一種云芝多糖顆粒沖劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)、藥學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種云芝多糖顆粒沖劑及 其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 云芝多糖來自液體培養(yǎng)的云芝菌絲體中的胞內(nèi)多糖或發(fā)酵液中的胞外多糖。研 宄發(fā)現(xiàn)云芝多糖能降低大鼠大腦組織的脂質(zhì)過氧化水平，并加速自由基的清除（Chen et al.，2013)。特別地，饒剛等人通過臨床觀察驗(yàn)證了云芝多糖對高脂血癥有明顯療效，是一 種安全的制劑（饒剛，2007)。王紅等人也發(fā)現(xiàn)PSK有一定降血脂作用，具有一定的時效性和 改善血液的黏、凝、聚狀態(tài)（王紅，2011)云芝菌株發(fā)酵的目的是收獲菌絲體和發(fā)酵液，提取 得到云芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖，這就要求提高產(chǎn)量，同時現(xiàn)在已有發(fā)酵制備云芝胞內(nèi)胞外 多糖及其產(chǎn)品的分離純化的最適合條件（孫靜，2012)。云芝糖肽在體內(nèi)對荷瘤小鼠的免疫 調(diào)節(jié)作用可能是通過TLR4信號通路來實(shí)現(xiàn)的（董冰，2014);宋娟娜等在顆粒成型工藝研宄 中加入一定的輔料發(fā)現(xiàn)顆粒的成型性、溶解性及抗?jié)裥远加兴鰪?qiáng)（宋娟娜等，2008)，表 明對多糖添加一定輔料，可提高多糖穩(wěn)定性，降低其吸濕性。云芝多糖通常具有較強(qiáng)的吸濕 性，易吸收空氣中的水分，結(jié)塊、甚至霉變，從而影響藥品的質(zhì)量和療效，為了降低其吸濕性 而便于儲藏，一般加入適量的輔料與之混合。目前云芝多糖顆粒沖劑產(chǎn)品的開發(fā)尚不多見， 本專利通過云芝多糖顆粒沖劑產(chǎn)品的研制，并且采用高血脂癥小鼠實(shí)驗(yàn)來鑒定云芝多糖顆 粒沖劑產(chǎn)品的降血脂功效，為云芝多糖產(chǎn)品的保健應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種云芝多糖顆粒 沖劑，該云芝多糖顆粒沖劑制作簡單、成本低且吸濕率小、穩(wěn)定性好。
[0004] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述云芝多糖顆粒沖劑的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述云芝多糖顆粒沖劑應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種云芝多糖顆粒沖劑，包含如下按質(zhì)量百分比計的組分：
[0008] 云芝多糖提取物 4.25%?8.75 %;
[0009] β-環(huán)糊精 7.75 % ?23.25%; 糊精 46.35 % ?77.25%; 可溶性淀粉 7.75 %?23.25%; 甜蜜素 0.31 %?0.84%;
[0010] 所述的云芝多糖顆粒沖劑，優(yōu)選包含如下按質(zhì)量百分比計的組分：
[0011] 云芝多糖提取物 6.67%; β-環(huán)糊精 15.45%; 糊精 61.81%; 可溶性淀粉 15.45%; 甜蜜素 0.62%;
[0012] 所述的云芝多糖顆粒沖劑的制備方法，包含如下步驟：將所述的云芝多糖顆粒沖 劑的組分混合攪勻；用乙醇制成軟材；過篩，干燥，過篩整粒，制得云芝多糖顆粒沖劑；
[0013] 所述的乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60 %?80 % ;
[0014] 所述的過篩是過14?40目篩；
[0015] 所述的干燥溫度為55?60°C ;
[0016] 所述的干燥溫度優(yōu)選為55°C ;
[0017] 所述的云芝多糖提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0018] (1)云芝（Coriolus versicolor)液體深層發(fā)酵后，分離得到云芝菌絲體和發(fā)酵 液，其中，云芝菌絲體干燥粉碎并過篩后脫脂，干燥，得到脫脂后的菌絲體；發(fā)酵液超濾去除 小分子物質(zhì)，得到云芝超濾液；
[0019] (2)熱水浸提脫脂后的菌絲體，得到含云芝胞內(nèi)多糖的浸提液；
[0020] (3)將步驟（1)得到的云芝超濾液和步驟（2)得到的浸提液分別濃縮，得到超濾濃 縮液和浸提濃縮液；
[0021] (4)步驟⑶制備得到的超濾濃縮液和浸提濃縮液分別加入乙醇沉降多糖，待析 出粗多糖，離心得到沉淀；先醇沉再去蛋白可以節(jié)約試劑和減少多糖損失；
[0022] (5)用水分別溶解步驟⑷制得的沉淀，并調(diào)節(jié)多糖溶液pH至7. 5?8. 5,采用胰 蛋白酶和Sevage法去蛋白，分別得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液；
[0023] (6)分別調(diào)節(jié)步驟（5)中制得的去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液pH 至7. 5?8. 0,滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2，在50?55 °C水浴保溫2?3h，對其進(jìn)行氧化脫 色處理；將脫色后的胞外多糖提取液和胞內(nèi)多糖提取液裝入截留分子量為8000?15000Da 的透析袋中以蒸餾水透析2?3d，每8?IOh更換一次蒸餾水；對透析完成后的溶液進(jìn)行 濃縮，并真空冷凍干燥，分別制得云芝胞外多糖提取物和云芝胞內(nèi)多糖提取物；
[0024] 步驟（1)中所述的云芝菌絲體干燥溫度優(yōu)選為50?55°C ;所述的過篩篩目為 14?40目，優(yōu)選為40目；
[0025] 步驟⑴中所述的脫脂方法優(yōu)選為：以菌絲體粉末與石油醚按體積比1:2混勾，振 蕩或攪拌處理2?3d，脫去菌絲體中的脂質(zhì)，離心留沉淀；重復(fù)脫脂1?2次；
[0026] 步驟（1)中所述的超濾條件優(yōu)選為進(jìn)膜壓力為lObar，通量3?5L/min，物料溫度 22°C ;所述的超濾優(yōu)選用1萬分子量PS超濾膜超濾；
[0027] 步驟⑵中所述的熱水浸提云芝多糖時，料液比為1:30,提取時間為2?3h，提取 溫度為90°C，提取次數(shù)為1?3次；
[0028] 步驟（3)中所述的濃縮的溫度優(yōu)選為55°C?60°C ;優(yōu)選為60°C ;
[0029] 步驟（4)中所述的乙醇用量為超濾濃縮液或浸提濃縮液體積的3?5倍；
[0030] 步驟⑷中所述的沉降溫度為0?8 °C，沉降的時間為48?72h ;
[0031] 步驟（5)中所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2用量為每IOOmL多糖提取液加2mL的 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2;
[0032] 步驟（5)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟：
[0033] ①將胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合并37 °C?40 °C振蕩30?60min，再水浴滅 酶10?15min，冷卻至室溫；
[0034] ②加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30?40min ;然后離心，棄取蛋 白層及有機(jī)溶液，回收上清液；
[0035] ③重復(fù)步驟②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0036] 步驟①中所述的胰蛋白酶的初始濃度優(yōu)選為2% (W/V);所述的胰蛋白酶的用量 為多糖溶液體積的8%?15% ;所述的滅酶溫度優(yōu)選為100°C?IKTC ;
[0037] 步驟①中所述的將胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合的具體操作優(yōu)選為：配制 2% (W/V)胰蛋白酶溶液，將胰蛋白酶溶液和多糖溶液分別35 °C?40 °C水浴預(yù)熱10? 15min，然后將預(yù)熱后的胰蛋白酶溶液和多糖溶液充分混合；
[0038] 步驟②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的體積比為5:1 ;
[0039] 步驟②所述的離心轉(zhuǎn)速為8000?lOOOOrpm，所述的離心時間為10?15min ;
[0040] 步驟（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液體發(fā)酵的方法，包含如下步驟：
[0041] ( I )將云芝斜面母種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中，24?27°C培養(yǎng)10? 15d，直至菌絲鋪滿斜面為止，得到云芝斜面菌種；
[0042] ( II )從步驟（I )制備得到的云芝斜面菌種上挑取4?6菌塊，接種至200mL的 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后，在150rpm，27的條件下振蕩培養(yǎng) 6d，制得一級種子液；
[0043] (III)將步驟（II )制備得到的一級種子液轉(zhuǎn)入50L種子罐培養(yǎng)二級種子液，接種 量為7 %，培養(yǎng)溫度為27°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05?0. 07MPa，通氣量I. 5m3/h (V: V為 1:0. 6)，培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通 氣量為12m3/h，培養(yǎng)3?5d ;
[0044] 步驟（I )所述的斜面固體培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋 白胨 lg，（NH4) 2S042g，MgSO4 · 7H20 lg，KH2PO4Ig,瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 lOOOmL，pH 調(diào)至 6. 5 ；
[0045] 步驟（II )和（III)中用于一級種子液和二級種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng) 基配方為：步驟（1)中所述的云芝液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50g，NH 4N032g， KH2P042g，MgSO4 · 7H20 lg，維生素 B1O. 05g，水 1000mL，pH 6· 5 ;
[0046] 一種云芝多糖提取物，根據(jù)上述制備方法制備得到；
[0047] 所述的云芝胞內(nèi)多糖提取物（IPCV)中總糖、還原糖、蛋白質(zhì)含量分別為 66. 83%?69. 93%，3· 22%?3. 88%，0· 17%?0· 33% ;云芝胞外多糖提取物（EPCV)中總 糖、還原糖、蛋白質(zhì)含量分別為66. 29%?68. 16%，3· 53%?4. 87%，0· 21%?0· 35% ;
[0048] 本發(fā)明制備得到云芝多糖顆粒沖劑具有良好的降血脂作用，顯著降低動脈粥樣硬 化指數(shù)，具有抗動脈粥樣硬化的能力；
[0049] 所述的云芝多糖顆粒沖劑在降血脂藥物與保健食品應(yīng)用中的使用劑量為 2998. 5mg/kg · d (含 200mg/kg · d 云芝多糖提取物）。
[0050] 本發(fā)明以云芝多糖提取物為主要原料，并添加一定的輔料，其中輔料應(yīng)具有良好 的流動性，吸濕性低、易成型，有潤濕性，有利于崩解與溶出，不影響指標(biāo)成分的溶出，不與 指標(biāo)成分相互作用，且不影響療效，以可溶性淀粉、糊精等為輔料效果較好，該顆粒沖劑乳 白色，易溶于水。在外觀、融化性具有良