專利名稱：整聯(lián)蛋白αvβb的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了一些新穎的肽段，它們可作為整聯(lián)蛋白的配體，具有生物活性。這些肽段具有共同的結(jié)構(gòu)上的基序，即--Asp Leu Xaa XaaLeu，或具一種優(yōu)選的形式Arg Xaa Asp Leu Xaa Xaa Leu Arg，其中Xaa指任一合適的氨基酸殘基名。本發(fā)明中的肽段可用作整聯(lián)蛋白αvβ6受體的有效抑制劑，從而可用于各種疾病和病理學(xué)上狀況。
整聯(lián)蛋白屬于異源二聚體家族的I組。異源二聚體一些跨膜受體，它們在細(xì)胞---基質(zhì)和細(xì)胞---細(xì)胞粘附過程中起一種重要作用(Tuckell et al.，1996，Symp.Soc.Exp.Biol.47)。異源二聚體大致分為三類β1整聯(lián)蛋白可作為胞外基質(zhì)受體；β2整聯(lián)蛋白對白細(xì)胞具可激活性，在炎癥過程中可被引發(fā)；αv整聯(lián)蛋白可影響創(chuàng)傷恢復(fù)和其他病理過程中的細(xì)胞應(yīng)答(Marshall and Hart，1996，Semin.CancerBiol.7，1991)。
整聯(lián)蛋白α5β1、αIIbβ3、α8β1、αvβ1、αvβ3和αvβ6都與肽段序Arg-Gly-Asp(RGD)相結(jié)合，例如在纖連蛋白天然配體中的RGD序列。含有RGD的可溶性肽段能抑制上述的整聯(lián)蛋白與纖連蛋白的相互作用。αvβ6是一種相對稀有的整聯(lián)蛋白(Busk et al.，1992 J.Biol.Chem.267(9)，5790)，在上皮組織修復(fù)過程中其數(shù)量急劇增加，并優(yōu)先結(jié)合到纖連蛋白和肌腱蛋白的天然基質(zhì)分子上(wang et al.，1996，Am.J.Respi.CellMol.Biol.15(5)，664)。αvβ6的生理和病理功能目前尚不清楚；然而，人們猜想它在涉及上皮細(xì)胞的生理過程和紊亂(如炎癥，創(chuàng)傷恢復(fù)，腫瘤)中起重要的作用.因而，αvβ6在傷口角質(zhì)細(xì)胞中表達(Haapasalmiet al.，1996，J.Invert.Dermatol.106(1)，42)。由此，人們認(rèn)為除創(chuàng)傷修復(fù)和炎癥以外的病理性皮膚疾病，如牛皮癬，也受該整聯(lián)蛋白的促進/拮抗劑的影響。此外，αvβ6在呼吸道上皮細(xì)胞中起一重要作用(Weinacker et al.，1995，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.12(5)，547)，因而αvβ6合適的促進/拮抗劑能成功用于呼吸道紊亂，如支氣管炎、哮喘、肺纖維樣變性和呼吸道腫瘤。最后，我們已經(jīng)知道αvβ6在腸上皮細(xì)胞中也起重要作用，因而，該整聯(lián)蛋白的合適的促進/拮抗劑能用于治療胃/腸道的炎癥、腫瘤和創(chuàng)傷。
到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)能選擇性結(jié)合到αvβ6整聯(lián)蛋白上的低分子量抑制劑。迄今已知的天然高分子量配體和抗體較難用于治療和診斷。而本發(fā)明的目的便是去發(fā)現(xiàn)αvβ6除此之外的、有效的、特異性的和有選擇性的配體，其中肽段優(yōu)選，因它們不僅能用于前述的治療領(lǐng)域，而且可用作診斷劑和試劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，下式所示的肽化合物及其可溶性鹽分子對攜帶上文提及的受體的細(xì)胞產(chǎn)生作用，或者，當(dāng)他們結(jié)合到這些細(xì)胞表面時，就可作為αvβ6介導(dǎo)的細(xì)胞粘連的人工配體。它們尤其可作為αvβ6整聯(lián)蛋白抑制劑，特異的抑制αvβ6整聯(lián)蛋白受體與其它受體的作用，如與纖連蛋白的結(jié)合。這種作用能用J.W.Smith等在1990年第265期J.Biol.chem.12267-12271頁所述的方法來證實。血管發(fā)生起源對血管整聯(lián)蛋白與胞外基質(zhì)蛋白間相互作用的依賴性在1994年264期Science 569-571頁的文章有描述，此文作者是P.C.Brooks、R.A.Clark和D.A.Cheresh.
進一步發(fā)現(xiàn)，這些新物質(zhì)具有極有價值的藥理學(xué)性質(zhì)和良好的耐受性，可用作藥物。這一點在較后部分有較詳細(xì)的敘述。
在前述領(lǐng)域中，如帶有合適的標(biāo)記(如生物素基團)，本發(fā)明中的肽化合物可進一步用作體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和定位上皮系統(tǒng)的病理環(huán)境的診斷劑。本發(fā)明還包括了上述肽化合物與其它活性化合物的綴合物，如其與細(xì)胞毒素活性物質(zhì)的綴合物及其與放療標(biāo)記物和PET診斷劑的綴合物，也包括了上述肽化合物與標(biāo)記蛋白如GFP和抗體，或與蛋白質(zhì)藥物如IL-2的融合蛋白。
因此，本發(fā)明涉及式I中的肽化合物W1-X1nArg X2Asp Leu X3X4Leu X5X6m-W2I其中X1、X2、X3、X4、X5、X6各獨立選自下列氨基酸之一Ala、Asn、Asp、Arg、Cys、Gln、Glu、Gly、Phe、His、Ile、Leu、Lys、Met、Nle、高-Phe、Phg、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val及他們可能的衍生物。
W2是OH、OR、NHR、NR2、NH2之一。
W1是H或酰基。
R是含1-6個碳原子的烷基；n、m各代表0-15中的一個數(shù)字，當(dāng)其假定值大于1時，X1和X6基團可相同或不同。
根據(jù)本發(fā)明，這些氨基酸或氨基酸殘基還包括其天然氨基酸的衍生物，或其同系物，或其異構(gòu)體。這些氨基酸殘基通常是通過α-氨基和α-羧基(肽鍵)相互連接。
此外，本發(fā)明優(yōu)選涉及一些肽化合物，這些化合物中X2是Thr、Ser、Asp、Gly之一；更優(yōu)選的X3是Asp、Glu、Arg、Lys、His、Tyr之一的化合物；最優(yōu)選的是那些X4是Ser、Tyr、Thr、Gly、val之一的化合物。
因此，優(yōu)選的肽化合物(含義和簡寫見上下文)包括式IIW1-X1nArg Thr Asp Leu X3X4Leu Arg X6m-W2IIa，W1-X1nArg Ser Asp Leu X3X4Leu Arg X6m-W2IIb，W1-X1nArg Asp Asp Leu X3X4Leu Arg X6m-W2IIc，W1-X1nArg Ser Asp Leu X3X4Leu Arg X6m-W2IId，W1-X1nArg Gly Asp Leu X3X4Leu Arg X6m-W2IIe，及符合通式III的W1-X1nArg X2Asp Leu Asp X4Leu Arg X6m-W2IIIa，W1-X1nArg X2Asp Leu Glu X4Leu Arg X6m-W2IIIb，W1-X1nArg X2Asp Leu Arg X4Leu Arg X6m-W2IIIc，W1-X1nArg X2Asp Leu Lys X4Leu Arg X6m-W2IIId，W1-X1nArg X2Asp Leu His X4Leu Arg X6m-W2IIIe，W1-X1nArg X2Asp Leu Tyr X4Leu Arg X6m-W2IIIf，和符合通式IV的W1-X1nArg X2Asp Leu X3Ser Leu Arg X6m-W2IVa，W1-X1nArg X2Asp Leu X3Tyr Leu Arg X6m-W2IVb，W1-X1nArg X2Asp Leu X3Thr Leu Arg X6m-W2IVc，W1-X1nArg X2Asp Leu X3Gly Leu Arg X6m-W2IVd，W1-X1nArg X2Asp Leu X3Val Leu Arg X6m-W2IVe.
根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選的肽化合物是符合式V的
W1-X1nArg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg X6m-W2V在此式中更為優(yōu)選符合式VI的W1-X1nArg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr X6m-1-W2VI最后，下列的個體化合物更為優(yōu)選，這些化合物也包括它們的N-和C-末端修飾物(a)H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-Tyr-Thr-Leu-OH(b)H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-OH(c)Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH(d)Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH2(e)H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH(f)H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH2(g)H-Arg-Thr-Asp-Leu-Tyr-Tyr-Leu-Arg-Thr-Tyr-OH(h)Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2文中縮寫代表下列氨基酸的基團Ala A 丙氨酸Asn N 天冬酰氨Asp D 天冬氨酸Arg R 精氨酸Cys C 半胱氨酸Glu Q 谷氨酰氨Glu E 谷氨酸Gly G 甘氨酸His H 組氨酸Ile I 異亮氨酸Leu L 亮氨酸
LysK賴氨酸MetM蛋氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鳥氨酸PheF苯丙氨酸Phg 苯基甘氨酸ProP脯氨酸SerS絲氨酸ThrT蘇氨酸TrpW色氨酸TyrY酪氨酸ValV纈氨酸如果上文提及的氨基酸有許多異構(gòu)體形式，則它們的這些存在形式及其混合物都包括在上下文中，例如它們可作為式I-VI中化合物的成分。此外，所有提到的氨基酸，例如作為式I-VI中化合物成分的氨基酸本身就可為自己提供合適的保護基團。
式I-VI中的化合物可含有1或多個手性中心，因此有多種立體異構(gòu)形式。上述各式包含所有形式，尤指D-和L-形式，尤其是對于對映體和外消旋化合物而言。最后，本發(fā)明上下文中式I-VI的化合物還包括其相應(yīng)的鹽，尤其是那些生理學(xué)上可接受的鹽。
所謂的前體藥物衍生物也包括在本發(fā)明中的化合物中，也即式I中的化合物經(jīng)過修飾后的化合物，例如經(jīng)過烷基、?；?、糖或寡肽修飾后的化合物，這些化合物在體內(nèi)可被迅速的切割為本發(fā)明中的活性化合物。此外，本發(fā)明中的化合物還包括本發(fā)明中的肽化合物的衍生物及已知的標(biāo)記化合物，這些標(biāo)記化合物可使我們易于探測到這些肽段的存在。生物素?；碾亩魏蜔晒鈽?biāo)記的肽段便是兩個具體例子。
一般情況下，本發(fā)明中的肽段是線形的，但他們也能夠環(huán)化。本發(fā)明中不僅包括式I-VI中提到的肽段，也包括這些化合物的混合物和制劑，另外，還包括那些以一種適當(dāng)方式影響本發(fā)明中的肽段基本藥理學(xué)作用的、具藥理學(xué)活性的化合物和佐劑。
另外，本發(fā)明中的化合物及其制劑的出發(fā)物質(zhì)是由目前已知且常用的方法制備的，這些方法在文獻中都有描述(例如標(biāo)準(zhǔn)著作如Houben-Weyl，methoden der organischen Chemie[Methods ofOrganic Chemistry]，Georg-Thieme_Verlag，stuttgart)，也即在已知的且適合于前述反應(yīng)的反應(yīng)條件下去制備。另外也可用已知的各種變式去制備。
本發(fā)明中的肽段優(yōu)選的利用固相合成及隨后的分離和純化方法，如Jonczyk和Meienhofer已描述過的(Peptides，Proc，8thAm.Pept.Symp.，Eds.V.Hurby and D.H.Rich，Pierce Comp.III，p.73-77，1983，or Angew.Chem.104，1992，375)，或據(jù)合成法來制備(J.Am.Chem.Soc.94，1972，3102)。此外，可利用常用的氨基酸及肽的合成法來制備，例如Novabiochem-1999 Catalog and PeptideSynthesis Handbook of Calbiochem-novabiochem GmbH，D-65796 BadSoden中的方法，及許多標(biāo)準(zhǔn)著作和已出版的專利申請中的方法。另外，生物素酰化的和熒光標(biāo)記的肽/蛋白質(zhì)能從標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，E.A.Bager和M.WIlcheck在Biochemical Analysis第26卷上有文章抗生物素蛋白-生物素復(fù)合體用于分子生物學(xué)；Handbook offluorescent Probes and Research Chemicals，6thedtion，1996，by R.P.Haugland，Molecular Probes，inc.；或?qū)＠鸚O97/14716)來制備。
當(dāng)然式I-VI中的肽段可通過溶劑分解，尤其是水解來釋放，或通過氫解來釋放其功能性衍生物。溶劑分解或氫解的優(yōu)選出發(fā)物是那些含有相應(yīng)的氨基和/或羥基保護基，而不是自由的氨基和/或羥基的物質(zhì)。其中，優(yōu)選那些攜帶氨基保護基而不是含有與N相連的H原子的物質(zhì)，或攜帶羥基保護基而不是羥基H原子的物質(zhì)。這種優(yōu)選原則適用于羧酸，它們可通過保護基如酯替代-CO-OH中的羥基的功能基團來得到保護。
氨基保護基這個詞普遍為人所知，它涉及那些適于保護(用于阻斷)氨基不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、但在分子的另一部位發(fā)生了合適的反應(yīng)后又易于去除的基團。羥基保護基這個詞也同樣為人所知，它涉及那些適于保護羥基不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、但在分子的另一部位發(fā)生了合適的反應(yīng)后又易于去除的基團?；衔飶乃麄兊墓δ芑鶊F中的釋放依賴于保護基團的使用，例如，使用強酸，TFA或高氯酸尤為便利，還可利用其他強無機酸如鹽酸和硫酸；強有機羧酸如三氯乙酸，或者磺酸如苯磺酸或?qū)妆交撬?。氫解中可去除的保護基(如芐氧羰基和芐基)可在催化劑(如金屬催化劑鈀，在一支持物如碳上更有利)去除掉。所有的程序都是眾所周知的，這里不再進行更詳細(xì)的描述。
前面已經(jīng)提及，本發(fā)明的肽包含其生理活性的鹽，他們同樣也可由標(biāo)準(zhǔn)方法來制備。因此，利用一種酸，可將符合式I的堿轉(zhuǎn)化為由相關(guān)的酸加成產(chǎn)生的鹽，例如在惰性溶劑如乙醇或其蒸汽中，等量的酸堿發(fā)生反應(yīng)。對于此反應(yīng)，需要有合適的酸尤其是可產(chǎn)生生理可接受的鹽的酸。因此，可用無機酸，如硫酸、硝酸、氫鹵酸如鹽酸或氫溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸；此外，有機酸，尤其是脂肪酸、脂環(huán)酸、芳脂族酸、芳香酸或雜環(huán)單或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、pimelic acid、延胡索酸、馬來酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲基或乙基磺酸、乙基二磺酸、2-羥基乙基磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘單和二磺酸、月桂醇磺酸。生理不能接受的酸的鹽，如苦味酸鹽，可用于分離和/或純化本發(fā)明中的化合物。另一方面，通過與堿反應(yīng)，式I中的酸能轉(zhuǎn)化為生理可接受的金屬或銨鹽。在這種情況下，可能產(chǎn)生多種鹽，尤其是鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽和銨鹽，此外是替代的銨鹽，例如二甲基---、二已基---、二異丙基銨鹽，單乙醇-，二乙醇-或二異丙醇銨鹽環(huán)己基、二環(huán)己基銨鹽，二苯乙烯基二銨鹽。此外也可產(chǎn)生諸如含有精氨酸或賴氨酸的鹽。
前面已提及，本發(fā)明中的化合物可作為人和畜藥物中的活性物質(zhì)，尤其是預(yù)防和/或治療與上皮細(xì)胞相關(guān)的紊亂。此處特別強調(diào)皮膚、呼吸器官、胃腸區(qū)的紊亂、炎癥及創(chuàng)傷修復(fù)過程，例如中風(fēng)、咽喉痛、pectoris、腫瘤病、骨軟化疾病如骨質(zhì)疏松、病理性血液疾病如炎癥、肺纖維樣變性、眼科疾病、糖尿病型視網(wǎng)膜疾病、斑疹退化、近視眼、眼的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞真菌病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、發(fā)紅性的青光眼、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn’s病、動脈硬化、牛皮癬、血管形成手術(shù)后的血管再狹窄、以及急性腎功能衰竭或腎炎。
本發(fā)明涉及上下文定義的結(jié)構(gòu)式中的肽化合物。并且，在專利要求中包括他們的那些可作為藥劑、診斷劑或試劑的生理狀態(tài)下可接受的鹽。
本發(fā)明尤其涉及那些合適的藥劑，他們可作為抑制劑用于防治直接或間接基于αvβ6整聯(lián)蛋白受體之上的紊亂，尤其是病理性的生血管紊亂、血栓、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化、腫瘤、骨質(zhì)疏松、炎癥、傳染病。另外也可用于影響創(chuàng)傷修復(fù)過程。
本發(fā)明也涉及合適的藥物制劑，這些藥物至少包括式I-VI中的一種藥物，也包括合適的載體和/或賦形劑。
此外，按照權(quán)利要求和藥物生產(chǎn)說明書，本發(fā)明涉及肽化合物和/或他們的生理可接受鹽，這些藥物可用于防治直接或間接基于αvβ6整聯(lián)蛋白受體之上的紊亂，尤其是病理性的生血管紊亂、血栓、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化、腫瘤、骨質(zhì)疏松、炎癥、傳染病。另外也可用于影響創(chuàng)傷修復(fù)過程。本發(fā)明中的藥物或組成他們的藥劑可用于人或畜藥?？赡艿馁x形劑是無機物或有機物，它們適于腸道給藥(如口服)或非經(jīng)腸給藥，或局部給藥，或噴霧吸入的形式，并且它們不與新化合物如水、植物油、芐甲醇、烷烯基乙二醇、聚乙二醇、三乙酸甘油、明膠、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸鎂、滑石、石油凝膠等反應(yīng)。片劑、丸劑、有被片劑、膠囊、粉劑、顆粒、漿、汁或滴尤其適用于口服；栓劑適用于直腸給藥；溶液尤其是油溶液或水溶液，以及懸浮液、乳劑和植入物適于非經(jīng)腸給藥；油膏、乳脂制劑和粉劑用于局部給藥。這些新化合物可冷凍干燥，凍干物用做如注射用藥劑。注射用藥劑可滅菌，也可和/或含有載體，如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或吸濕因子、鹽用于影響滲透壓、緩沖物質(zhì)、顏料、調(diào)味劑和/或一或多種活性化合物如一或多種維生素。如以噴霧吸入的方式給藥，則含有溶解或懸浮在一種推進劑或推進劑混合物中的活性化合物的噴霧可被利用。此處的活性化合物以微小粒子形式存在較為便利，因為可能有一種或多種額外的生理可接受的溶劑如乙醇存在。吸入液可借助常用的吸入器來給藥。
本發(fā)明中的物質(zhì)給藥規(guī)則與其他已知的、商業(yè)用肽(如US-A-4472305中描述的)相似。優(yōu)選劑量大約為0.05-500mg/單位劑量，尤其是0.5-100mg/單位劑量。日服量最好在大約0.01-20mg/kg體重。然而，具體劑量要依賴于各種因素，例如特定化合物的利用效率、年齡、體重、健康狀況和性別、飲食、給藥時間及給藥途徑、排泄率、藥物的結(jié)合及用于治療的特定紊亂的嚴(yán)重程度。體表接種是優(yōu)選的方式。
最后，本發(fā)明還包括重組DNA序列，這些序列中的部分編碼一些蛋白質(zhì)區(qū)域，而這些蛋白質(zhì)區(qū)域含有式I-VI的肽結(jié)構(gòu)基序。
正如在1994年91期Ch.Andree et al.Proc.Natl.Acad.Sci.z.第12188-12192中所描述，這些DNA可利用微粒將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞中；若利用其他載體如脂質(zhì)體，這種向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移將增加(A.I.Aronsohnand J.A.Hughes J.Drug Targeting，5，163-169(1997))。
相應(yīng)的，利用桿狀病毒可將這些DNA用于酵母；也可用于哺乳動物以生產(chǎn)本發(fā)明中的肽。
如果動物感染了這種重組DNA，感染細(xì)胞自身最終能產(chǎn)生本發(fā)明中的肽，并且它們能直接結(jié)合到αvβ6整聯(lián)蛋白受體如腫瘤細(xì)胞上，以阻遏其生長。
利用已知的常用技術(shù)能制備出合適的重組DNA，例如，它們能以含有編碼病毒外殼蛋白的DNA片段的病毒DNA形式存在。通過利用重組體，尤其是利用這類非病原性病毒感染宿主，表達整聯(lián)蛋白αvβ6的宿主細(xì)胞能夠優(yōu)先被攻擊(導(dǎo)向)各種腺病毒是較合適的病毒。它們已多次用做哺乳動物細(xì)胞內(nèi)外源基因的載體。它們許多特性使得它們可作為良好的基因治療工具，從1997年第四期Gene therapy 第1004-1012頁S.J.Watkins的文章中可見一斑(也可見1993年Hum.Gene therapy759-769頁J.Engelhardt等的文章).從1998年102期J.Clin.Invert 184-193頁A.Fasbender等的文章中能發(fā)現(xiàn)，借助病毒載體和非病毒載體進行的基因治療有一共同的問題，即基因轉(zhuǎn)移的效率有限。利用上述的腺病毒外殼蛋白中αvβ6整聯(lián)蛋白額外的配體序列，在DNA轉(zhuǎn)移如囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)cDNA中可取得進步。
只需將血管緊張肽DNA替換為本發(fā)明中的DNA序列，其余與T.Tanaka等在1998年58期Cancer Research第3362-3369頁的工作相似。本發(fā)明中的DNA序列還可用于借助逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體進行的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
將本發(fā)明中的肽置于脂/肽/DNA脂質(zhì)復(fù)合體中----這個復(fù)合體連同含有脂/DNA(不含肽)的脂質(zhì)復(fù)合體是用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物的---則本發(fā)明中的肽可用于基因的治療。例如，1998年Human Gene Therapy第9期575-585頁，Hart S.L等的文章---利用非病毒整聯(lián)蛋白尋靶載體提高脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染---有對脂/肽/DNA脂質(zhì)復(fù)合體制備的描述。
例如，脂/肽/DNA可用下述方法來制備1μg/ml脂質(zhì)轉(zhuǎn)染液(等摩爾DOTMA(N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)與DOPE(二油基磷脂酰乙醇胺)的混合物)、10g/ml的質(zhì)粒DNA和100μg/ml肽。這種情況下，DNA和肽都溶解在細(xì)胞培養(yǎng)基中。脂質(zhì)復(fù)合體可由三種成分以特定重量比(如脂∶DNA∶肽＝0.75∶1∶4)混合來制備.人類基因治療用的脂質(zhì)體DNA復(fù)合體已有描述(Caplen N.J etal.，1995Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasalepithelium of patients with cystic fibrosis，Nature Medicine 1，39-66)。
因此，本發(fā)明也涉及基因釋放系統(tǒng)中適當(dāng)?shù)男揎椫亟MDNA的應(yīng)用，尤其是病毒DNA，它們可用于防治直接或間接基于αvβ6整聯(lián)蛋白受體之上的紊亂，尤其是病理性的血管生成紊亂、血栓、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化、腫瘤、骨質(zhì)疏松、炎癥、傳染病。另外也可用于影響創(chuàng)傷修復(fù)過程。
本發(fā)明中的新化合物也可用作整聯(lián)蛋白的配體，以制備親和層析柱，進而制備純態(tài)的整聯(lián)蛋白。抗生物素蛋白衍生的支持物體系如瓊脂糖及式I中的新化合物的絡(luò)合物可由已知方來合成(如E.A.Bayer和M.Wilchek在第26卷Methods of Biological Analysis上的文章抗生物素蛋白——生物素復(fù)合體作為分子生物學(xué)工具的應(yīng)用)。這種情況下，合適的多元支持物是肽化學(xué)中熟知的多元固相，它們具有優(yōu)先親水特性。例如交聯(lián)多糖如纖維素、瓊脂糖和葡聚糖，酰胺，基于聚乙二醇的多聚形式或Tentakel多聚物。
例1制備和純化本發(fā)明中的肽段原則上，制備和純化是按Fmoc策略進行的，這個策略是利用商業(yè)用的連續(xù)的流動肽合成儀將酸不穩(wěn)定樹脂上的酸不穩(wěn)定側(cè)鏈保護起來，具體參見Haubner等的詳述(J.Am.Chem.Soc.118，1996，17703).下文中，肽的合成與純化是舉肽酰胺Ac-RTDLDSLR-NH2為例來描述的。對于合成肽酸，按用戶使用說明，對三氯苯甲基氯化物樹脂就要用適當(dāng)?shù)腃-末端Fmoc氨基酸包被，進而按用戶使用說明在合成儀中使用。主要的步驟是沖洗---去除Fmoc保護基團---沖洗---偶聯(lián)下一個Fmoc氨基酸---加帽(乙酰化)---沖洗。在最后一個氨基酸偶聯(lián)上之后，如果此時的N-末端?；饔檬撬?，就可在利用適當(dāng)?shù)囊鸭せ畹孽；鶊F如乙酸酐去除最后一個Fmoc保護基團后得到。使用商業(yè)合成儀，按照經(jīng)典程序(apparatus and milligen 9050 PepSynthesizerTMHandbook，1987)，每一步偶聯(lián)使用2克9-Fmoc-aminoxanthenyloxy樹脂(Novabiochem，0.37mmol/g)，偶聯(lián)60分鐘，隨后使用0.45克羥基苯并三唑水合物(HoBt)、0.5ml乙基二異丙胺，4當(dāng)量的二異丙基碳的亞胺(DIC)和4當(dāng)量的溶于二甲基甲酰胺的Fmoc氨基酸。沖洗步驟在DMF中，歷時10分鐘，去除步驟在哌啶/DMF(體積比1∶4)中，歷時5分鐘；N-末端乙?；?加帽)則用乙酸酐/吡啶/DMF(體積比2∶3∶15)，歷時15分鐘。先偶聯(lián)Fmoc-Arg(Pmc)，然后Fmoc-Leu，然后Fmoc-Ser(But)，然后fmoc-Asp(OBut)，然后，然后Fmoc-Leu，然后Fmoc-Asp(OBut)，然后Fmoc-Thr(But)，最后是Fmoc-Arg(Pmc)。經(jīng)過DMF和異丙醇沖洗和隨后在VACUO中的干燥，得到了3.48克N-末端酰化的肽酰樹脂Ac-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pmc)-aminoxanthenyloxy樹脂。
對這個肽酰樹脂作如下處理在室溫下用三氟乙酸/茴香醚/三氯甲烷(74ml/3.7ml/74ml)處理4小時，過濾，在抽真空濃縮和用二乙基醚研磨，得到0.6克肽的沉淀物Ac-Arg-Thr-Asp-leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2。利用固定相為0.3％TFA中Lichrosorb RP-18(250-25，7um，Merck KgaA)的RP-HPLC，在8ml/min流速下，用4-24％2-丙醇梯度淋洗2小時，以純化該肽段，在215nm下用紫外流通光度計進行檢測。
含產(chǎn)品的餾分進行冷凍干燥。按照FAB-MS(快速原子轟擊質(zhì)譜)，得到的產(chǎn)品與預(yù)期相同C41H73N15O15M 1015.5g/mol；(M+H)+是1016。
在Super RP18e(250-4，Merck KgaA)分析HPLC中，流速1ml/min，以A(PH3.5 0.08M磷酸鹽，15％乙腈)與B(PH3.5 0.03M磷酸鹽，75％乙腈)之比為0-99％的混合液梯度洗脫50分鐘，在215nm處檢測，純化的產(chǎn)品Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2的保留時間為7.22分鐘。
進一步的HPLC分析是在下面兩個系統(tǒng)中進行的系統(tǒng)ALichrosorb 60 RP-select B(250-4，Merck KgaA，Darmstadt，德國)，流速1ml/min，以0.3％三氟乙酸中0-80％的2-丙醇梯度洗脫50分鐘，在215nm處檢測。
系統(tǒng)BSuperspher 100 RP18e(250-4，Merck KgaA，Darmstadt，德國)，流速10ml/min，0.1％三氟乙酸中30-70％的乙腈梯度洗脫50分鐘，在215nm處檢測。
例2表1中肽的制備和純化與例1相似表1
所用的對比化合物為已知的RGD肽段，如GRGDSPK，環(huán)狀-RGDfV，及線形肽段DLYYLMDL。
例3αvβ6整聯(lián)蛋白制劑的制備應(yīng)用14D9.F8抗體親和層析(Mitjan et al.，1995，J CellSci.108，2825)，按照現(xiàn)有的αvβ3的重組技術(shù)，可從桿狀病毒表達系統(tǒng)中得到和純化以可溶性的截短的跨膜形式存在的αvβ6(Weinacker etal.，1994，J.Biol.Chem.269，6940)。人類αv和β6cDNA克隆已普遍為人所知，一般也都能接觸到。應(yīng)用允許同時表達兩種不同靶cDNAs的轉(zhuǎn)移載體PAcUW31(Clontech Lab.Inc.，USA)，以便使截短的跨膜αvβ6從重組桿狀病毒中表達出來。為此，制備了一種αv轉(zhuǎn)移載體，利用限制性酶EcoRI和XbaI(Mehta et al.，見上述文獻)將跨膜截短的(ΔTM)αv從質(zhì)粒αvΔTM(pBAc9)處切斷。然后，通過平頭連接將其克隆到多角體蛋白啟動子的PAcUW31下游BamHI切割位點處。利用限制性酶EcoRI和XbaI將跨膜截短的β6cDNA從質(zhì)粒pcDNAneoβ6上切下(Weinacker et al.，見上述文獻)，然后，同樣的通過平頭連接將其克隆到多角體蛋白啟動子的PACUW31下游BamHI切割位點處。串聯(lián)的載體包括截短的αv和β6，這些載體用于獲得重組桿狀病毒(Mehta etal.，見上述文獻)。用重組桿狀病毒感染HIGH FIVE昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)48-72小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液流過上面提及的親和柱，在PH3.1下洗脫，得到可溶的受體。所有的步驟都是在室溫、無去污劑的條件下進行的。洗脫峰收集液經(jīng)在40度中和、濃縮及透析，最終產(chǎn)物保存在零下80度。因而，得到的可溶性的人受體重組體具有生物活性，且保留其配體特異性。用于可溶性αvβ3的相似制備方法在EP 0846 702中有描述。
例4αvβ6/纖連蛋白受體結(jié)合試驗本發(fā)明中的成品肽和競爭性的纖連蛋白都結(jié)合到溶液中固定化的αvβ6受體上，Q值可作為被檢肽與αvβ6選擇性結(jié)合的一個量度。在此處，Q值是被檢肽IC50值與標(biāo)準(zhǔn)肽IC50值的商，所用的標(biāo)準(zhǔn)肽是線性的7-RGD肽GRGDSPK(ref./Patent cf.Pytela et al.Sciencce 231，1559，(1986))。
細(xì)節(jié)上講，結(jié)合試驗是按下述進行的可溶性αvβ6受體在微量滴定板上的固定化是通過先將蛋白溶液在TBS++中將其稀釋后，在4℃培養(yǎng)過夜(100μl/孔)，使可溶性αvβ6受體在微量滴定板上固定化。用3％(W/V)BSA在TBS++(200μl/孔)中培育(2h，37℃)可阻斷非特異性結(jié)合位點。用TBS++沖洗3次，將多余的BSA去掉。肽段在TBS++中進行系列稀釋(1∶10)，然后在固定化的整聯(lián)蛋白(50μl肽+50μL配體/孔；2h；37℃)和生物素化的纖連蛋白(2μg/ml)中培育。用TBS++沖洗3次將未結(jié)合的纖連蛋白和肽除掉。通過與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素抗體(Biorad)(在TBSA++中1∶20,000，100μl/孔)共培育來檢測已結(jié)合的纖連蛋白。用TBSA++沖洗3次后，與基質(zhì)溶液(5mg對硝基苯磷酸，1ml乙醇胺，4ml H2O，100μl/孔)共培育(10-15分鐘，25℃，避光)，然后進行比色法檢測。加入0.4M NaOH(100μl/孔)終止酶反應(yīng)。色強度在405nm下利用ELISA檢測器確定，并調(diào)零。那些沒有受體包被的孔作為零值。本實驗所用標(biāo)準(zhǔn)肽是GRGDSPK。待檢測的IC50值可從圖中讀出，本發(fā)明中肽的Q值需結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)肽的IC50值才能得到。本實驗的結(jié)果已總結(jié)到下表中。
表2
Q值小于1表明它們表現(xiàn)出相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白較好的與受體結(jié)合的能力，而與天然纖連蛋白相比，標(biāo)準(zhǔn)肽已具有較好的結(jié)合能力。
例5與前例相似，出于對比的目的，用不同的整聯(lián)蛋白(如αvβ3、αvβ5)與它們相應(yīng)的配體(如玻連蛋白、血纖蛋白原)進行了整聯(lián)蛋白配體結(jié)合試驗。
例6DNA脂質(zhì)復(fù)合體的一般制備及其在基因治療中的應(yīng)用脂與DNA以重量比5∶1(脂∶DNA)混合于Krebs-Hepes溶液(140mmNaCl，1mmMgCl2，2mmCaCl2，6mmKCl，10mmHEPES，10mmD-葡萄糖；PH9.0)中。此處單獨劑量是30μgDNA/200μl.利用一個泵式噴霧器，將200μl的脂-DNA復(fù)合體噴于鼻上皮細(xì)胞，這樣重復(fù)10次，每次間隔15分鐘，DNA總劑量是300μg。
下面的例子涉及到藥劑制備例A 注射小瓶在3升蒸餾水中，100g式I的活性化合物和5g Na2HPO4的溶液，用2N HCl調(diào)PH6.5，無菌過濾，裝入注射瓶中，在無菌環(huán)境下冷凍干燥，然后無菌密封。每一注射小瓶含5g活性化合物。
例B 栓劑20g式I中某一活性化合物與100g大豆卵磷脂、1400g可可黃油融合，傾入模子中，讓其冷卻。每一栓劑含20mg活性化合物。
例C 溶液1g式I中某一活性化合物、9.38gNaH2PO4、28.48gNa2HPO4·12H2O和苯札氯胺溶于940ml雙蒸水中制成溶液，調(diào)PH6.8，定容至1升，然后輻射滅菌。這種溶液可用作眼用滴劑。
例D 油膏500mg式I中某一活性化合物在無菌條件下與99.5g石油凝膠混合。
例E 片劑1Kg式I中某一活性化合物與4kg乳糖、1.2kg大豆淀粉、0.2kg滑石、0.1kg硬脂酸鎂混合，以常用方法制成片劑，每片含10mg活性物質(zhì)。
例F 糖衣片劑與例E相似，片劑壓制成后，用常用方法包被一層由蔗糖、大豆淀粉、黃蓍膠和染料組成的外殼。
例G 膠囊
2Kg式I中某一活性化合物以常用方法注入硬明膠囊中，每個膠囊含20mg活性化合物。
例H 安瓿在60升雙蒸水中加入1Kg式I中某一活性化合物制成溶液，無菌過濾，注入安瓿瓶中，無菌條件下冷凍干燥和密封。每瓿瓶含10mg活性化合物。
例I 吸入式噴霧劑14g式I中某一活性化合物溶于10升等滲溶液中，將其注入泵式噴霧器中，則此溶液可噴于鼻或嘴上。每一噴霧漲泡(大約0.1ml)相應(yīng)于大約0.14mg劑量。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>整聯(lián)蛋白avB6的抑制劑<130>P9858857-bzrs<140>PCT/EP99/09842<141>1999-12-11<160>21<170>PatentIn ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 1<400>1Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Thr Leu1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 2<400>2Asp Ser Leu Arg Fhr Tyr Thr Leu1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 3<400>3Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 4<400>4Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 5<400>5Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 6<400>6Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr
1 5 10<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝Acety1-Arg<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 7<400>7Xaa Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 8<400>8Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr1 5<210>9<211>10<212>PRF<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 9<400>9Arg Thr Asp Leu Pro Ser Leu Arg Thr Tyr1 5 10<210>10<211>8<212>PRF<213>人工序列<220><221>SIFE<222>(8)<223>Xaa＝Thr-NH2<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 10<400>10Arg Thr Asp Leu Asp Leu Arg Xaa1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝Acetyl-Arg<220><221>SITE<222>(8)<223>Xaa＝Thr-NH2<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 11<400>11Xaa Thr Asp Leu Asp Leu Arg Xaa1 5<210>12<211>10<212>PRT<220><221>SITE<222>(9)<223>Xaa-Thr-NH2<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 16<400>16Xaa Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Xaa1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝Acetyl-Arg<220><221>SITE<222>(8)<223>Xaa＝Arg-NH2<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 17<400>17Xaa Thr Asp Leu Asp Ser Leu Xaa1 5<210>18<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 18<400>18Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr1 5<210>19<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avβ6抑制性肽 19<400>19Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu1 5 10<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 15<400>15Arg Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Arg Thr Tyr1 5 10<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝Acetyl-Arg<220><221>SITE<222>(9)<223>Xaa＝Thr-NH2<220><223>人工序列描述vb6抑制性肽 16<400>16Xaa Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Xaa1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝Acetyl-Arg<220><221>SITE<222>(8)<223>Xaa＝Arg-NH2<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 17<400>17Xaa Thr Asp Leu Asp Ser Leu Xaa1 5<210>18<211>8<212>PRF<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 18<400>18Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr1 5<210>19<211>10<212>PRF<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 19<400>19Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu1 5 10<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述avb6抑制性肽 20<400>20Arg Arg Asp Leu Asp Ser Leu1 5<210>21<211>10<212>PRT<220><221>SITE<222>(1)<223>Xaa＝任何天然AS，以及Nle，homo-Phe，Phg或H，N-terminalH或Acetyl<220><221>SITE<222>(3)<223>Xaa＝任何天然AS，以及hom-Phe，Phg，Nle<220><221>SITE<222>(6)..(7)<223>Xaa＝任何天然AS，以及Nle，homo-Phe，Phg<220><221>SITE<222>(9)..(10)<223>Xaa＝任何天然A5，以及Nle，Phg，homo-Phe；an Position 9 auch H；C-端OH，NH2，OR，NH-Alkyl，N-Alkyl<400>21Xaa Arg Xaa Asp Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa1 5 10
權(quán)利要求
1.式I中的肽化合物W1-X1nArg X2Asp Leu X3X4Leu X5X6m-W2I其中X1、X2、X3、X4、X5、X6各代表下列氨基酸之一Ala、Asn、Asp、Arg、Cys、Gln、Glu、Gly、Phe、His、Ile、Leu、Lys、Met、Nle、高-Phe、Phg、Pro、Ser、THr、Trp、Tyr、Val及他們可能的衍生形式，W1是H或?；?，W2是OH、OR、NHR、NR2、NH2之一，R是含1-6個碳原子的烷基；n、m各代表0-15中的一個數(shù)字。
2.權(quán)利要求1的肽化合物，其中的X2是選自Thr、Ser、Asp、Gly之一的氨基酸。
3.權(quán)利要求1的肽化合物，其中的X3是選自Asp、Glu、Arg、Lys、His、Tyr之一的氨基酸。
4.權(quán)利要求1的肽化合物，其中的X4是Ser、Tyr、Thr、Gly、val之一的氨基酸。
5.權(quán)利要求1的肽化合物，其在式VW1-X1n Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg X6m-W2V中具有式I中的含義。
6.權(quán)利要求5中的合式VI的肽化合物W1-X1nArg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr X6m-1-W2VI。
7.權(quán)利要求1-6之一中式I或II的肽化合物及它們的可用作藥物的生理可接受的鹽。
8.權(quán)利要求7中藥物，它可用作抑制劑來防治基于αvβ6整聯(lián)蛋白受體的表達和病理功能上的紊亂。
9.權(quán)利要求8中的藥物，用于防治血栓、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化、腫瘤、骨質(zhì)疏松、纖維樣變性炎癥、傳染病，牛皮癬，也可用于影響創(chuàng)傷修復(fù)過程。
10.由權(quán)利要求7-9之任一的至少一種藥物組成的藥物制劑，及視需而定的載體和/或賦形劑，以及其他視需而定的活性化合物。
11.權(quán)利要求1-6的肽化合物和/或其可藥用鹽在生產(chǎn)防治基于αvβ6整聯(lián)蛋白的表達和病理功能的紊亂的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求11中的應(yīng)用用于防治血栓、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化、腫瘤、骨質(zhì)疏松、纖維樣變性、牛皮癬、炎癥、傳染病，以及影響創(chuàng)傷修復(fù)過程的藥物的生產(chǎn)。
13.重組DNA，包括編碼與權(quán)利要求1-6之一的肽化合物相對應(yīng)的肽段的DNA序列。
14.權(quán)利要求13的重組體病毒DNA。
15.病毒，其特征在于它有一外殼蛋白，此蛋白的序列與權(quán)利要求1-6的肽化合物的序列相對應(yīng)。
16.權(quán)利要求15的病毒的用途，用于生產(chǎn)可防治基于αvβ6整聯(lián)蛋白受體的表達和病理功能的紊亂的藥物。
全文摘要
本發(fā)明描述了一些新穎的肽段,它們可作為整聯(lián)蛋白的配體,具有生物活性。這些肽段具有共同的基序,即-Asp Leu Xaa Xaa Leu,或具一種優(yōu)選的形式Arg Xaa Asp Leu Xaa Xaa Leu Arg,其中Xaa指任一合適的氨基酸殘基。本發(fā)明中的肽段可用作整聯(lián)蛋白α
文檔編號A61P17/02GK1335853SQ99814760
公開日2002年2月13日 申請日期1999年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月19日
發(fā)明者B·迪芬巴赫, A·容茨克, S·克拉夫特, R·梅塔 申請人:默克專利股份公司