再補(bǔ)充培養(yǎng)基。在42天利用α-MEM洗滌培養(yǎng)物(10次，每次～3分鐘)，并且在Karnovsky固定劑(2.0％低聚甲醛，2.5％戊二醛和0.1摩爾/升可甲基酸鈉緩沖液，pH7.2-7.4)中固定過夜。利用少數(shù)培養(yǎng)物用于SEM觀察，在一系列遞級(jí)乙醇溶液(70％，100％)中脫水。在0.01毫米Hg冷凍干燥2天。在0.1摩爾/升可甲基酸緩沖鹽中保留所有其它培養(yǎng)物，用于組織學(xué)或聚焦觀察。
如下進(jìn)行聚焦觀察將樣品放置在0.1摩爾/升的可基酸緩沖鹽(從BDH得到)中的定做的室中。用玻璃蓋片封閉該室。利用BHS濾器，在Bio-Rad MRC-600聚焦激光顯微鏡中的光學(xué)斷面檢測(cè)熒光信號(hào)。如圖11所示，利用Dex(+)細(xì)胞接種的支架結(jié)構(gòu)顯示了熒光標(biāo)記深達(dá)約1毫米。在支架結(jié)構(gòu)中沒有觀察到更深的熒光，因?yàn)榫劢癸@微鏡的觀察范圍的深度不夠。因此，可以將支架結(jié)構(gòu)做成厚度約2毫米的切片。從兩側(cè)通過聚焦顯微鏡分析。觀察穿過整個(gè)支架結(jié)構(gòu)的熒光。同樣觀察了Dex(+)細(xì)胞接種的細(xì)胞接種支架結(jié)構(gòu)的切片的熒光標(biāo)記(參見圖12)。在紫外光下觀察利用Dex(-)和Dex(+)接種的聚合物支架結(jié)構(gòu)的橫斷面。在整個(gè)支架結(jié)構(gòu)中，只在Dex(+)切片上觀察到明亮的熒光信號(hào)。特定地，在培養(yǎng)物中利用的聚合物支架結(jié)構(gòu)的0.5厘米的深度通過熒光信號(hào)觀察到骨基質(zhì)的建立。在這一測(cè)試中的限制因子是聚合物支架結(jié)構(gòu)的深度；所以增加聚合物支架結(jié)構(gòu)的深度將增加細(xì)胞滲透的深度，由此，在這一聚合物支架結(jié)構(gòu)中可以形成骨基質(zhì)。
同時(shí)將支架結(jié)構(gòu)中的骨鈣蛋白免疫標(biāo)記。利用最后稀釋度1∶6000的山羊抗大鼠骨鈣蛋白抗血清(生物醫(yī)學(xué)技術(shù)公司，Stoughton MA)通過免疫組織化學(xué)方法測(cè)定Dex+和Dex-培養(yǎng)物中的骨鈣蛋白的表達(dá)。測(cè)試的最后是利用濃度1∶250的與辣根過氧化物酶抗血清共軛的猴抗山羊IgG第二次抗體標(biāo)記。對(duì)過氧化物酶(載體實(shí)驗(yàn)室，Burlingame CA)利用的底物試劑盒是3，3-二胺聯(lián)苯胺(DAB)，補(bǔ)充了氯化鎳染以便色。圖13顯示了利用Dex+細(xì)胞接種的骨鈣蛋白標(biāo)記的支架結(jié)構(gòu)，并且在培養(yǎng)物中維持6星期。獲得的支架結(jié)構(gòu)的組織學(xué)切片如下在Tissue Tek中包埋樣品以6毫米的厚度垂直切片。同樣，從組織學(xué)切片觀察支架結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞生長。在低的倍數(shù)下，整個(gè)支架結(jié)構(gòu)切片可以通過LM觀察。在Dex+和Dex-培養(yǎng)物中，在整個(gè)支架結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了覆蓋了細(xì)胞。在支架結(jié)構(gòu)的外表面以及中部，在所有的大孔中可以看見蘇木精和曙紅染色。圖14和15顯示了低倍放大的Dex+和Dex-培養(yǎng)的泡沫。正如在更高倍數(shù)下看見的，在Dex-培養(yǎng)物上建立的基質(zhì)的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比Dex+培養(yǎng)物豐富。在Dex+培養(yǎng)物中，只發(fā)現(xiàn)了在孔壁的襯著少數(shù)細(xì)胞層，產(chǎn)生了緊密附著孔壁的基質(zhì)，而在Dex-培養(yǎng)物中，整個(gè)大孔體積中充滿了基質(zhì)。
實(shí)施例7-在聚合物支架結(jié)構(gòu)上接種人髓細(xì)胞如實(shí)施例1所述制備PLGA7525基質(zhì)。將這些支架結(jié)構(gòu)在70％的乙醇中消毒30分鐘，然后利用Parker等人(J.ofBone Min.Res.,12(1)，S300F298，1997)詳細(xì)敘述的方案和含地塞米松(dex)的培養(yǎng)基，利用來自年輕供體的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種這些支架結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例8大孔大小和互連對(duì)細(xì)胞侵入的影響制備三個(gè)不同的支架結(jié)構(gòu)形態(tài)1)只通過顆粒瀝濾獲得的支架結(jié)構(gòu)，指現(xiàn)有技術(shù)的膜支架結(jié)構(gòu)形成部分，表示在圖16A，16B和16C，在下面簡(jiǎn)要地討論，2)如實(shí)施例1所述利用低加工溫度，通過顆粒瀝濾相轉(zhuǎn)換獲得的支架結(jié)構(gòu)，稱為中間體支架結(jié)構(gòu)和3)如實(shí)施例4所述利用更高的加工溫度，通過顆粒瀝濾相轉(zhuǎn)換獲得的支架結(jié)構(gòu)，稱為骨狀支架結(jié)構(gòu)。從這三個(gè)基本的加工途徑的每條途徑，產(chǎn)生了三個(gè)不同大孔大小的支架結(jié)構(gòu)，所以獲得了總共9個(gè)不同的支架結(jié)構(gòu)。圖16A到16I敘述了這9個(gè)結(jié)構(gòu)。
只利用顆粒瀝濾技術(shù)(如Mikos等人，生物材料14，323-330，1993所述)產(chǎn)生了膜支架結(jié)構(gòu)，參見圖16A，16B和16C所示的現(xiàn)有技術(shù)。簡(jiǎn)要地說，在氯仿中的PLGA75/25(Birmingham聚合物)溶液中接種篩過的顆粒；1)NaCl(大?。?.35毫米)，2)蔗糖結(jié)晶(大小范圍0.54到0.8毫米)或3)葡萄糖結(jié)晶(大小范圍0.8到2毫米)。將聚合物結(jié)構(gòu)保留在室溫下允許氯仿蒸發(fā)，然后，在ddH2O中溶解顆粒。
通過從沉淀的聚合物萃取如上所述的不同顆粒，如實(shí)施例1和4所述生產(chǎn)中間體和骨狀支架結(jié)構(gòu)。在-20℃的聚合物溶液溫度和室溫下的非溶劑產(chǎn)生了中間體支架結(jié)構(gòu)，而在11℃的聚合物溶液溫度和室溫下的非溶劑溫度產(chǎn)生了骨狀支架結(jié)構(gòu)。在70％的乙醇中消毒得到的支架結(jié)構(gòu)30分鐘，然后用細(xì)胞接種。
通過聚焦顯微鏡證實(shí)了細(xì)胞在支架結(jié)構(gòu)中的定居，利用實(shí)施例6中所述的骨鈣蛋白標(biāo)記測(cè)試證實(shí)了整個(gè)支架結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞分化。觀察的結(jié)果如下表2支架結(jié)構(gòu)大小和細(xì)胞定居方式
如表2報(bào)道的支架結(jié)構(gòu)的細(xì)胞定居需要最小的互連大小為0.35毫米和大孔大小0.7毫米。
在這一實(shí)施例中，具有大孔大小1.1毫米的膜支架結(jié)構(gòu)沒有定居細(xì)胞，而大孔大小0.7毫米的骨狀支架結(jié)構(gòu)完全定居了細(xì)胞。結(jié)論是，這一實(shí)施例證明顆粒瀝濾相轉(zhuǎn)換技術(shù)獲得的支架結(jié)構(gòu)允許在整個(gè)支架結(jié)構(gòu)形態(tài)中定居細(xì)胞，而前面公開的支架結(jié)構(gòu)只在淺的孔層內(nèi)定居細(xì)胞。已經(jīng)敘述的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案說明的是本發(fā)明的原理，沒有將本發(fā)明限制于特定地實(shí)施方案。所有實(shí)施方案定義的本發(fā)明的范圍都包括在下面的權(quán)利要求和它們的等當(dāng)內(nèi)容中。
權(quán)利要求
1.大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)，其中至少包括50％的直徑范圍約0.5到約3.5毫米的大孔。
2.如權(quán)利要求1定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，其中所述的聚合物支架結(jié)構(gòu)具有小梁或支柱狀形態(tài)。
3.如權(quán)利要求2定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，其中大孔是通過大孔性互連相互聯(lián)系的。
4.如權(quán)利要求3定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，其中大孔是通過微孔性互連相互聯(lián)系的。
5.如權(quán)利要求1定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，包括在所述的大孔之間的厚度至少0.4毫米的聚合物壁。
6.如權(quán)利要求4定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，其是生物相容性的。
7.如權(quán)利要求6定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，其是可生物降解的。
8.如權(quán)利要求6定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，包括從聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生的聚合物。
9.如權(quán)利要求8定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，包括75％聚丙交酯和25％聚乙交酯比例的聚合物聚(丙交酯-共-乙交酯)。
10.如權(quán)利要求7定義的聚合物支架結(jié)構(gòu)，具有至少85％的孔隙度。
11.制備聚合物支架結(jié)構(gòu)的方法，包括如下步驟將液體聚合物與顆粒合并形成顆粒一聚合物混合物；將顆粒-聚合物混合物浸沒在聚合物非溶劑中產(chǎn)生固化的顆粒-聚合物混合物；和將固化的顆粒-聚合物混合物浸沒在顆粒溶劑中足夠的時(shí)間以使顆粒溶解。
12.如權(quán)利要求11定義的方法，其中所述的液體聚合物是通過將聚合物與聚合物溶劑合并形成的。
13.如權(quán)利要求12定義的方法，其中所述的聚合物溶劑是DMSO。
14.如權(quán)利要求12定義的方法，其中顆粒具有的直徑在0.5到3.5毫米的范圍。
15.如權(quán)利要求14定義的方法，其中所述的顆粒具有的直徑在1.0到2.0毫米的范圍。
16.如權(quán)利要求11定義的方法，其中所述的顆粒選白糖或鹽顆?；蛱羌胞}顆粒。
17.如權(quán)利要求15定義的方法，其中所述的顆粒是糖顆粒。
18.如權(quán)利要求11定義的方法，另外包括修飾聚合物支架結(jié)構(gòu)的表面的步驟。
19.如權(quán)利要求11定義的方法，其中利用選自酸處理，堿處理，膠原沉積和磷酸鈣沉積的處理修飾聚合物支架結(jié)構(gòu)的表面。
20.在三維聚合物支架結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)組織使其彌漫性分布到至少2.5倍支架結(jié)構(gòu)中平均大孔大小的深度的方法，包括如下步驟用組織細(xì)胞接種聚合物支架結(jié)構(gòu)，所述的支架結(jié)構(gòu)包括具有大小范圍約0.5到約3.5毫米的大孔，包括互連大孔的大孔性和微孔性通道；培養(yǎng)所述的細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20定義的方法，其中所述的組織細(xì)胞是生骨細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21定義的方法，其中所述的細(xì)胞建立了骨基質(zhì)。
23.如權(quán)利要求22定義的方法，其中所述的細(xì)胞是人起源的。
24.如權(quán)利要求20定義的方法，其中培養(yǎng)所述的細(xì)胞用于體外和體內(nèi)應(yīng)用。
25.生物相容性聚合物小梁，包括具有至少50％孔隙度的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)，所述的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)包括具有0.5到3.5毫米范圍直徑的大孔，并包括在所述的大孔之間的互連。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的聚合物小梁，其中所述的互連包括大孔之間的大孔性和微孔性通道。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的聚合物小梁，其中在大孔之間的所述的大孔性通道具有的大小范圍是200微米到約2毫米。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的聚合物小梁，其中在大孔之間的所述的微孔性通道具有的大小的范圍是約50到150微米。
29.如權(quán)利要求28定義的聚合物小梁，其中所述的大孔通過孔壁相連，微孔性通道位于孔壁中。
30.如權(quán)利要求25定義的聚合物小梁，其中所述的孔隙度至少75％。
31.如權(quán)利要求25定義的聚合物小梁，其中所述的聚合物支架結(jié)構(gòu)是可生物降解的。
32.在三維聚合物小梁中培養(yǎng)組織使其彌漫性分布到至少2.5倍于支架結(jié)構(gòu)中平均大孔大小的深度的方法，包括如下步驟合成生物相容性聚合物小梁，其中包括具有至少50％的孔隙度的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)，所述的大孔聚合物支架結(jié)構(gòu)包括具有直徑范圍0.5到3.5毫米的大孔和所述大孔之間的大孔性和微孔性互連；將組織細(xì)胞接種到聚合物支架結(jié)構(gòu)；和培養(yǎng)所述的組織細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32定義的培養(yǎng)組織的方法，另外包括修飾聚合物支架結(jié)構(gòu)表面的步驟。
34.如權(quán)利要求33定義的方法，其中利用選自酸處理，堿處理，膠原沉積和磷酸鈣沉積的處理方法修飾聚合物支架結(jié)構(gòu)的表面。
35.如權(quán)利要求31定義的方法，其中所述的組織細(xì)胞是生骨細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求35定義的方法，其中所述的組織細(xì)胞建立了骨基質(zhì)。
37.如權(quán)利要求36定義的方法，其中所述的組織細(xì)胞是人起源的。
38.如權(quán)利要求37定義的方法，其中所述的組織細(xì)胞選自牙周組織細(xì)胞，軟骨組織細(xì)胞，牙組織細(xì)胞，肝組織細(xì)胞和乳腺組織細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求11定義的方法，包括在通過相轉(zhuǎn)換沉淀之前將所述的聚合物穩(wěn)定在顆粒周圍。
40.如權(quán)利要求39定義的方法，其中所述的穩(wěn)定步驟包括冷卻聚合物一顆?；旌衔锏竭m當(dāng)?shù)臏囟取?br> 全文摘要
本發(fā)明提供了包括廣泛互連的大孔網(wǎng)絡(luò)的聚合物支架結(jié)構(gòu)。該聚合物支架結(jié)構(gòu)包含了直徑范圍0.5—3.5毫米,優(yōu)選地范圍1.0—2.0毫米的大孔。利用一種新方法制備了該聚合物支架結(jié)構(gòu),該方法有利地結(jié)合了顆粒瀝濾和相轉(zhuǎn)換的技術(shù),得到了能夠控制得到的聚合物支架結(jié)構(gòu)的形態(tài)的放大方法。該聚合物支架結(jié)構(gòu)在組織工程領(lǐng)域,特別是作為體外和體內(nèi)細(xì)胞生長的支架結(jié)構(gòu)中具有用途。
文檔編號(hào)A61F2/00GK1285757SQ98813129
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1998年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月14日
發(fā)明者昌塔爾·E·霍利, 莫莉·S·紹伊切特, 約翰·E·戴維斯 申請(qǐng)人:博恩泰克公司