一種葡萄球菌裂解酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種能殺滅葡萄球菌，特別是金黃色葡萄球 菌裂解酶及其在葡萄球菌殺滅、檢測等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)生化反應(yīng)和產(chǎn)生色素不同，葡萄球菌可分為金黃色葡萄球菌 (staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis)和腐生葡萄球 菌（staphylococcus saprophytics)等三種。其中金黃色葡萄球菌多為致病菌，表皮葡萄 球菌偶爾致病，腐生葡萄球菌一般不致病。金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus)是 一種常見的革蘭氏陽性球菌，能引起人和動物的許多嚴重的感染，同時也是醫(yī)院感染常見 的病原體之一。葡萄球菌易于對抗生素產(chǎn)生抗性，包括常見的各種抗生素，以及新型的抗微 生物制劑。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)的出現(xiàn)和廣泛傳播給臨床治療帶來了前所 未有的挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對葡萄球菌的耐藥性問題，常需要提取葡萄球菌基因組DNA，用于PCR 檢測臨床菌株是否是MRSA等等。然而，由于葡萄球菌細胞壁堅厚，常規(guī)的蛋清溶菌酶對其 沒有明顯的溶壁作用，而具有良好溶壁效果的溶葡萄球菌素價格昂貴，難以普遍應(yīng)用。
[0003] 噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體感染宿主細菌后晚期表達的一種細胞壁水解酶。 裂解酶大小通常為25kD~40kD，在結(jié)構(gòu)上由兩個獨立的功能域構(gòu)成，N-端的催化功能域， 和一個決定細胞結(jié)合位點的C-端細胞壁結(jié)合功能域（CBD)，二者之間由一個小片段鏈接。 序列分析表明，同一類裂解酶的催化域高度保守，而細胞結(jié)合域可變，這為構(gòu)建新的嵌合裂 解酶提供了可能。裂解酶具有很高的特異性，只能特異性的識別和裂解特定種類的細菌。 此外，裂解酶作用位點很保守，加上噬菌體與細菌共同進化的特異性，宿主菌很難對其產(chǎn)生 抗性。裂解酶的這些特點，為其用于臨床上耐藥細菌的控制和治療提供了理論的可行性。 到目前為止，已有一些能作用于金黃色葡萄球菌的天然裂解酶以及嵌合裂解酶被報道，這 些酶可以在體內(nèi)、體外較好地殺滅金黃色葡萄球菌。但是這些裂解酶大多比較難于可溶性 表達，或者活性不高，或者不能適應(yīng)高蛋白環(huán)境（如牛奶等），作用pH范圍較窄，一般在pH 5-8。尋找能可溶、大量表達以及高活性的裂解酶對于開發(fā)新的抗葡萄球菌的藥物，體外控 制葡萄球菌的感染，裂解葡萄球菌的細胞壁用于檢測等等都具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可溶表達、活性高的葡萄球菌裂解酶及其 應(yīng)用。該種裂解酶能在體外、體內(nèi)殺滅葡萄球菌，特別是金黃色葡萄球菌。為了敘述方便， 我們命名為ClyO,其編碼基因為ClyO。
[0005] 本發(fā)明提供的葡萄球菌裂解酶的編碼基因 ClyO的核酸序列如序列表中SEQ. ID. NO. 1 所示。
[0006] 本發(fā)明提供的葡萄球菌裂解酶ClyO的蛋白序列如序列表中SEQ. ID. NO. 2所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種可溶表達ClyO蛋白質(zhì)及純化的方法，其步驟為：將ClyO基因 克隆后連入表達載體PBAD24中，然后將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，所 表達的蛋白質(zhì)先經(jīng)過離子交換純化，再用磷酸鹽（PBS)緩沖液透析處理。
[0008] 本發(fā)明證實了該裂解酶ClyO的高活性與對葡萄球菌的廣譜性。本發(fā)明公開了 ClyO體外殺滅表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、頭葡萄球菌、白色葡萄球菌、木 糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、以及金黃色葡萄球菌的用途。 所述金黃色葡萄球菌包括臨床分離的甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和甲氧西林耐藥的 金黃色葡萄球菌。本發(fā)明還初步試驗了 ClyO對實驗動物模型小鼠感染金黃色葡萄菌后的 保護效果，以及對細胞毒性的測試，初步證實了其用于制備治療葡萄球菌感染藥物的潛能。
[0009] 本發(fā)明還進一步公開了裂解酶ClyO在葡萄球菌檢測和鑒定中的用途。用裂解酶 ClyO與待測細菌作用后，釋放菌內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP)或DNA等胞內(nèi)物質(zhì)，通過檢測釋放的 ATP或DNA來用于葡萄球菌的檢測和鑒定。
[0010] 本發(fā)明還進一步公開了利用ClyO快速裂解葡萄球菌細胞壁并釋放胞內(nèi)ATP的特 點，采用熒光素酶檢測釋放的ATP來進行葡萄球菌的快速鑒定的方法。其步驟為：將待測細 菌與ClyO混合后，加入熒光素酶及其底物于37攝氏度孵育，同時用酶標儀檢測混合液發(fā)光 強度的變化，同時用沒有加入ClyO的菌混合液作為陰性對照。
[0011] 本發(fā)明還進一步公開了利用ClyO快速裂解葡萄球菌細胞壁并釋放胞內(nèi)DNA的特 點，以裂解液中釋放的DNA為模板，采用PCR方法對葡萄球菌進行各種檢測和鑒定的方法。 作為例子，提供了用于MRSA鑒定和分型的檢測結(jié)果。其步驟為：將待測細菌與ClyO混合 后于37攝氏度孵育10-15min，對混合液1000 Og離心lmin。取上清做模板，加入MRSA鑒定 的兩對引物（分別針對femB和mecA)進行PCR來對菌株是否為MRSA進行鑒定；對鑒定為 MRSA的菌株，則進一步加入SCCmec分型所需的5對引物進行PCR，對MRSA菌株進行分型。
[0012] 本發(fā)明的裂解酶具有以下的突出效果和優(yōu)點：
[0013] ClyO能在體內(nèi)、體外殺滅各種葡萄球菌，包括多種臨床分離的金黃色葡萄球菌和 耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)菌株；ClyO細胞毒性低，具有應(yīng)用于體內(nèi)作為抗感染藥物的 潛能；ClyO能采用大腸桿菌可溶性表達，適合于今后的發(fā)酵生產(chǎn)；ClyO的酶活性高，且在 PH4-11的范圍內(nèi)都具有較高活性。
[0014] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
【附圖說明】
[0015] 圖1為ClyO基因的PCR擴增結(jié)果。圖中M泳道為標準分子量marker，個條帶的大 小標記在其左側(cè)。0泳道為所擴增ClyO的條帶。
[0016] 圖2. ClyO殺滅金黃色葡萄球菌標準菌株CCTCC AB91118的結(jié)果。虛線所示為金 黃色葡萄球菌與ClyO混合后0D600隨時間的變化趨勢，實線所示為金黃色葡萄球菌與緩沖 液混合后0D600隨時間的變化趨勢。空心圓圈所示為金黃色葡萄球菌與緩沖液混合后對數(shù) 值（LogCFU)隨時間的變化趨勢。
[0017] 圖3. ClyO體外殺滅多種葡萄球菌以及對不同種類菌株特異性的結(jié)果。縱坐標表 示將不同菌株與ClyO混合后37攝氏度孵育30min，0D600降低的速率。
[0018] 圖4. ClyO在牛奶中殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)菌株的結(jié)果?？v坐標 表示將不同菌株與ClyO混合后37攝氏度孵育60min后細菌數(shù)目降低的對數(shù)值。
[0019] 圖5為ClyO清除小鼠燙傷皮膚組織上感染的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA) 的結(jié)果。每組20只小鼠，在燙傷的皮膚組織上分別接種高濃度的MRSA，24小時后分別用 PBS以及IOOmg ClyO處理。處理24小時后切下皮膚組織，稀釋平板計算單位皮膚組織中的 細菌載量。對照組為接種細菌后不做任何處理。
[0020] 圖6為ClyO體內(nèi)殺滅金黃色葡萄球菌的結(jié)果。每組20只小鼠，分別注射致死劑 量的金黃色葡萄球菌后，實驗組于3小時后腹腔注射Img ClyO。對照組于3小時后腹腔注 射等體積的PBS溶液。每天觀測各組小鼠的存活率。
[0021] 圖7為ClyO對于細胞毒性的測試結(jié)果。分別用濃度為0. 1，0.5和lmg/ml的ClyO 作用于Caco-2細胞沒有觀察到明顯的細胞毒性。其中離子霉素和絲裂霉素 C為對細胞有 毒性的陽性對照。
[0022] 圖8為ClyO用于基于ATP釋放的葡萄球菌快速檢測結(jié)果。圖中黑色直線代表空 白對照，上升的曲線代表不同的金黃色葡萄球菌菌株。
[0023] 圖9為ClyO用于MRSA鑒定的PCR檢測結(jié)果。三角所示位置為femB基因，星號 所示位置為mecA基因。同時具有femB基因和mecA基因的為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 MRSA。只具有femB基因的為甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌MSSA。只具有mecA基因的為 金黃色葡萄球菌的其它菌株。
[0024] 圖10為ClyO用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)分型的PCR檢測結(jié)果。 SCCmec I型菌株P(guān)CR所得條帶應(yīng)為415bp。SCCmec II型菌株P(guān)CR所得條帶應(yīng)為937bp。 SCCmec III型菌株P(guān)CR所得條帶應(yīng)為518bp。SCCmec IV型菌株P(guān)CR所得條帶應(yīng)為415bp 和937bp的兩條帶。SCCmec V型菌株P(guān)CR所得條帶應(yīng)為518bp和359bp的兩條帶。
[0025] 圖11為ClyO用于模擬皮膚消毒后降低皮膚表面葡萄球菌的數(shù)目。當接種量 〈100CFU時，用ClyO處理后能完全消除。
【具體實施方式】
[0026] 通過對葡萄球菌噬菌體裂解酶的催化域和細胞結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的分析，本發(fā)明 設(shè)計和人工合成了能表達一種葡萄球菌裂解酶ClyO的基因序列，并通過體外重組到大腸 桿菌中表達，獲得了該酶。下列實施例中所用的方法如無特別說明均是常規(guī)的實驗方法。實 驗中所用到的引物均由上海英駿公司合成。測序均在上海英駿公司完成。所采用的金黃色 葡萄球菌標準菌株CCTCC AB91118購自武大菌株保藏中心，表皮葡萄球菌ATCC 12228、參 考菌株購于廣東微生物保藏中心、其它均為臨床分離菌株，來源于武漢的幾個醫(yī)院，并經(jīng)過 美國Biolog自動微生物鑒定儀鑒定。臨床菌株的耐藥性經(jīng)過甲氧西林紙片稀釋法進行培 養(yǎng)驗證。臨床分離的金葡菌均在baird-parker瓊脂基礎(chǔ)（購自廣東環(huán)凱微生物科技有限 公司）上劃線分離，然后挑單菌落于TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，供測試。
[0027] 實施例1、能殺滅葡萄球菌的裂解酶的構(gòu)建。
[0028] (1)在上海生工生物工程有限公司全序列合成能表達裂解酶ClyO的ClyO基因 DNA序列。合成序列裝入pUC57質(zhì)粒中。以ClyO基因為模板，在目的基因的兩端分別加入 NcoI和XhoI的酶切位點，引物設(shè)計如下：
[0029] 正向引物：5~TTAACCATGGGCATGGCACTGCCTAAAACG~3 (SEQ. ID. NO. 3)
[0030] NcoI
[0031] 反向引物：5~ATATCTCGAGTTTAAATGTACCCCAAGC~3 (SEQ. ID. NO. 4)
[0032] XhoI
[0033] 以2μ I基因為模板，各加入引物Iyg進行PCR擴增，PCR擴增程序如下：1) 94°C， 5min ;2)94°C，30sec，62°C，45sec，72°C，45sec，30 個循環(huán)；3)72°C，IOmin ;將產(chǎn)物進行凝膠 電泳回收，電泳圖譜如圖l，ClyO的基因大小為777bp。與所設(shè)計的裂解酶基因片段的大小 一致。
[0034] (2)將C