專(zhuān)利名稱(chēng)：從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇的高產(chǎn)率提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇的工業(yè)化分離方法，以及一種藥品級(jí)，高純度紫杉醇組合物的制品。
背景技術(shù)：
紫杉醇(paclitaxel)為烷二帖類(lèi)假生物堿，是近二十年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的最重要的抗癌藥。它存在于Taxaceae科植物，尤其見(jiàn)于紅豆杉屬的幾種樹(shù)和灌木。多數(shù)紅豆杉烷類(lèi)化合物均具有的細(xì)胞毒性，在治療癌癥上非常有用。其中又以紫杉醇經(jīng)過(guò)最廣泛的研究，也是首先得到批準(zhǔn)，應(yīng)用于臨床治療。
從植物分離得來(lái)的天然物的藥品方劑，有要求非常高的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。包括生產(chǎn)方法的可靠度，產(chǎn)品純度。尤其當(dāng)原料含有其他結(jié)構(gòu)和生物活性相似，具細(xì)胞毒性的化合物時(shí)更是這樣。紅豆杉的提取物一般均含有數(shù)種紅豆杉烷類(lèi)化合物，例如，漿果赤霉素III，cephalomannine，10-脫乙酰紅豆杉醇(″10-DAT″)，10-脫乙酰漿果赤霉素III，7-epi-10-脫乙酰紅豆杉醇(″7-epi-10-DAT″)，7-epi-paclitaxel和紅豆杉醇-C。這些化合物和紫杉醇的分離，很難達(dá)到經(jīng)濟(jì)規(guī)模。供人類(lèi)用的紫杉醇組合物的分離方法必需要能制備至少98.5％純度紫杉醇，只含有微量紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物的。而且法規(guī)要求極低量的殘留溶劑，例如，提取紫杉醇常用的甲醇，己烷，丙酮等。
除了要在重現(xiàn)性和純度符合法規(guī)要求之外，紫杉醇分離方法還要考慮簡(jiǎn)單，價(jià)廉等經(jīng)濟(jì)。紫杉醇在紅豆杉屬植物中的含量極少，因此，即使采用高紫杉醇含量的植物組織，例如T.brevifolia和T.yunnanensis的樹(shù)皮(約0.02％)，或T.x media Hicksii灌木的針葉及根(0.005-0.15％)。仍然需要大量原料，來(lái)得到相對(duì)少量的紫杉醇。常規(guī)的提取和純化紫杉醇的方法均缺乏效率，產(chǎn)率低。昂貴的材料、設(shè)備，使得以工業(yè)規(guī)模制備藥品級(jí)紫杉醇的成本一向高昂。一般而言，依賴(lài)較廉價(jià)材料的方法，例如溶劑提取和正相硅膠層析法，都會(huì)導(dǎo)致低純度，低產(chǎn)率，或兩者都有。其他可能改善純度，產(chǎn)率的方法不是不切實(shí)用，便是其工業(yè)化太過(guò)昂貴。
大規(guī)模的操作需要一簡(jiǎn)單、價(jià)廉、可重現(xiàn)、高產(chǎn)率、高純度、可靠的方法。但是高產(chǎn)率、高純度經(jīng)常是相背離的。在一多步驟的方法中，高產(chǎn)率有賴(lài)于每一中間步驟的高收率，但是以溶劑提取和分配法生產(chǎn)紫杉醇時(shí)，高收率的組份會(huì)含有大量結(jié)構(gòu)相似的不純物，必須再通過(guò)層析分離以得到高純度。然則較廉價(jià)的層析介質(zhì)，如硅膠(使用后即可棄，不必再生)，對(duì)于含少量紫杉醇的進(jìn)料，并不具有高效的分離能力。因此，經(jīng)常需要其他中間步驟來(lái)提高純度，但是會(huì)以犧牲產(chǎn)率為代價(jià)。
Huang等人描述過(guò)從8000磅以上的樹(shù)皮大規(guī)模分離紫杉醇的方法。包括利用溶劑提取，微分(differential)結(jié)晶和正相硅膠層析法(Joumal ofNatural Products 49(4)665-669，1986)。該法展示了紫杉醇的一般溶解度和層析特性，也顯示出以常規(guī)技術(shù)要得到高產(chǎn)率，高純度產(chǎn)物的各種困難。之后的多數(shù)工藝，基本上都是Huang等人的方法的改進(jìn)，以提高產(chǎn)率及/或純度。但是，這些方法多數(shù)是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，難以放大成有效率的大規(guī)模生產(chǎn)。
例如Nair在美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,279,949和5,478,736(亦見(jiàn)于PCTPublication No.WO 97/09443)所描述的實(shí)驗(yàn)室級(jí)方法中，采用活性碳將70％乙醇/水提取物脫色，再以硅藻土初過(guò)濾，接著以乙酸乙酯提取脫色后的提取物，再蒸干得到紅豆杉烷類(lèi)化合物。將此紅豆杉烷類(lèi)化合物再溶于乙酸乙酯，上料于第一硅膠柱，以己烷/乙酸乙酯梯度洗脫。再繼續(xù)以串聯(lián)硅膠柱或者反相層析法純化?？墒荖air的方法不容易應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的分離。原因之一是它需要大量的活性碳(約5％-15％重量/提取物體積)，將造成加工，清理和液流等困難。此外，活性碳和后續(xù)步驟均無(wú)法除去主要的不純物，即使經(jīng)過(guò)串聯(lián)硅膠柱純化，仍然難以分離。其結(jié)果是，經(jīng)過(guò)三次正相硅膠層析法純化得到的產(chǎn)品，純度仍然不足以供藥品級(jí)制備。必須再用HPLC或反相層析法純化，無(wú)可避免的降低了產(chǎn)率，并且提高了成本?？傊琋air所描述的實(shí)驗(yàn)室級(jí)方法，在大規(guī)模化極不實(shí)際，而且昂貴。
ElSohly等人的美國(guó)專(zhuān)利5,618,538和5,480,639提出許多實(shí)驗(yàn)室級(jí)分離紫杉醇，和其他紅豆杉烷類(lèi)化合物的實(shí)例，并評(píng)估植物品種，植物各部份，粗提取的溶劑系統(tǒng)，機(jī)械提取方法，分配分離的溶劑等。溶劑粗提物接著以硅藻土吸附，再分別用己烷/丙酮，甲醇/二氯甲烷和乙酸乙酯/二氯甲烷作洗脫劑，經(jīng)三次正相硅膠層析法純化。層析組份蒸干后，再行下一步驟，但是并未經(jīng)過(guò)沉淀或結(jié)晶來(lái)提高純度。從紫杉醇含量0.0074％的500公克曼地亞紅豆杉中，可生產(chǎn)28毫克HPLC純度的紫杉醇。因此，本方法的收率為約70％。雖然可得到高產(chǎn)率的紫杉醇，本方法仍然需要重復(fù)四次層析步驟，而且比其他方法使用更多的硅藻土，硅膠和溶劑也是其大規(guī)?；拿黠@障礙。
Rao在美國(guó)專(zhuān)利5,380,916、5,475,120和5,670,673(亦見(jiàn)于WO92/07842)采用乙醇，氯仿，苯，甲醇等一系列溶劑提取，接著以反相層析法，實(shí)例為HPLC，用乙腈洗脫。但是，由于紅豆杉植物提取物中含有許多干擾柱效和維修的雜質(zhì)，反相層析法并不適合大規(guī)模制備紫杉醇。而且，反相層析法的介質(zhì)非常昂貴，且不易再生，更新成本很高。用乙腈洗脫的大規(guī)模制備，必須用昂貴的容器，亦不切實(shí)際。Rao報(bào)告的產(chǎn)率約為0.05％紫杉醇，但是需要再加工才能達(dá)到藥品級(jí)。原則上，只有能夠以大規(guī)模生產(chǎn)高純度紫杉醇的方法，才適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)榉椒ǖ姆糯笸ǔ?huì)對(duì)小試時(shí)所能達(dá)到的產(chǎn)品品質(zhì)有負(fù)面影響。
Hong等人在WO 96/34973的方法采用一種合成吸附劑，例如活性碳或黏土，以甲醇/二氯甲烷提取為初步處理，再以多重二氯甲烷沖洗及沉淀。首先以己烷得到23％紫杉醇沉淀，再經(jīng)多重乙醇/水分級(jí)沉淀，產(chǎn)出85％紫杉醇沉淀供最后以HPLC純化。Hong等人所描述的方法并不適合大規(guī)模制備。不僅因?yàn)榛钚蕴加星笆鋈秉c(diǎn)，而且己烷，乙醇/水沉淀步驟已經(jīng)被證實(shí)難以重現(xiàn)結(jié)果。此外，其多重沉淀步驟的每一步驟需時(shí)數(shù)天，大量溶劑和工業(yè)級(jí)的HPLC均缺乏效率，而且昂貴。
應(yīng)該注意的是，Hong等人在摘要中提到″超過(guò)90％的高收率″。但是經(jīng)仔細(xì)檢查，可以發(fā)現(xiàn)這只是最佳步驟的產(chǎn)率，總收率遠(yuǎn)低于此。Hong等人甚至曾報(bào)告產(chǎn)率達(dá)100％的步驟。在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)?？梢酝ㄟ^(guò)大量輔助物質(zhì)，昂貴、高效的技術(shù)(例如HPLC)，或費(fèi)時(shí)費(fèi)工的方法達(dá)到高收率。這些顯然都是Hong等人所描述的方法的特點(diǎn)。因此，它可能適合實(shí)驗(yàn)室操作，但是其大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用極為有限。
Zamir在WO 98/07712所描述的方法，采用有機(jī)相提取。繼以水洗，活性碳處理，再以非極性溶劑如甲苯，乙醚等，將紅豆杉烷類(lèi)化合物沉淀，重結(jié)晶。最后利用反相層析法或HPLC分離一系列的紅豆杉烷類(lèi)化合物，包括紫杉醇。此一方法有上述的諸多缺點(diǎn)，包括使用活性碳(需要多一道除去活性碳粉粒的清理步驟)，以及采用昂貴的反相層析法或HPLC。此外，該方法使用大量二氯甲烷及乙腈，也需要昂貴的容器。
Liu和Yang在中國(guó)專(zhuān)利96102442.9所描述的方法的提取步驟，采用多孔高分子反相層析法。首先將乙醇提取物分配到二氯甲烷相，再經(jīng)水洗，過(guò)濾，并立即上料到一多孔聚苯乙烯反相層析柱，用甲醇/水洗脫。其中一組份含有50-68％紫杉醇和約10％cephalomannine。另一組份含有60％cephalomannine和約10％紫杉醇，另一組份含有30％10-脫乙酰漿果赤霉素III可以用丙酮/水沉淀得到76％10-脫乙酰漿果赤霉素III。進(jìn)一步的純化則需要反相層析以產(chǎn)出98％的紫杉醇。即使如此，其純度仍然未達(dá)到藥品級(jí)。尤其不純物可能尚含有cephalomannine。
Margraff在美國(guó)專(zhuān)利5,393,896和5,736,366和Gaullier等人在美國(guó)專(zhuān)利Nos5,453,521和5,393,895所描述的，是關(guān)于分離10-脫乙酰漿果赤霉素III的方法。10-脫乙酰漿果赤霉素III可做為合成紫杉醇的前驅(qū)物。該方法是針對(duì)分離前驅(qū)物分子，以乙醇提取含紫杉醇的原料，經(jīng)水洗，有機(jī)相提取及沉淀。這些方法并未說(shuō)明如何分離紫杉醇，但是顯示了從紅豆杉提取，分離紅豆杉烷類(lèi)化合物的困難度。
Shibuya在歐洲專(zhuān)利700 910-A1所描述的，是關(guān)于用溶劑提取，液液分離，硅膠層析法，Sephadex層析，反相HPLC法從蘇門(mén)答臘紅豆杉分離紫杉醇。但其產(chǎn)率僅有0.006％，如此低的產(chǎn)率再度說(shuō)明了應(yīng)用反相HPLC法有效分離紫杉醇的困難度。同時(shí)這一方法在大規(guī)?；瘶O不實(shí)際，而且昂貴。
Cociancich和Pace在美國(guó)專(zhuān)利5,744,333和歐洲專(zhuān)利553,780 B1,553,780 B1提出從T.x media Hicksii或T.cuspidata等園藝種，及其細(xì)胞培養(yǎng)分離紫杉醇的方法。其步驟包括將植物原料以甲醇提取，真空干燥。甲醇提取液以環(huán)己烷，二氯甲烷行液液分離，再以硅膠層析法HPLC純化紫杉醇。但仍然未達(dá)到藥品級(jí)的純度。另一類(lèi)似的專(zhuān)利為L(zhǎng)u等人中國(guó)專(zhuān)利94114041.5所描述，從T.floridana或T.mairei等以0.007％產(chǎn)率分離98％紫杉醇的方法，其法采用硅膠層析法或HPLC。應(yīng)用反相HPLC法的缺點(diǎn)已如前述。
總而言之，分離紫杉醇的工藝需要一新的方法，以符合大規(guī)?；?，快速，采用常規(guī)的中低壓，正相層析法和廉價(jià)材料，以高重現(xiàn)性，高產(chǎn)率分離生產(chǎn)藥品級(jí)純度的紫杉醇。本發(fā)明符合這些需求，并且提供其他的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇的高產(chǎn)率、大規(guī)模提取方法。含紫杉醇物質(zhì)包括，但并不限于，含紫杉醇的植物組織，植物細(xì)胞或微生物培養(yǎng)物。更具體地，本發(fā)明提出一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，以丙酮/水沉淀法可以從包含至少5％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液制備出至少20％(重量比)紫杉醇的沉淀，或從包含至少10％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液制備出至少40％(通?？蛇_(dá)50％重量比)紫杉醇的沉淀。此方法可以在紫杉醇的初期純化步驟，即達(dá)到高產(chǎn)率和高純度。并可以經(jīng)濟(jì)的、大規(guī)模地利用常規(guī)的層析法，從含紫杉醇物質(zhì)分離藥品級(jí)紫杉醇。
在一方面，本發(fā)明提出一種從含紫杉醇提取物分離生產(chǎn)紫杉醇的方法，其步驟包括，加丙酮于紫杉醇提取物中，形成丙酮混合液，令丙酮混合液與一種水性溶劑接觸，以形成上清液和沉淀。此沉淀的紫杉醇純度高于紫杉醇提取物至少3倍，再回收此沉淀。在一具體例中，紫杉醇提取物含有至少5％(重量比)紫杉醇，而沉淀含有至少20％(重量比)的紫杉醇。在另一具體例中，紫杉醇提取物含有至少10％(重量比)紫杉醇，而沉淀含有至少40％(重量比)的紫杉醇。在另一具體例中，沉淀的紫杉醇純度高于紫杉醇提取物至少4倍。
另一相關(guān)方面，為從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇提取物。適當(dāng)?shù)暮仙即嘉镔|(zhì)包括紅豆杉屬的各部組織，紅豆杉屬的組織細(xì)胞培養(yǎng)或微生物培養(yǎng)。含紫杉醇物質(zhì)通常包括T.brevifolia，T.yunnanensis，T.x media Hicksii，T.x media″dark green spreader，″T.x media Hill，T.chinensis，T.wallichianaT.canadensis和T.cuspidata等紅豆杉品種的各部組織。其中T.brevifolia或T.yunnanensis常利用其樹(shù)皮。而T.x media Hicksii，T.x media Hill，T.xmedia dark green spreader或T.cuspidata常利用其根部及/或針葉，但其可供提取的各部組織均可能利用。在另一具體例中，含紫杉醇物質(zhì)可能來(lái)自紅豆杉屬的組織細(xì)胞培養(yǎng)物，包括其細(xì)胞及生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在一具體例中，該細(xì)胞培養(yǎng)物為根細(xì)胞培養(yǎng)物。在一相關(guān)具體例中，含紫杉醇物質(zhì)為Erwinia Taxi或Taxomvces andreanae等微生物。
在一具體例中，制備本發(fā)明的丙酮混合液的原料紫杉醇提取物，是以至少一次的層析法洗脫而得，通常是硅膠層析法。在另一具體例中，紫杉醇提取物是以至少兩次的結(jié)晶法，從包含一有機(jī)溶劑的混合液制備而得。其他具體例包括以至少一次的層析法洗脫，以及至少一次的結(jié)晶法，從包含一有機(jī)溶劑的混合液制備而得。在所有制備紫杉醇提取物的具體例中，通常可能進(jìn)一步以至少一種有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取，以形成兩相溶液，其中一相富含紫杉醇。
本發(fā)明中，丙酮/水沉淀法所采用的水性溶劑，包括任何水含量至少50％(體積比)的溶劑。在多數(shù)的具體例中，水性溶劑的水含量至少50％(體積比)，通常至少70％(體積比)或至少90％(體積比)。在一特定具體例中，水性溶劑為純水。有時(shí)水性溶劑為緩沖液。在其他具體例中，丙酮/水沉淀法包括將一至五倍體積的水性溶劑加入一倍體積的丙酮混合液。在一具體例中，丙酮/水沉淀法通常包括將二至三倍體積的水性溶劑加入一倍體積的丙酮混合液。在特定一具體例中，約2.5倍體積的水性溶劑加入一倍體積的丙酮混合液。
另一方面，從丙酮混合液制備的沉淀所包含的不純物量，低于丙酮混合液的不純物含量。通常沉淀的不純物含量低于丙酮混合液的不純物含量至少約50％。在一具體例中，沉淀的不純物含量低于丙酮混合液的不純物含量至少約75％。
另一方面，本發(fā)明中丙酮/水沉淀法制備的沉淀，通常包含至少90％存在于丙酮混合液中的紫杉醇，更通常包含至少95％存在于丙酮混合液中的紫杉醇。
另一相關(guān)方面，本發(fā)明提出一種制備含5％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液的方法。其步驟包括以甲醇提取含量至少0.005％(重量比)的含紫杉醇物質(zhì)以制備甲醇提取物；將甲醇提取物與二氯甲烷、水進(jìn)行液液萃取，分配成兩相。甲醇相包含甲醇/水。二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；除去甲醇相后，得到濃縮提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(體積比)的甲醇，少于1％(體積比)的水；濃縮提取物加入一硅膠基質(zhì)，經(jīng)洗脫后，達(dá)到至少5％(重量比)紫杉醇，再加入丙酮形成丙酮混合液。在一優(yōu)選具體例中，該洗脫液先經(jīng)干燥后，再溶解于丙酮，生成丙酮混合液。通常本發(fā)明制備丙酮混合液所采用的含紫杉醇物質(zhì)含量至少5％(重量比)，包括上述的紅豆杉屬的組織，細(xì)胞培養(yǎng)及微生物。
在某些具體例中，丙酮混合液的紫杉醇含量至少10％(重量比)，通常至少12.5％(重量比)。在另一具體例中，丙酮混合液包含至少90％的存在于濃縮提取物的紫杉醇。在另一具體例中，濃縮提取物的甲醇含量為2.5至5％(體積比)，水的含量為0.1至1％(體積比)。
另一方面，本發(fā)明提出一種從含紫杉醇物質(zhì)分離生產(chǎn)紫杉醇的綜合方法，適合工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用，其步驟包括a)以甲醇提取含紫杉醇物質(zhì)，以制備甲醇提取物；b)將甲醇提取物與二氯甲烷、水進(jìn)行液液萃取，分配成兩相，甲醇相包含水、甲醇，二氯甲烷相包含紫杉醇；c)除去甲醇相后，得到濃縮提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(體積比)的甲醇，少于0.5％(體積比)的水；d)濃縮提取物加入第一硅膠基質(zhì)，經(jīng)洗脫后，達(dá)到至少10％(重量比)紫杉醇的第一洗脫液；e)將丙酮加入第一洗脫液，生成丙酮混合液；f)將丙酮混合液與一水性溶劑接觸，以生成紫杉醇含量至少40％(重量比)的沉淀；g)以第二硅膠層析柱，將該沉淀純化，洗脫，生成第二洗脫液，紫杉醇含量至少65％(重量比)；h)將第二洗脫液以戊烷結(jié)晶，生成第一結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少85％(重量比)；i)以第三硅膠層析柱將該第一結(jié)晶固體純化，洗脫生成第三洗脫液，紫杉醇含量至少90％(重量比)；j)第三洗脫液濃縮后，溶解于丙酮，以戊烷結(jié)晶，生成第二結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少98.5％(重量比)。
在一優(yōu)選實(shí)例中，含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇含量至少0.005％(重量比)，最好至少0.02％(重量比)。在某些實(shí)例中，第一洗脫液先經(jīng)濃縮干燥，再加入丙酮。在多數(shù)實(shí)例中，第一、第二、第三洗脫液至少有一種先經(jīng)濃縮干燥，再進(jìn)入下一步驟，通常至少有一種濃縮干燥后，溶解于丙酮中。
在綜合方法的某些具體例中，第二結(jié)晶固體(終產(chǎn)物)包含至少40％的存在于起始的含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇。在一具體例中，第二結(jié)晶固體通常包含至少60％的存在于起始的含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇。另一方面，本發(fā)明的綜合方法的第二結(jié)晶固體組合物為至少98.5％(重量比)紫杉醇。在一具體例中，第二結(jié)晶固體組合物通常為至少99％(重量比)紫杉醇，更可能高于99.5％(重量比)。另一方面，第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.2％。在某些具體例中，第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.1％，在某些具體例中，第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.05％。另一方面，綜合方法的各步驟的收率，通?？苫厥罩辽?0％存在于前一步驟的紫杉醇。
另一方面，本發(fā)明可提出一種紫杉醇組合物，包含至少99.5％紫杉醇，總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物從0.05到0.14％，通常從0.06到0.09％。在某些具體例中，紫杉醇組合物為至少99.5％紫杉醇和0.01到0.05％cephalomannine，優(yōu)選為0.01到0.03％cephalomannine。在相關(guān)具體例中，紫杉醇組合物為前述的紫杉醇和cephalomannine，并且未包含任何可測(cè)量的(低于0.01％)10-DAT，7-epi-10-DAT，或7-epi-paclitaxel。在另一具體例中，以本發(fā)明提出的方法制備前述的組合物。本發(fā)明更進(jìn)一步提出將前述的組合物與一醫(yī)藥用載體或稀釋液配方，制備成含有紫杉醇的藥品組合物，適合施用于溫血?jiǎng)游铮貏e是人類(lèi)。
本發(fā)明提出的所有要項(xiàng)，可以參考下文的詳述后得以證明。下文中也引用某些參考文獻(xiàn)以求清楚及完整。
發(fā)明詳述除非另行定義，本文所使用的名詞的意義，均為本領(lǐng)域通常理解的那些，包括下述的名詞定義″紫杉醇提取物″為從含紫杉醇物質(zhì)以至少一種溶劑處理，所制備的一種成份。
″濃縮殘留物″是一種濃縮的產(chǎn)物，其起始物質(zhì)通常是一種提取物，組份或洗脫液(一種包含所需物質(zhì)的溶劑)，通常是將起始物質(zhì)濃縮干燥而得，濃縮殘留物可以有各種濃度成份。
″純度″是衡量某一特定成份在一個(gè)由多成份構(gòu)成的組合物中的相對(duì)比例。除非另行定義，純度的衡量法為，某一特定成份的重量除以所有固體的總重量，以百分比(％)表示。
″百分比″或″％″，除非另行定義，百分比是指紫杉醇的重量比，純度或者層析法分析中，紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物的紫杉醇峰面積(在波長(zhǎng)227nm測(cè)量)與一提取物或終產(chǎn)物的紫杉醇峰面積的比值。″百分比″或″％″的計(jì)算，并不包括(加入或自提取物除去的)溶劑重量。舉例而言，一個(gè)含10％紫杉醇的提取物，可能被稀釋?zhuān)芙庥诖罅咳軇?，可能濃縮于少量溶劑，或被干燥成粉末。在這些情況下均為含10％紫杉醇的提取物。
″紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物″是指存在于含紫杉醇物質(zhì)或其提取物之中的任一非紫杉醇紅豆杉烷類(lèi)化合物，而紅豆杉烷類(lèi)化合物類(lèi)不純物則是指兩種以上的該類(lèi)化合物。通常紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物包括漿果赤霉素III，cephalomannine，10-脫乙酰紅豆杉醇(″10-DAT″)，10-脫乙酰漿果赤霉素III，7-epi-10-脫乙酰紅豆杉醇(7-epi-1-DAT″)，7-epi-paclitaxel或紅豆杉醇-C，以及相關(guān)的代謝物，異構(gòu)物，衍生物。
″總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物″是指一種紅豆杉烷類(lèi)化合物或所有紅豆杉烷類(lèi)化合物的總量。
″沉淀″是指將溶質(zhì)與溶劑分離，并凝聚成為固相，所得到的固態(tài)物質(zhì)。同時(shí)亦指將溶質(zhì)凝聚成為固相的操作。沉淀是得自低于98.5％純度，通常低于50％純度的起始物質(zhì)。
″結(jié)晶物″及″結(jié)晶″為一般所理解的意義，是指從一溶液中，將一具有相對(duì)規(guī)則性，空間排列的化學(xué)物質(zhì)分離生成固態(tài)。本名詞亦可取代沉淀，尤其當(dāng)溶液純度高于50％時(shí)。雖然本文中盡力區(qū)別沉淀與結(jié)晶兩慣用詞的差異，本發(fā)明在此所有的描述并不局限于此定義。應(yīng)了解的是一沉淀物可能包含結(jié)晶物，一結(jié)晶物亦可能包含非結(jié)晶型的沉淀。沉淀與結(jié)晶可能常被混用，意指從一溶液中生成固態(tài)物質(zhì)。
″硅膠基質(zhì)″是指一種硅氧化物固體介質(zhì)，用做吸附劑或?qū)游龇蛛x中層析柱填充物，包括，但并不局限于，一般的硅膠，F(xiàn)lorisil，多孔硅膠或任何應(yīng)用于層析分離的硅氧化物的物理配方。
″洗脫液″是指將吸附劑或硅膠基質(zhì)與一種流動(dòng)相洗脫劑接觸，所分離出的物質(zhì)。
″水性溶劑″是指一種含水量至少50％體積比的溶劑，亦可能包含溶質(zhì)，其他溶劑，或兩者都有。
″上料″是指即將以一特定純化步驟處理前的該物質(zhì)。
″含紫杉醇物質(zhì)″是指含有可提取的紫杉醇的植物特定部位，植物組織，細(xì)胞培養(yǎng)，或微生物培養(yǎng)。
″藥品級(jí)紫杉醇″是指一種符合法規(guī)單位所訂的純度標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇組合物。純度標(biāo)準(zhǔn)的一種實(shí)例為，至少98.5％紫杉醇，少于1％水，單獨(dú)紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物低于0.2％的組合物。
如前所述，本發(fā)明提出一種采用常規(guī)的正相硅膠層析法，從起始的含紫杉醇物質(zhì)以高產(chǎn)率分離生產(chǎn)藥品級(jí)紫杉醇的方法，適合工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。本發(fā)明的一關(guān)鍵方面，是采用一種丙酮/水沉淀法得到高純度、高產(chǎn)率的紫杉醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括采用正相液態(tài)硅膠層析法，并有能力將存在于起始的含紫杉醇物質(zhì)中，至少40％的紫杉醇制備成為藥品級(jí)紫杉醇，通常至少60％。這些優(yōu)點(diǎn)可以綜合而成一種以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇的經(jīng)濟(jì)方法，實(shí)例如下述大規(guī)模分離生產(chǎn)紫杉醇的方法。
在某些具體例中，丙酮/水沉淀步驟可在分離生產(chǎn)紫杉醇的方法初期實(shí)施，以減少生產(chǎn)藥品級(jí)紫杉醇所需的后續(xù)步驟。在某些具體例中，丙酮/水沉淀步驟可能在一分離方法的末期實(shí)施，以協(xié)助除去殘留的不純物。在一具體例中，丙酮/水沉淀步驟可能在一分離方法的中期實(shí)施，其間有些不純物已被除去，有些不純物仍殘留。當(dāng)其在一分離方法的中期實(shí)施時(shí)，丙酮/水沉淀步驟可提供一個(gè)四至五倍的高純化率的單步驟，以及至少90％，通常95％，的高產(chǎn)率單步驟，并且可具體除去不純物。
由于分離生產(chǎn)紫杉醇是一多步驟的方法，當(dāng)提取物為含至少10％紫杉醇時(shí)，在分離方法的中期實(shí)施丙酮/水沉淀步驟最為有效。因此，最好用一具體例，從提取起始的含紫杉醇物質(zhì)開(kāi)始，來(lái)描述本發(fā)明。應(yīng)了解的是，此公開(kāi)方式僅為闡述的方便，本發(fā)明并不局限于此描述。
1)起始的含紫杉醇物質(zhì)本發(fā)明中，適合用來(lái)分離生產(chǎn)紫杉醇的含紫杉醇物質(zhì)，為任何高紫杉醇含量，最好至少為0.005％干燥重量的植物組織。適合用的植物組織包括紅豆杉屬的各部組織，優(yōu)選為T(mén).brevifolia或T.yunnanensis，的樹(shù)皮，和園藝種紅豆杉如T.cuspidata，T.x media spp Hicksii，T.x dark greenspreader和Hill.，T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa，T.sumatrana和T.floridana的根部及針葉。其他適用的物質(zhì)包括紅豆杉屬的植物組織培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)的方法可見(jiàn)于Cociancich和Pace的美國(guó)專(zhuān)利5,744,333和歐洲專(zhuān)利553,780 B1和Strobel等人的美國(guó)專(zhuān)利5,451,392。Strobel等人的專(zhuān)利進(jìn)一步提供一種自細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基提取紫杉醇的方法，該法也適合用于本發(fā)明。微生物若表現(xiàn)出可供提取的紫杉醇的，亦適合用于本發(fā)明，例如細(xì)胞餅或發(fā)酵液。實(shí)例之一為Page等人在美國(guó)專(zhuān)利5,451,392所描述的，從某些紅豆杉屬分離出的Erwinia微生物。另一實(shí)例為T(mén)axomyces屬微生物，更確切的說(shuō)，為紫杉醇產(chǎn)生菌Taxomyces andreana。其他實(shí)例包括利用基因重組技術(shù)改良的紫杉醇產(chǎn)生菌。
雖然紫杉醇含量至少為0.005％的含紫杉醇物質(zhì)為優(yōu)選，本發(fā)明的丙酮/水沉淀法可應(yīng)用于以任何起始的含紫杉醇物質(zhì)所產(chǎn)生的，至少為5％紫杉醇含量的提取物。(關(guān)于這一點(diǎn)本發(fā)明的背景對(duì)適合用于本發(fā)明的植物組織，紅豆杉屬的植物及/或提取物的制備方法均有描述)。
在一種通常的操作中，常將含紫杉醇物質(zhì)粉碎，切碎，或磨碎成小塊以增高溶劑提取的效率。含紫杉醇物質(zhì)亦可被干燥。含紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞，微生物，或發(fā)酵液在溶劑提取之前通常先經(jīng)濃縮。細(xì)胞及微生物可能以全細(xì)胞，細(xì)胞餅，或粉碎物進(jìn)行加工。
2)提取含紫杉醇物質(zhì)常與一種溶劑接觸，進(jìn)行初提取。通常至少8小時(shí)或者約三天。物理攪拌可促進(jìn)含紫杉醇粗提取物的生成，但是可有可無(wú)。提取時(shí)，可以采用任何曾經(jīng)被描述過(guò)的，用來(lái)提取紫杉醇的溶劑系統(tǒng)。包括，但并不局限于，丙酮，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，氯甲烷，氯仿，其混合液以及含高達(dá)60％水相成份的各混合液。這些溶劑通常以每公斤含紫杉醇物質(zhì)約4-20 L的比例加入，以制備粗提取物。實(shí)例為背景篇所引用Nair、ElSohly、Zamir、Rao、Slot、Hong、Lu、Liu和Yang的專(zhuān)利，其中提供了制備含紫杉醇粗提取物的許多種溶劑系統(tǒng)的描述。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)踐中，該有機(jī)溶劑為一種極性有機(jī)溶劑，通常為一種醇類(lèi)。在某些實(shí)例中，優(yōu)選甲醇，因?yàn)槠涞统杀荆子诔?，并具有提取紫杉醇的高效率。在一?shí)例中，以每公斤含紫杉醇物質(zhì)約6-15 L甲醇的比例加入，以制備粗提取物。提取可以通過(guò)攪拌含紫杉醇物質(zhì)來(lái)加速。例如，通過(guò)攪拌或浸透甲醇與含紫杉醇物質(zhì)1至5天，溫度在室溫至約60℃，通常維持在約60℃。取前述紫杉醇含量至少為0.005％的含紫杉醇物質(zhì)，以甲醇采用上述方法提取3天，可以回收至少90％的紫杉醇，產(chǎn)生的甲醇粗提取物中，紫杉醇含量約為0.1-0.5％，總固體含量約為0.5-5％(重量/體積比)。
大量的甲醇粗提取物亦可以濃縮。通常以蒸發(fā)濃縮10-30倍，產(chǎn)生的固體含量約為100-400公克/L。
3)液液萃取粗提取物通常接著實(shí)施1-3次液液萃取，以增稠其紫杉醇。液液萃取是將粗提取物與一不互溶的有機(jī)溶劑混合，以形成一兩相系統(tǒng)。其中一相含有紫杉醇。通常該兩相系統(tǒng)包括一極性相。亦可選擇將含紫杉醇相蒸發(fā)濃縮，以達(dá)到固體含量約為100-400公克/L。紫杉醇含量約為1-4％。在某些具體例中，采用水以協(xié)助除去水溶物。選用極性較差的溶劑以除去蠟，脂類(lèi)，色素，脂醇等不需要的物質(zhì)。通常液液萃取采用的溶劑包括己烷，二氯甲烷。當(dāng)粗提物取采用的溶劑為一醇類(lèi)時(shí)，二氯甲烷特別適合含紫杉醇物質(zhì)的液液萃取。
液液萃取可以增稠濃縮提物液的紫杉醇純度十倍，約達(dá)1-4％，其產(chǎn)率至少90％。濃縮提物液可能蒸發(fā)濃縮，濃縮殘留物再溶解于一溶劑，做為第一硅膠層析柱的上料。
液液萃取的其他實(shí)例，可見(jiàn)于Rao在美國(guó)專(zhuān)利5,380,916、5,475,120和5,670,673，ElSohly等人的美國(guó)專(zhuān)利5,618,538和5,480,639及其文獻(xiàn)。這些方法或其變化，均可應(yīng)用于本發(fā)明的具體例。唯一的要求是，最后的濃縮提物液的紫杉醇純度至少約1％。關(guān)于這一點(diǎn)，當(dāng)提物液的紫杉醇純度通過(guò)由其他中間步驟，如沉淀，結(jié)晶，或?qū)游龆岣叩郊s1％以上時(shí)，液液萃取步驟則可以完全省略。實(shí)例之一可見(jiàn)于Zamir的WO98/07712在有機(jī)相提取之后，立即進(jìn)行沉淀，而提高到約1％以上的紫杉醇組份。
4)第一硅膠層析柱以制備10％丙酮混合液含紫杉醇1-4％的濃縮提物液接著以正相的硅膠層析法純化。此處，硅膠層析法是關(guān)于將試樣溶解于一上料溶劑，上料于一硅膠基質(zhì)，然后以洗脫劑洗脫此硅膠基質(zhì)，以得到含有所要物質(zhì)的組份的一種方法。
第一硅膠層析柱的尺寸，是依據(jù)待分離的固體量和純度來(lái)決定。在本發(fā)明的一具體例中，有一先導(dǎo)級(jí)方法采用約250公克固體，溶解于一約0.75 L上料溶劑，再以一1.5英寸×10英尺的硅膠層析柱層析。在另一具體例中，有一先導(dǎo)級(jí)方法采用約40-50公斤固體，溶解于一約100-200 L上料溶劑，再以一18英寸×10英尺的硅膠層析柱層析。
據(jù)本發(fā)明公開(kāi)，在硅膠層析柱上端最好加一層約1-15公分的硅藻土，優(yōu)選為2-8公分，做為一預(yù)濾劑，以便具體減低上料時(shí)間。本發(fā)明亦公開(kāi)，該硅膠層析柱的最佳洗脫劑，為約3∶1的己烷/丙酮混合液，而″核心組份″為包括第一個(gè)含有至少2％的紫杉醇組份到最后一個(gè)含有至少2％的紫杉醇組份。這些組份收集后，可得到第一硅膠層析柱洗脫液，含有至少5％的紫杉醇，通常為至少10％，更通常為至少12.5％的紫杉醇。相關(guān)資料可見(jiàn)于例3及4。
本發(fā)明的一項(xiàng)意外發(fā)現(xiàn)，是采用硅膠層析柱，以己烷/丙酮溶劑系統(tǒng)純化紫杉醇時(shí)，會(huì)受上料濃縮提取液的甲醇及水含量的影響。通常，假如甲醇含量超過(guò)10％，水含量超過(guò)2％時(shí)，對(duì)收率及純度均有不良的影響。此一發(fā)現(xiàn)對(duì)于采用粗提取液作上料的大規(guī)模層析非常重要。在濃縮時(shí)，該粗提取液經(jīng)常會(huì)凝膠化，因而影響柱流動(dòng)。添加少量甲醇及水可以提高上料的流動(dòng)性質(zhì)，但太多甲醇及水反而會(huì)影響柱效，因此最佳的甲醇及水含量是本發(fā)明的另一方面。
實(shí)施例3顯示不同的甲醇及水組合的實(shí)驗(yàn)資料。在本發(fā)明的一具體例中，第一硅膠層析柱的上料的甲醇含量，被降低到5％以下。在另一具體例中，甲醇含量被降低到約2.5％-5％，水含量被降低到約0.1到1％。如此可以從上料回收90％到95％的紫杉醇，純度10％到16.8％。通常的收率為95％的紫杉醇，純度至少12.5％。這些組份收集后，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，濃縮殘留物再溶解于丙酮，以制備丙酮混合液。
常見(jiàn)的工藝中，均可能以其他的純化方法來(lái)制備至少5％丙酮混合液。例如，本發(fā)明的背景所提供的實(shí)例方法，可制備至少5％可溶于丙酮的組份。通常，其他的純化方法會(huì)包括后續(xù)純化步驟。在某些具體例中，這些步驟包括其他層析步驟例如反相HPLC或離子交換柱。更常有的情況是，該層析柱會(huì)含有硅膠基質(zhì)。雖然其他介質(zhì)亦可。其他方法并不需要采用柱層析來(lái)制備5％提取液。這些方法通常包括至少兩次的沉淀或結(jié)晶。其他方法需要一次層析步驟，和至少一次的沉淀步驟來(lái)制備5％提取液。在一典型的方法中，上述的任何一方法和液液萃取結(jié)合后可以制備10％提取液。任何提取液均可能再溶解于丙酮，以制備丙酮混合液，供本發(fā)明的各具體例使用。
5)丙酮/水沉淀法如前所述，本發(fā)明的一關(guān)鍵方面為，發(fā)現(xiàn)將含有至少5％紫杉醇的丙酮混合液與一水性溶劑接觸沉淀，可產(chǎn)生至少20％的沉淀。將含有至少10％紫杉醇的丙酮混合液與一水性溶劑接觸沉淀，可產(chǎn)生至少40％的沉淀，通常可產(chǎn)生至少50％的沉淀。此外沉淀法可以達(dá)到至少90％收率的高效率。在一具體例中，采用此一發(fā)現(xiàn)將紫杉醇的純度提高至少3倍，通?？蛇_(dá)4倍。水性溶劑應(yīng)包含至少50-100％(體積比)的水。通常水性溶劑應(yīng)包含至少70％(體積比)的水，優(yōu)選水性溶劑應(yīng)包含至少90％(體積比)的水。在一具體例中，水性溶劑為水。有時(shí)候水性溶劑為緩沖液。通常以1-5體積水性溶劑加入一體積的丙酮混合液。更確定的說(shuō)，水性溶劑體積視丙酮混合液成份，和其他溶劑的存在而定。通常以2-3體積水性溶劑加入一體積的丙酮混合液，在一優(yōu)選操作中，以2。5體積水性溶劑加入一體積的丙酮混合液。在其他具體例中，水性溶劑可能為緩沖液。
在一具體例中，丙酮/水沉淀步驟中丙酮/水的比例約為2-3時(shí)，可以達(dá)到高收率。在一具體例中，丙酮/水的比例約為1比2.5時(shí)，可以達(dá)到較本例稍高的收率。表一列舉的實(shí)驗(yàn)，采用得自同一第一硅膠層析柱的丙酮混合液，丙酮/水的比例約為1比2時(shí)，可以達(dá)到至少約90％的收率。丙酮/水的比例約為1比2.5時(shí)，可以達(dá)到至少約95％的收率。表一中，各種丙酮/水的比例所達(dá)的高收率顯示，丙酮/水沉淀法中的水含量仍然可以最佳化，以應(yīng)用于其他的紫杉醇分離法。
表一

在丙酮/水沉淀步驟中，水性溶劑用量的最佳化非常重要。尤其當(dāng)丙酮混合液不同于前述得自硅膠層析柱的丙酮混合液，或者當(dāng)水性溶劑的含水量少于90％的情況。常用一法來(lái)立即評(píng)估一丙酮混合液中丙酮/水的最佳比例。其法為將該丙酮混合液與各不同量的水性溶劑混合，回收其沉淀，再以HPLC或TLC分析其收率，純度及組合物份。估計(jì)丙酮/水的最佳比例應(yīng)受到幾種變數(shù)的影響，包括含紫杉醇物質(zhì)的來(lái)源，制備提取液的溶劑系統(tǒng)，制備丙酮混合液前段的純化步驟，以及丙酮混合液中的固體組合物組份。舉例來(lái)說(shuō)，Nair在美國(guó)專(zhuān)利5,279,949和5,478,736的描述，以70％乙醇提取含紫杉醇物質(zhì)以制備丙酮混合液，應(yīng)該較Zamir在WO98/07712的描述，以甲苯或乙醚所沉淀處理得到的提取液，含有更多的水溶性成份。同理，Hong在WO 96/34973的描述，以多重醇/水沉淀得到的提取液，應(yīng)該比本發(fā)明的描述，得自硅膠層析柱洗脫液的丙酮混合液，含有較少的水溶性成份。
丙酮/水沉淀法的最佳化的一重要變數(shù)為，用來(lái)溶解10％提取物的丙酮量。其濃度必須能保證好的收率，和增稠沉淀中的紫杉醇。表二列舉的實(shí)驗(yàn)，采用得自同一丙酮/水的比例約為1比2，當(dāng)丙酮用量為固體濃度1公克/5毫升時(shí)，紫杉醇無(wú)法沉淀，當(dāng)固體濃度稍降低到1公克/10毫升時(shí)，可得高的收率，但純度略低(42.5％)。固體濃度至少1公克/20毫升時(shí)，可得約97％的收率，51.1％純度。固體濃度降低到1公克/25毫升時(shí)，收率降低至約90％。因此，在一丙酮/水沉淀法的典型具體例中，通常將固體溶于丙酮以達(dá)到1公克/20毫升(50公克/L)的固體濃度。
表二

本發(fā)明的另一觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，丙酮/水沉淀法中的產(chǎn)品收率和純度，依賴(lài)于丙酮混合液含有的的紫杉醇的純度。表三列舉的實(shí)驗(yàn)中，純度11-16％的丙酮混合液的產(chǎn)品收率為91-96％，純度46-56％，當(dāng)丙酮混合液的純度低于10％時(shí)，產(chǎn)品收率低于93％，純度低于43％。因此，在本發(fā)明的各具體例中，均包括采用一丙酮/水沉淀步驟使沉淀的紫杉醇收率至少90％，優(yōu)選收率95％。
表三

在先前方法中，曾采用含有丙酮的一種雙溶劑沉淀法，但效果不好。原因可能是，這些方法中采用丙酮/己烷來(lái)沉淀不純物，而不是沉淀紫杉醇?？赡苁沁@些方法中，采用純度低于5％紫杉醇的提取物，可能采用丙酮搭配其他溶劑，例如戊烷，因而無(wú)法有效的純化。例如13.8％紫杉醇的粗提取物，在一丙酮/戊烷溶劑系統(tǒng)中即無(wú)法沉淀。當(dāng)紫杉醇的含量提高到29.3％或50％，在戊烷中可得純度45％或50％沉淀，但是收率50％或77％很差，令該方法不切實(shí)用。同理，采用丙酮/己烷來(lái)沉淀粗提取物中不純物的嘗試，也缺乏效率。雖然可將粗提取物中不要的化合物，蠟、脂類(lèi)、色素、脂醇等除去，所除去的不純物仍然很少量，使得該方法不符合生產(chǎn)的要求。其他結(jié)果則顯示，丙酮/己烷處理不足以提高純度，通常只提高10％，從1.65％到1.8％。因此，本發(fā)明的丙酮/水沉淀法，較先前各種采用丙酮的沉淀法，具備更明顯的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的丙酮/水沉淀法，可以應(yīng)用于各種產(chǎn)紫杉醇分離程序之中。在一具體例中，先進(jìn)行至少一次層析法，再進(jìn)行丙酮/水沉淀法。在另一具體例中，丙酮/水沉淀法是應(yīng)用于紫杉醇分離程序的中段。例如，在第一硅膠層析柱和第二硅膠層析柱之間。在其他具體例中，丙酮水沉淀法可以應(yīng)用于一種制備至少5％紫杉醇的程序之中。當(dāng)其應(yīng)用于分離程序的中段時(shí)，本丙酮/水沉淀步驟可在紫杉醇分離早期，即提供高產(chǎn)率、高純度，有助于其后的純化步驟。由于丙酮/水沉淀法具有這些簡(jiǎn)易、低成本、高效率的優(yōu)點(diǎn)，使其應(yīng)用于大規(guī)模的紫杉醇生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)可行。
6)第二硅膠層析柱和第一結(jié)晶在本發(fā)明的一具體例中，采用一丙酮/水沉淀步驟得到至少40％紫杉醇，再以常規(guī)的硅膠層析純化。采用二氯甲烷/乙酸乙酯作洗脫劑，相似于ElSohly等人在美國(guó)專(zhuān)利5,618,538和5,480,639的描述。本發(fā)明的第二硅膠層析柱的特點(diǎn)，在于其上料和操作規(guī)模。在本發(fā)明中，第二硅膠層析柱上料是以丙酮/水沉淀法大規(guī)模制備，含有至少40％紫杉醇，通常含有1.5-2.0公斤的固體。該上料先溶解于5-7 L二氯甲烷，再加入一12英寸×10英尺，不銹鋼制的硅膠層析柱。柱上端最好加一層硅藻土，以初過(guò)濾該上料。層析柱的洗脫流動(dòng)相，包括二氯甲烷到50％二氯甲烷/乙酸乙酯的梯度洗脫，再收集其組份，得到核心組份至少65％紫杉醇，低于1％的cephalomannine，紫杉醇的收率為92％-95％。
第二硅膠層析柱的洗脫液，接著再濃縮，蒸發(fā)，干燥，再溶解于丙酮，以?xún)杀段焱橄♂專(zhuān)?℃攪拌，得到第一結(jié)晶固體。并以過(guò)濾，干燥，收集第一結(jié)晶固體。通常第一結(jié)晶固體可自第二硅膠層析柱的洗脫液回收紫杉醇90-95％％，純度為85-96％紫杉醇，和低于1％的cephalomannine。
7)第三硅膠層析柱和第二結(jié)晶第二硅膠層析柱得到的第一結(jié)晶固體，含有至少85％紫杉醇。接著再以第三硅膠層析柱，以二氯甲烷/乙酸乙酯洗脫劑純化。本發(fā)明中，第三硅膠層析柱上料，是以大規(guī)模分離含有600-900克固體的一種設(shè)計(jì)。在一具體例中，該上料先溶解于2-4L二氯甲烷，再加入一12英寸×10英尺，不銹鋼制的硅膠層析柱。層析柱的洗脫流動(dòng)相包括100％二氯甲烷到50％乙酸乙酯/二氯甲烷的梯度洗脫，或等度洗脫，再收集其高于90％紫杉醇組份。得第三硅膠層析柱洗脫液。通常，第三硅膠層析柱的紫杉醇收率92％-95％，紫杉醇純度為90-98％，cephalomannine低于1％。
第三硅膠層析柱洗脫液接著再濃縮，蒸發(fā)，干燥，，再溶解于丙酮，以?xún)杀段焱橄♂屧?℃攪拌，得到第二結(jié)晶固體。并以過(guò)濾，干燥，收集第二結(jié)晶固體，通常第二結(jié)晶固體可自第三硅膠層析柱的洗脫液回收紫杉醇90-95％％，純度為98.5％紫杉醇，任一紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均低于0.2％。
8)有代表性的綜合方法如前所述，在本發(fā)明的某些方法，例如，與第一硅膠層析柱相關(guān)的制備含10％紫杉醇的丙酮混合液，制備含至少40％紫杉醇的丙酮/水沉淀法，均可能附屬于其他紫杉醇的分離步驟，而成為本發(fā)明個(gè)別的具體例。在另一具體例中，本發(fā)明的方法經(jīng)組合成一綜合方法，以提供自含紫杉醇物質(zhì)分離生產(chǎn)藥品級(jí)紫杉醇的完整的方法。
關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明在一具體例中，提供包含下列步驟的分離方法a)用甲醇提取含紫杉醇物質(zhì)，得到甲醇提取液；b)以液液萃取，將甲醇提取物與二氯甲烷、水進(jìn)行液液萃取，分離成兩相，甲醇相包含甲醇/水。二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇/水相后，得到濃縮提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(體積比)的甲醇，少于0.5％(體積比)的水；d)濃縮提取物加入第一硅膠基質(zhì)，經(jīng)洗脫后，達(dá)到至少10％紫杉醇；e)將丙酮加入第一洗脫液，生成丙酮混合液；f)將丙酮混合液與一水性溶劑接觸，以生成紫杉醇含量至少40％的沉淀；g)以第二硅膠層析柱將該沉淀純化，洗脫，生成第二洗脫液，紫杉醇含量至少65％；h)將第二洗脫液以戊烷結(jié)晶，生成第一結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少85％；
i)以第三硅膠層析柱將該第一結(jié)晶固體純化，洗脫生成第三洗脫液，紫杉醇含量至少90％；j)第三洗脫液以戊烷結(jié)晶，生成第二結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少98.5％。
此一綜合方法具有高產(chǎn)率，高純度，優(yōu)于常規(guī)方法。因此適合大規(guī)模生產(chǎn)。表四例舉應(yīng)用此一綜合方法所得到的產(chǎn)率和純度范圍。
表四

本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)，為提供一種高重現(xiàn)性、生產(chǎn)高純度、獨(dú)特組合物的紫杉醇制備方法。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的紫杉醇組合物中，紫杉醇與紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物獨(dú)特的比例是其他已知的方法所不能提供。尤其是，本發(fā)明的紫杉醇組合物不同于，并且優(yōu)于現(xiàn)存的各種大規(guī)模，分離生產(chǎn)或半合成法制備的藥品級(jí)紫杉醇組合物。為說(shuō)明此一差異，表五列舉本發(fā)明的紫杉醇組合物，分析，并與其他來(lái)源(例如Bristol-Myers Squibb(″BMS″)，Princeton，N.J.)的藥品級(jí)紫杉醇組合物相比較。在表五中，IDP表示采用BMS的方法分離生產(chǎn)的藥品級(jí)紫杉醇，而SDP表示采用BMS的半合成方法(qi為分離天然物和至少一次合成步驟)生產(chǎn)的藥品級(jí)紫杉醇。BDS表示采用本發(fā)明的方法分離生產(chǎn)的藥品級(jí)紫杉醇。
表五

*總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物包括漿果赤霉素-III及其他本表未列舉的紅豆杉烷類(lèi)化合物的未知波峰。
表五中的資料說(shuō)明，除了提供一分離生產(chǎn)至少99.5％純度的紫杉醇的方法之外，本發(fā)明亦提供一種獨(dú)特紫杉醇組合物。在一方面，本發(fā)明的紫杉醇組合物包括至少99.5％純度的紫杉醇，和低于0.14％總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物。更確定的說(shuō)，約0.05％至0.14％總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物。通常，總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物為0.06％至0.09％。在某具體例中，紫杉醇組合物包括至少99.5％純度的紫杉醇，和0.01％至0.05％cephalomannine，通常0.01％至0.03％cephalomannine。在相關(guān)方面，紫杉醇組合物包括前述濃度的紫杉醇和cephalomannine，不包括可測(cè)得的10-DAT，7-epi-10 DAT，和紅豆杉醇C。這些組合物均可經(jīng)由本發(fā)明的綜合方法制備，這些組合物亦可以和藥用級(jí)的載體制成方劑，以提供一適合于醫(yī)療用藥傳輸?shù)乃幤芳?jí)組合物。
本發(fā)明提供的組合物，并未見(jiàn)于其他的實(shí)驗(yàn)室級(jí)純化方法(目的在制備100％純度的紫杉醇)。實(shí)驗(yàn)室級(jí)純化方法，是通過(guò)一步驟將cephalomannine減至低于0.01％，總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物減至低于0.05％。實(shí)驗(yàn)室級(jí)純化方法中，常用的含紫杉醇物質(zhì)″進(jìn)料″的不純物并未含有范圍0.05％至0.14％的總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物，和0.01％至0.05％的cephalomannine，反而更高。因此，如前所討論者，實(shí)驗(yàn)室級(jí)純化方法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)并不經(jīng)濟(jì)。
同理，本發(fā)明提供的組合物并未見(jiàn)于其他的大規(guī)模生產(chǎn)方法。如表五所示，其他的方法雖可生產(chǎn)至少98.5％純度的紫杉醇，但其紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物組合物不同于(并且遜于)本發(fā)明提供的組合物。
9)大規(guī)模層析法本發(fā)明的一相關(guān)方面，為采用適合于工業(yè)用、高效、中壓的大尺寸層析柱。在本發(fā)明中，該大尺寸層析柱的內(nèi)徑至少一英寸。在一具體例中，層析柱的直徑1.25-1.35英寸。在一大規(guī)模具體例中，該大規(guī)模層析柱的直徑6-18英寸，柱長(zhǎng)可能1-20英尺。大規(guī)模層析柱的優(yōu)選柱長(zhǎng)10英尺。大尺寸層析柱一向不適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。原因包括制造成本，建立可重現(xiàn)的柱填充方法的困難，再生填充介質(zhì)的困難，高壓操作，移除溶劑的安全考慮等。實(shí)驗(yàn)室級(jí)方法通常不會(huì)遇到這一類(lèi)實(shí)用性的問(wèn)題，因其規(guī)模允許較彈性的設(shè)計(jì)，和較寬松的經(jīng)濟(jì)要求。
本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)，可以采用商品化材料，或簡(jiǎn)易制作法，以經(jīng)濟(jì)制作大尺寸、高效的層析柱。該設(shè)計(jì)還包括安全需求，柱填充方法，提供一效能可重現(xiàn)的，可經(jīng)濟(jì)操作的大尺寸層析柱。
為提供一可重現(xiàn)的柱填充方法，層析柱上可安裝一個(gè)以上的震動(dòng)器，以協(xié)助柱填充介質(zhì)的均勻填充?？芍噩F(xiàn)的柱填充方法，對(duì)于大尺寸層析柱的高層析效能至關(guān)重要。在一優(yōu)選的具體例中，層析柱每次使用前均填充新鮮硅膠。
快速有效的移除柱填充介質(zhì)，有賴(lài)于一可靠的柱填充介質(zhì)干燥法。當(dāng)使用有機(jī)溶劑洗脫介質(zhì)時(shí)，尤其重要。本發(fā)明的層析柱安裝有自調(diào)控的加熱纜線(xiàn)，可提供層析柱熱量，以安全地蒸干有機(jī)溶劑。再以一氣體，優(yōu)選氮?dú)?，通過(guò)層析柱，移除有機(jī)溶劑，以吹干柱填充介質(zhì)。有時(shí)，干燥步驟可能包括以熱空氣，氮?dú)鈴闹M(jìn)出口之一通過(guò)填充介質(zhì)，或?qū)游鲋┱婵铡８稍镏罂梢源蜷_(kāi)任一法蘭，并在相反端均勻加壓以有效移除柱填充介質(zhì)。有時(shí)，可以吸出填充介質(zhì)以進(jìn)行移除。
從前文的描述可知，本發(fā)明的實(shí)施具體例，包括從含紫杉醇物質(zhì)分離生產(chǎn)紫杉醇，及各種組合物。下文的實(shí)施例目的在于說(shuō)明，但并不局限于此。
實(shí)施例實(shí)施例1用甲醇大規(guī)模提取紅豆杉樹(shù)皮從紅豆杉樹(shù)皮提取紫杉醇，是在一特制的22,000升溫控、夾層、提取罐進(jìn)行。該罐裝有纖維過(guò)濾系統(tǒng)，是一種浸透方法的設(shè)計(jì)。本系統(tǒng)可做為一反應(yīng)器，使用大量易燃溶劑，安全，定量地提取紫杉醇。提取罐上方有一噴口，可將樹(shù)皮直接從儲(chǔ)存容器導(dǎo)入提取罐，從而避免碎樹(shù)皮散逸。在罐底部裝有粗過(guò)濾系統(tǒng)，可承擔(dān)樹(shù)皮，而讓甲醇液流通。該過(guò)濾系統(tǒng)則以一不銹鋼制的支架支撐。
一套氣動(dòng)傳輸系統(tǒng)可傳輸新鮮及廢樹(shù)皮。另一噴口則用來(lái)導(dǎo)入氮?dú)猓采w于甲醇上以達(dá)到安全。在罐頂部中央的6寸噴口，裝有一套螺旋傳輸系統(tǒng)，用來(lái)將干樹(shù)皮導(dǎo)入提取罐。
在罐頂中央的內(nèi)部，6寸噴口下方，裝有一樹(shù)皮分布盤(pán)，用來(lái)將樹(shù)皮均勻分布到提取罐。將樹(shù)皮以12,000升，40℃甲醇浸透3天，可以有效提取，產(chǎn)生10,000升甲醇提取液。此大量體積的提取液再以一種蒸發(fā)器蒸發(fā)減量。
實(shí)施例2大規(guī)模液液萃取在一裝有攪拌器，6000 L的分配槽中，將濃縮的甲醇提取液以二氯甲烷萃取。以分離開(kāi)甲醇/水可溶化合物與二氯甲烷可溶化合物。
各溶劑比例為924 L的濃縮甲醇提取液，1103 L的二氯甲烷，450 L的水。分配形成后，946 L含紫杉醇的二氯甲烷相會(huì)分離成兩層。下層深紅色，透明的二氯甲烷相保留，上層橄欖綠色的則丟棄。分析發(fā)現(xiàn)，此一二氯甲烷濃縮液含有2-3％的紫杉醇，產(chǎn)率高于90％。
實(shí)施例3以第一硅膠層析柱生產(chǎn)10％紫杉醇提取物本實(shí)驗(yàn)的目的，在于評(píng)估影響層析效能的某些重要參數(shù)。包括梯度流動(dòng)相的組合物，及數(shù)量，含紫杉醇上料的純度，流動(dòng)相的流速等。研究這些參數(shù)的目的，在于找到簡(jiǎn)單，廉價(jià)的方法，以生產(chǎn)符合純度要求的提取物。初步實(shí)驗(yàn)在玻璃柱以重力進(jìn)行，待參數(shù)的范圍窄化后，再移到不銹鋼柱進(jìn)行。
表6綜合一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目的在探討最佳化層析方法的溶劑組合物。這些實(shí)驗(yàn)采用70∶30至75∶25己烷/丙酮的等度溶劑系統(tǒng)表6

下列實(shí)驗(yàn)室級(jí)實(shí)驗(yàn)的目的，在于探討甲醇和水對(duì)柱效能的影響。將含有2.3％、5.0％和9.9％甲醇的上料，加入一先導(dǎo)級(jí)層析柱分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括核心組份，純化和收率，見(jiàn)表7。結(jié)論是，甲醇含量高的上料對(duì)層析分離有不利影響。上料的甲醇含量低于5％時(shí)，分離效果最佳。實(shí)驗(yàn)亦探討甲醇和水的組合，發(fā)現(xiàn)含甲醇0-5％和水0-2％的上料組合效果最佳。一種典型的的理想上料包含310毫克/L固體，4％甲醇和0.5％水。
表7

實(shí)施例4放大實(shí)驗(yàn)放大實(shí)驗(yàn)是以一全尺寸柱(1.35英寸×10英尺)，采用以下條件實(shí)施1)等度溶劑系統(tǒng)己烷/丙酮74∶262)上料包含約2％紫杉醇3)上料包含總固體252g4)上料的固體含量310g/L5)上料的甲醇濃度4.0％(體積比)6)上料的水濃度0.5％(體積比)7)柱填充介質(zhì)為硅膠柱，上端填一層硅藻土。8)核心組份規(guī)格含2.0％(重量比)以上紫杉醇的組份表8綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表8

以一1.35英寸×10英尺不銹鋼柱進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)生許多上料的困難。針對(duì)2％紫杉醇粗提物的上料，所采取的改善包括增加一預(yù)過(guò)濾步驟，以二氯甲烷先飽和層析柱，硅藻土過(guò)濾。最成功的方法為，在硅膠柱上端填一層硅藻土。
表8的結(jié)果顯示，所有四次實(shí)驗(yàn)的核心組份純度范圍11.5％至13.8％，收率均高于95％。
實(shí)施例5以丙酮/水沉淀法從10％紫杉醇提取物制備50％紫杉醇將715g的15.7％(重量比)紫杉醇提取物溶解于14.3L丙酮。將該溶液與35.75L水混合，攪拌過(guò)夜。過(guò)濾收集該沉淀，并以2L水洗，干燥后沉淀重197g含55.85％(重量比)紫杉醇。
權(quán)利要求
1.一種從紫杉醇提取物生產(chǎn)紫杉醇的分離方法，其步驟包括將丙酮加入紫杉醇提取物以生成丙酮混合液；再將丙酮混合液與一種水性溶劑接觸，以形成沉淀。此沉淀的紫杉醇純度高于紫杉醇提取物至少3倍；以及回收該沉淀。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少5％重量紫杉醇，沉淀含有至少20％重量紫杉醇。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少10％重量紫杉醇，沉淀含有至少40％重量紫杉醇。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中沉淀的紫杉醇純度高于紫杉醇提取物至少4倍。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是包括各種含紫杉醇物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是包括各種紅豆杉屬的植物組織。
7.如權(quán)利要求5的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)來(lái)源于一種細(xì)胞培養(yǎng)物，包括紅豆杉屬的植物組織細(xì)胞培養(yǎng)物。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是包括一種根細(xì)胞培養(yǎng)物。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是該細(xì)胞培養(yǎng)物的組織。
10.如權(quán)利要求7的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求6的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是包括T.brevifolia，T.yunnanensis，T.x media dark green spreader，T.x media Hill，T.x mediaHicksii，T.cuspidata T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa和T.sumatrana或其混合物的植物組織。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中植物組織包括樹(shù)皮，樹(shù)種包括T.brevifolia或T.yunnanensis。
13.如權(quán)利要求11的方法，其中植物組織包括根，樹(shù)種包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii或T.cuspidata。
14.如權(quán)利要求11的方法，其中植物組織包括針葉，樹(shù)種包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii，T.cuspidata或T.canadensis。
15.如權(quán)利要求5的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)是一種生產(chǎn)紫杉醇的微生物。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中該微生物是一種Erwinia taxi或Taxomyces andreanae。
17.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是進(jìn)行至少一次的層析\洗脫紫杉醇而制得。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中層析介質(zhì)為硅膠基質(zhì)。
19.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物來(lái)自將含有一種有機(jī)溶劑的紫杉醇混合液進(jìn)行至少兩次的沉淀。
20.如權(quán)利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是進(jìn)行至少一次的層析，洗脫紫杉醇，以及將溶于一種有機(jī)溶劑的紫杉醇混合液進(jìn)行至少一次的沉淀來(lái)制備。
21.如權(quán)利要求17-20的任何一項(xiàng)的方法，其中紫杉醇提取物是進(jìn)一步進(jìn)行至少一次有機(jī)溶劑的液液萃取，以形成兩相溶液，其中一相富含紫杉醇。
22.如權(quán)利要求1的方法，其中水性溶劑含有至少50％體積的水。
23.如權(quán)利要求1的方法，其中水性溶劑含有至少70％體積的水。
24.如權(quán)利要求1的方法，其中水性溶劑含有至少90％體積的水。
25.如權(quán)利要求1的方法，其中水性溶劑含有純水。
26.如權(quán)利要求22-25的任何一項(xiàng)的方法，其中水性溶劑為緩沖液。
27.如權(quán)利要求1的方法，其中以1-5體積水性溶劑加入1體積的丙酮混合液。
28.如權(quán)利要求1的方法，其中以2-3體積水性溶劑加入1體積的丙酮混合液。
29.如權(quán)利要求1的方法，其中以2.5體積水性溶劑加入1體積的丙酮混合液。
30.如權(quán)利要求1的方法，其中沉淀所包含的不純物量低于丙酮混合液的不純物含量。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中沉淀所包含的不純物量低于丙酮混合液的不純物含量的至少50％。
32.如權(quán)利要求30的方法，其中沉淀所包含的不純物量低于丙酮混合液的不純物含量的至少75％。
33.如權(quán)利要求1的方法，其中沉淀包含至少90％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。
34.如權(quán)利要求1的方法，其中沉淀包含至少95％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。
35.一種制備至少5％重量紫杉醇的丙酮混合液的方法，其步驟包括a)以甲醇提取含至少0.005％紫杉醇的紫杉醇物質(zhì)，以制備甲醇提取物；b)將甲醇提取物與二氯甲烷、水進(jìn)行液液萃取，分離成兩相，甲醇相包含水/甲醇，二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇/水相后，得到一種濃縮提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％體積的甲醇，少于1％體積的水；d)濃縮提取物加入第一硅膠基質(zhì)，經(jīng)洗脫后，達(dá)到至少5％重量紫杉醇；e)將丙酮加入第一洗脫液，生成丙酮混合液。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)包括自T.brevifolia，T.yunnanensis，T.X.media dark green spreader，T.x media Hill，T.xmedia Hicksii，T.cuspidata，T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa和T.sumatrana等樹(shù)種選得的植物組織以及能表現(xiàn)、生產(chǎn)紫杉醇的微生物和細(xì)胞培養(yǎng)。
37.如權(quán)利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少10％重量紫杉醇。
38.如權(quán)利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少12.5％重量紫杉醇。
39.如權(quán)利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少90％的存在于濃縮提取物的紫杉醇。
40.如權(quán)利要求35的方法，其中濃縮提取物的甲醇含量為2.5％至5％體積，水含量為0.1％至1％體積。
41.如權(quán)利要求35的方法，其中在d)步驟之后，e)步驟之前含有至少5％重量紫杉醇的洗脫液被干燥成濃縮殘留物，在步驟e)將丙酮加入以溶解濃縮殘留物中的紫杉醇。
42.一種從含紫杉醇物質(zhì)分離紫杉醇的方法，其步驟包括a)以甲醇提取含紫杉醇物質(zhì)，以制備甲醇提取物；b)將甲醇提取物與二氯甲烷、水進(jìn)行液液萃取，分離成兩相，甲醇相包含水/甲醇，二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇相后，得到濃縮提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％體積的甲醇，少于1％體積的水；d)濃縮提取物加入第一硅膠基質(zhì)，經(jīng)洗脫后，達(dá)到至少10％重量紫杉醇的第一洗脫液；e)將丙酮加入第一洗脫液，生成丙酮混合液；f)將丙酮混合液與一水性溶劑接觸，以生成紫杉醇含量至少40％重量的沉淀；g)以第二硅膠層析柱，將該沉淀純化，洗脫，生成第二洗脫液，紫杉醇含量至少65％重量；h)將第二洗脫液與戊烷混合，結(jié)晶生成第一結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少85％重量；i)以第三硅膠層析柱將該第一結(jié)晶固體純化，洗脫生成第三洗脫液，紫杉醇含量至少90％重量；j)第三洗脫液與戊烷混合，結(jié)晶生成第二結(jié)晶固體，紫杉醇含量至少98.5％。
43.如權(quán)利要求42的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇含量為至少0.005％重量。
44.如權(quán)利要求42的方法，其中含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇含量為至少0.02％重量。
45.如權(quán)利要求42的方法，其中將丙酮加入第一洗脫液的一種濃縮殘留物中。
46.如權(quán)利要求42的方法，其中第一、第二、第三洗脫液至少有一種先經(jīng)濃縮干燥成為濃縮殘留物。
47.如權(quán)利要求46的方法，其中至少有一種濃縮殘留物溶解于一種有機(jī)溶劑中。
48.如權(quán)利要求42的方法，其中第二結(jié)晶固體的紫杉醇含量為至少99.0％重量。
49.如權(quán)利要求42的方法，其中第二結(jié)晶固體的紫杉醇含量為至少99.5％重量。
50.如權(quán)利要求42的方法，其中第二結(jié)晶固體含有至少40％的存在于起始含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇。
51.如權(quán)利要求42的方法，其中第二結(jié)晶固體含有至少60％的存在于起始含紫杉醇物質(zhì)的紫杉醇。
52.如權(quán)利要求42-51中任何一項(xiàng)的方法，其中第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.2％。
53.如權(quán)利要求52的方法，其中第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.1％重量。
54.如權(quán)利要求52的方法，其中第二結(jié)晶固體含有的任何一種紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物均少于0.05％重量。
55.如權(quán)利要求42的方法，其中b-j步驟的每一步驟可回收至少90％存在于其前一步驟的紫杉醇。
56.一種紫杉醇組合物，含有至少99.5％的紫杉醇、從0.05到0.14％的總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物。
57.如權(quán)利要求56的組合物，其中總紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物的量為從0.06到0.09％。
58.如權(quán)利要求56的組合物，其中紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物為從0.01到0.05％的cephalomannine。
59.如權(quán)利要求58的組合物，其中紅豆杉烷類(lèi)化合物不純物為從0.01到0.03％的cephalomannine。
60.如權(quán)利要求56的組合物，其中含有少于0.1％的10-DAT、7-epi-10-DAT和7-epi-paclitaxel。
61.以權(quán)利要求56的組合物與一醫(yī)藥用載體或稀釋液配方制備成的一種藥品級(jí)組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從含紫杉醇物質(zhì)生產(chǎn)紫杉醇的分離方法,其步驟包括:從含紫杉醇物質(zhì)制備丙酮混合液,再將丙酮混合液與水性溶劑接觸,以形成水相上清液和沉淀。此沉淀的紫杉醇純度高于紫杉醇提取物至少3倍。丙酮/水沉淀法以高產(chǎn)率制備高純度紫杉醇,適合采用常規(guī)正相硅膠層析柱分離法進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的分離,以及藥品級(jí)紫杉醇組合物的制品。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1342155SQ99815315
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期1999年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月30日
發(fā)明者胡祥海, 白玉里, 馬丁·艾略特 申請(qǐng)人:加拿大植原藥物公司