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      使用組織特異性模擬肽配體的靶向遞送的制作方法

      文檔序號:8211744閱讀:895來源:國知局
      使用組織特異性模擬肽配體的靶向遞送的制作方法
      【專利說明】使用組織特異性模擬肽配體的靶向遞送
      [0001] 本申請是申請日為2010年9月3日、申請?zhí)枮?01080049232. 6、發(fā)明名稱為"使 用組織特異性模擬肽配體的靶向遞送"的中國專利申請的分案申請。
      [0002] 發(fā)曰月?lián)恍g(shù)領(lǐng)域
      [0003] 本發(fā)明總地涉及疾病治療和診斷領(lǐng)域,并且更具體地涉及用于將藥劑遞送到特異 性靶組織的新組合物和方法的開發(fā)。
      【背景技術(shù)】
      [0004] 在不限制本發(fā)明的范圍的前提下,將其背景結(jié)合向特異性靶組織遞送進行描述。
      [0005] 用于癌癥治療的經(jīng)靜脈注射療法被認為是最終的療法,由于所有的腫瘤及其轉(zhuǎn)移 瘤是由血管維持的。這些腫瘤血管床是足夠滲漏的,從而使脂質(zhì)體能直接達到腫瘤細胞???以使用遞送到腫瘤脈管系統(tǒng)的抗血管生成藥物或者基因療法來阻止向腫瘤的血液供應(yīng),從 而引起腫瘤消退。
      [0006] 靶向遞送對于最高的療效和降低的毒性而言是必要的。在多數(shù)脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)廣 泛的治療應(yīng)用中,主要的限制在于其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低,在經(jīng)靜脈遞送之后在肺中的累積,聚 集,全身性遞送之后的清除(例如被Kupffer細胞),不能將所注射的脂質(zhì)體復(fù)合物的大部 分遞送到靶細胞和器官以及其他組織。缺少用于有效靶向的已知細胞表面受體使得用于癌 癥治療的靶向遞送更加復(fù)雜。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明包括用于治療劑的組織特異性靶向遞送的靶向配體。所述的配體包含組合 物,該組合物具有式A-骨架-A'和一種或多種共價連接到骨架上的疏水錨。連接到所述骨 架上的所述A和A'化合物包括單價模擬肽(peptidomimetic)化合物,其中各個單價模擬肽 化合物選自:片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs 和嗎啉(morpholino)?;衔顰和A'可以是相同的。所述的骨架可以包含反應(yīng)性二氯三 嗪基團。在一個實施方案中,一個或多個所述的疏水錨包含烴部分。在一個實例中,所述的 烴部分可以是十八烷基基團。所述的靶向配體還可以包含一個或多個接頭,所述的接頭是 可切割的或者不可切割的,所述的接頭官能上(functionally)插入到骨架和疏水銷之間。
      [0008] 本發(fā)明還提供了合成用于靶向遞送治療劑的小分子復(fù)合物的方法。所述的方法包 括將兩個或多個單價模擬肽化合物共價地偶聯(lián)到骨架,其中各個單價模擬肽化合物選自: 片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和嗎啉;并 且將一個或多個疏水錨偶聯(lián)到該骨架。A和A'化合物可以是相同的。所述的骨架可以包含 反應(yīng)性二氯三嗪基團。在一個實施方案中,一個或多個所述的疏水錨包含烴部分。在一個 實例中,所述的烴部分可以是十八烷基基團。所述的靶向配體還可以包含一個或多個接頭, 所述的接頭是可切割的或者不可切割的,所述的接頭官能上插入到骨架和疏水錨之間。
      [0009] 本發(fā)明還包括配體官能化的遞送系統(tǒng),所述的遞送系統(tǒng)包含治療劑載體,以及用 于將治療劑的組織特異性靶向遞送的靶向配體。在一個實施方案中,所述的治療劑載體是 脂質(zhì)體。在一個實例中,所述的靶向配體非共價地通過一個或多個疏水錨,錨定在陽離子型 脂質(zhì)體的外部脂雙層的外表面上,所述的陽離子型脂質(zhì)體具有內(nèi)部脂雙層和外部脂雙層。
      [0010] 本發(fā)明的另一個實施方案包括將有效負載(payload)遞送到靶組織的方法。該 方法包括步驟:合成用于將治療劑的組織特異性靶向遞送的靶向配體;將該靶向配體引入 到包裹了治療劑的脂雙層中,所述的脂雙層如細胞膜或者亞細胞的膜,或者多層或兩層囊 泡,或者更具體地為雙室泡;將所述的脂質(zhì)體使用靶向配體進行覆蓋;將此靶向脂質(zhì)體復(fù) 合物與可逆掩蔽試劑(reversemaskingreagent)組合;并且將治療有效量的該經(jīng)掩蔽 的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物給予患者。在一個實施方案中,所述的脂質(zhì)體可以是兩層內(nèi)陷的囊泡 (bilamellarinvaginatedvesicle,"BIV")。具有約500Da或者更低的分子量的小的中 性脂質(zhì)可以用作可逆掩蔽試劑。所述的靶組織可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小細胞 肺癌、人非小細胞肺癌血管內(nèi)皮、黑色素瘤或者人胰腺癌血管內(nèi)皮。靶向配體的實例包括 以下化合物中的至少一種,所述化合物為KB995、KB1001、KB1003、KB1005、KB1012、KB1023、 KB1029、KB1035、KB1036、KB1039、KB1042、KB1051、KB1061、KB1062、KB1063、KB1064、KB1066、 KB1067、KB1096、KB1107、KB1108或者KB1109。在一個方面,所述的靶組織是黑色素瘤,并 且所述靶向配體是化合物KB1037、KB1109和KB1123的至少一種。
      [0011] 在另一個實施方案中,本發(fā)明包括分離用于結(jié)合靶組織的模擬肽化合物的方法, 所述的方法包括步驟:制備具有式:A-骨架-A'的組合物,其中A和A'包括單價模擬肽化 合物,其中各個單價模擬肽化合物選自:片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、 KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和嗎啉;并且一種或多種疏水錨共價地連接到骨架上;將靶組 織與模擬肽化合物接觸;分離與靶組織特異性地結(jié)合的模擬肽化合物;并且表征特異性地 連接到靶組織的組合物的式。所述的靶組織可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小細胞肺 癌、人非小細胞肺癌血管內(nèi)皮、人黑色素瘤或者人胰腺癌血管內(nèi)皮。在一個方面,該方法包 括用于在解離后直接篩選患者細胞的高通量檢測。在一個方面,所述的模擬肽化合物文庫 使用例如銪或者鋱穴合物代替疏水尾部來進行標記。使用時間分辨熒光分析直接進行篩選 經(jīng)解離的患者細胞以及腫瘤對正常。
      [0012] 在一個實施方案中,本發(fā)明包括篩選結(jié)合到靶組織或細胞的模擬肽化合物的方 法,所述的方法包括步驟:制備具有式:A-骨架-A'的組合物的模擬肽文庫,其中A和A'包 括模擬肽化合物,其中各個單價模擬肽化合物選自:片段IKs、GKS、IDS、GSS、GTS、VSS、TKs、 KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和嗎啉;將一種或多種脂雙層錨共價連接到所述的模 擬肽化合物上;將該模擬肽化合物與脂質(zhì)混合以形成脂質(zhì)體;將靶組織與模擬肽化合物接 觸;分離特異性結(jié)合到靶組織的模擬肽化合物;并且表征特異性結(jié)合到靶組織的組合物的 式。
      [0013] 再另一個實施方案是篩選結(jié)合到靶組織或細胞的模擬肽化合物的方法,所述的方 法包括步驟:制備組合物的模擬肽文庫,所述的組合物具有式:A-骨架-A',其中A和A'包 括模擬肽化合物,其中各個單價模擬肽化合物選自:片段IKs、GKS、IDS、GSS、GTS、VSS、TKs、 KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和嗎啉;將一種或多種脂雙層錨共價連接到所述的模 擬肽化合物上;將該模擬肽化合物與脂質(zhì)混合形成脂質(zhì)體,其中所述的脂質(zhì)體還包含用于 遞送到細胞的核酸;將靶組織與模擬肽化合物接觸;將特異性結(jié)合到靶組織的模擬肽化合 物分離;并且表征特異性結(jié)合到靶組織的組合物的式。在一個方面,所述的靶組織進一步定 義為組織培養(yǎng)物中的細胞。在另一個方面,所述的靶組織進一步定義為組織培養(yǎng)物中的細 胞,并且所述的細胞是根據(jù)核酸對細胞的影響進行選擇的。在再另一個方面,所述的靶組織 進一步定義為組織培養(yǎng)物中的細胞,其中所述的核酸是用于陰性或陽性選擇的選擇性標記 物,其表達用于陽性或陰性選擇的選擇性標記物,或者表達可檢測的標記物。
      【附圖說明】
      [0014] 為了更完全地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點,在此參考本發(fā)明的詳述以及所附的圖, 并且其中:
      [0015] 圖1是識別化合物的一般方案(generalscheme)的圖;
      [0016] 圖2顯示了通過哌啶與取代的熒光素的選擇性反應(yīng)制備二聚體;
      [0017] 圖3顯示了靶向策略的優(yōu)化,經(jīng)優(yōu)化的靶向策略用于將90%以上的經(jīng)靜脈注射的 BIV復(fù)合物專一地遞送到靶細胞中;
      [0018] 圖4顯示了本發(fā)明的多種化合物的結(jié)構(gòu),一般結(jié)構(gòu)在頂部顯示,具體結(jié)構(gòu)從左到 右列出,分別為KB991-KB1005;
      [0019] 圖5總結(jié)了本發(fā)明的結(jié)合部分的組合(A和/或A');
      [0020] 圖6顯示了本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的一個實例,一般結(jié)構(gòu)在頂部顯示,具體結(jié)構(gòu)從左到右 列出,分別為KB991-KB1005;
      [0021] 圖7a到7d顯示了在本發(fā)明的結(jié)合部分的部分優(yōu)化(A=Frag.A和/或A' = Frag.B);
      [0022] 圖8是顯示了所列出的化合物針對MCF7細胞的轉(zhuǎn)染效率的圖;
      [0023] 圖9是顯示了所列出的化合物針對A549細胞的轉(zhuǎn)染效率的圖;
      [0024] 圖10是顯示了所列出的化合物針對MCF10A細胞的轉(zhuǎn)染效率的圖;
      [0025] 圖11是顯示了使用經(jīng)覆蓋的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)中所列出的化合物,在Panel細胞中 相對熒光素酶表達的圖;
      [0026] 圖12是顯示了使用經(jīng)覆蓋的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)中所列出的化合物,在MiaPaCa2細 胞中相對焚光素酶表達的圖;
      [0027] 圖13是顯示了使用經(jīng)覆蓋的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)中所列出的化合物,在HPDE細胞中 相對熒光素酶表達的圖;
      [0028] 圖14是顯示了使用所列出的化合物,在HUVEC和HI299細胞的共培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染增 強;
      [0029] 圖15是顯示了單獨使用所列出的化合物,在HI299細胞的培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染結(jié)果的 圖,未注意到增強;
      [0030] 圖16是顯示了使用所列出的化合物,在HUVEC細胞的培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染增強的圖,未 注意到增強;
      [0031] 圖17顯示了使用所列出的化合物,在HUVEC和PANC1細胞的共培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染增 強;
      [0032] 圖18是顯示了單獨使用所列出的化合物,在PANC1細胞的培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染結(jié)果的 圖,未注意到增強;
      [0033] 圖19是顯示了單獨使用所列出的化合物,在HUVEC細胞的培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染結(jié)果的 圖,未注意到增強;
      [0034] 圖20a到20c,在共培養(yǎng)后,內(nèi)皮CD31+表達的增加。在對細胞計數(shù)后,我們以 30:1HUVEC:H1299的點板比建立了共培養(yǎng)物。使用結(jié)合藻紅蛋白的抗-⑶31Ab將內(nèi)皮細胞 染色,并且在接種后使用流式細胞術(shù)每天測量內(nèi)皮細胞的數(shù)量(由R3進行分選)。大多數(shù) 的內(nèi)皮細胞表達低水平的CD31 (由R4進行分選)。少數(shù)的內(nèi)皮細胞表達高水平的CD31 (由 R2進行分選)。在共培養(yǎng)后8天,所述共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞群與HUVEC對照相比,CD31表達 顯著提高(c)。在共培養(yǎng)物中9天后,與HUVEC對照(a,c)相比,共培養(yǎng)中(b,c)⑶31表達 的提高更多。*P= 0.026。
      [0035] 圖21a和21b。在共培養(yǎng)后內(nèi)皮VEGF-A表達的提高。以10:1HUVEC:PANC1的點板 比建立共培養(yǎng)物,并在雙室transwell盤中培養(yǎng)8天。收獲內(nèi)皮細胞并使用實時RT-PCR和 蛋白質(zhì)印跡法測量VEGF-A的表達。與HUVEC相比,在共培養(yǎng)之后,內(nèi)皮VEGF-A的表達在轉(zhuǎn) 錄(a)和翻譯(b)的水平上上升了。*P〈0. 01,N= 6。
      [0036] 圖22a到22f。在共培養(yǎng)后管存活的延長。以10:1HUVEC:PANC1的點板比在 transwell盤中共培養(yǎng)后8天,收獲內(nèi)皮細胞并且接種到Matrigel上。16小時之后,HUVEC 對照(a)和共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞(b)都形成類似毛細血管的管狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)在48小時 之后開始降解。到72小時為止,HUVEC對照的管狀結(jié)構(gòu)幾乎完全降解(c)。然而在共培養(yǎng) 物中,有顯著量的管狀結(jié)構(gòu)存活(d)。這些結(jié)構(gòu)保持了優(yōu)秀的管狀網(wǎng)絡(luò)并且又存活了 11天 (e,f) 〇
      [0037] 圖23a和23b。二價小分子結(jié)構(gòu)和文庫篩選。二價小分子的一般結(jié)構(gòu)(23a)包括 兩個用于與細胞表面受體相互作用的0 _轉(zhuǎn)角模擬物,用于插入到BIV脂質(zhì)體復(fù)合物的烴 尾部,以及接頭。還顯示了我們"命中"的分子,KB1023的結(jié)構(gòu)。使用高通量的熒光素酶檢 測(23b)來篩選腫瘤內(nèi)皮細胞特異性靶向配體。在共培養(yǎng)后7天,收獲細胞并且按2X104 個細胞/孔接種到96孔板中。在同一天,制備了BIV-熒光素酶DNA:脂質(zhì)體復(fù)合物,隨后 將化合物在多個化合物:DNA的比率下進行覆蓋。將經(jīng)覆蓋的復(fù)合物在室溫下溫育過夜。 次日將細胞使用含有〇. 52yL經(jīng)覆蓋的復(fù)合物的50yL無血清培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染。通過將 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換為含血清的細胞培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之后24小時,將細胞裂解,并且 將該細胞裂解液按20yL/孔加載到96孔板上用于熒光素酶分析,所述熒光素酶分析使用 Luminoskan板讀數(shù)儀進行。
      [0038] 圖24是本發(fā)明方法的流程圖。
      [0039] 圖25a到25h。靶向胰腺和肺腫瘤內(nèi)皮細胞的配體?;衔颣B1023提高了 PANC1+HUVEC共培養(yǎng)物(a),而非PANC1細胞(b)或HUVEC(c)的轉(zhuǎn)染效率。共培養(yǎng)物中對 內(nèi)皮細胞間隙(endotheliumcompartment)的革巴向(d)使用雙室的transwell培養(yǎng)系統(tǒng)證 實。KB1023也提高了與AsPCl細胞共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染效率(e)。KB1061提高了 H1299和HUVEC(f)的共培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)染效率,而非H1299細胞(g)或者HUVECs(h)的轉(zhuǎn)染 效率。將熒光素酶基因的表達與未經(jīng)覆蓋的脂質(zhì)體復(fù)合物進行了比較。*P〈〇. 05。
      [0040] 圖26a到26c。體內(nèi)靶向和優(yōu)化。在經(jīng)靜脈注射后24小時,大部分KB1023覆蓋的 脂質(zhì)體復(fù)合物非特異性地轉(zhuǎn)染到肺和心臟中(a)。當使用可逆掩蔽(RM)進行注射,以及采 用提高RM試劑濃度時,經(jīng)靜脈注射后14小時的肺和心臟的非特異性攝取顯著地下降。在 llmMRM下,經(jīng)靜脈注射后14小時肺和心臟顯示出很少到?jīng)]有非特異性攝?。╞),而經(jīng)靜脈 注射后14小時在腫瘤組織中的遞送和隨后的基因表達增加了約10倍(c)。在其他的非特 異性組織如肝臟(c)中未發(fā)現(xiàn)增加的遞送,這表明該靶向?qū)δ[瘤中的內(nèi)皮是特異性的。將 腫瘤血管內(nèi)皮從腫瘤組織中解離從而進行CAT分析和蛋白質(zhì)分析是不允許的;因此向腫瘤 血管內(nèi)皮中的遞送提高10倍是被低估的。由于腫瘤內(nèi)皮約占整個腫瘤體積的5%,向腫瘤 血管中提高的靶向遞送很可能比單獨使用未經(jīng)覆蓋的BTV復(fù)合物高約200倍。RM超過llmM 進一步提高未增加向腫瘤組織中的遞送,反而削弱了遞送和隨后的基因表達。因此,對于腫 瘤內(nèi)皮的靶向遞送,使用llmMRM是最佳的。在經(jīng)靜脈注射后14小時測量!^!'的表達,并 且與使用無RM的靶向遞送的對照進行比較。*P〈〇. 01. ~P〈〇. 05. N = 4?5每組。
      [0041] 圖27,使用TSP1基因的靶向遞送抑制腫瘤的生長。在經(jīng)腹腔注射共培養(yǎng)物之后2 周,將包裹了 35yg TSP1 DNA的BIV脂質(zhì)體復(fù)合物用配體KB1023覆蓋,并且與llmM可逆 掩蔽(RM)經(jīng)靜脈共同注射到各個小鼠中。所述的注射每兩周一次,總計經(jīng)靜脈進行三次注 射。最后一次注射后2周(經(jīng)腹腔注射共培養(yǎng)物后8周),將小鼠處死從而比較腹內(nèi)腫瘤的 尺寸。與僅注射了脂質(zhì)體的對照小鼠相比,使用TSP1的人腫瘤內(nèi)皮靶向遞送處理小鼠證實 癌癥的生長顯著延緩。當將靶向遞送與最佳的掩蔽(RM)組合時,腫瘤生長被極大程度上抑 制,幾乎將腫瘤根除。當治療增加到每周注射總共五次經(jīng)靜脈注射時,腫瘤生長進一步地被 抑制。*N = 20。其他組每組包括5?7只小鼠。#P〈0. 05。
      [0042] 圖28顯示了SK-MEL-28細胞用KB1037、KB1109和KB1123轉(zhuǎn)染后表達的增加。
      [0043] 圖29顯示了腹壁黑色素瘤腫瘤細胞用KB1037、KB1109和KB1123轉(zhuǎn)染之后表達的 增加;
      [0044] 圖30顯示了左臀肌黑色素瘤腫瘤細胞用KB1037、KB1109和KB1123轉(zhuǎn)染之后表達 的增加。
      [0045] 發(fā)明描沐
      [0046] 盡管在下文中詳細討論了本發(fā)明的多種實施方案的制備和使用,應(yīng)當認識到本發(fā) 明提供了多種可實施的發(fā)明構(gòu)思,所述的發(fā)明構(gòu)思可以在大量的具體環(huán)境下進行實施。在 本文中討論的具體實施方案僅僅是為了說明制備和使用本發(fā)明的具體方式,而不限制本發(fā) 明的范圍。
      [0047] 為了便于理解本發(fā)明,在下文中定義了多個術(shù)語。在本文中所定義的術(shù)語具有本 發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的意義。術(shù)語如"一個(a) "、"一個(an)"和"該 (the) "不意圖僅指單個的實體,而是包括用具體例子說明的一般的類。本文的術(shù)語用于描 述本發(fā)明的具體實施方案,但是其使用不限制本發(fā)明,除非在權(quán)利要求中指出。
      [0048] 在脂質(zhì)體表面多聚化(multimerized)的小肽可以在重復(fù)的注射,尤其是全身性 注射后產(chǎn)生免疫應(yīng)答,并且肽可以避免滲透及沿腫瘤的間質(zhì)壓力梯度的遞送。其他更大的 配體,包括抗體、抗體片段、蛋白質(zhì)、不完全蛋白等等比使用小肽遠遠更難用于脂質(zhì)體表面 上的靶向遞送。需要的是小的非免疫原性分子,該分子可以位于遞送系統(tǒng)如脂質(zhì)體的表面 上,從而將脂質(zhì)體選擇性地靶向到組織。
      [0049] 模擬肽是模擬肽的生物活性的分子,但是在化學(xué)本質(zhì)上不再是肽。術(shù)語模擬肽一 般描述了不再含有任何肽鍵(即氨基酸之間的酰胺鍵)的分子。
      [0050] 如本文中所使用的,術(shù)語"模擬肽"指在本質(zhì)上不完全是肽的分子,例如假肽 (pseudopeptides)、半肽(semi-peptides)和類肽(peptoids)。無論是完全地或者部分地 非肽,根據(jù)本發(fā)明的模擬肽提供了反應(yīng)性化學(xué)部分的空間排布,該排布非常類似于在蛋白 質(zhì)-配體相互作用的熱點領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)基序的三維分布,例如設(shè)計用于對細胞表面 受體有親和性的二價0轉(zhuǎn)角模擬物。
      [0051] 脂質(zhì)體有效負載的靶向遞送對于最大療效和降低的毒性是必需的。一般地,本發(fā) 明提供了與現(xiàn)有的方法相比,以更高的效率介導(dǎo)將治療遞送到靶細胞中的配體。本發(fā)明還 提供了合成該靶向配體的方法,以及使用該配體將治療有效遞送到靶細胞中的方法。這些 靶向配體為小分子的事實使其能夠無限制地重
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