[0058] 第一歩，將脫細(xì)胞心臟瓣膜和含有原花青素的溶液混合、進(jìn)行交聯(lián)，得到脫細(xì)胞心 臟瓣膜材料a;
[0059] 第二步，將脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a和戊二醛溶液混合、進(jìn)行交聯(lián)，得到共交聯(lián)的脫 細(xì)胞心臟瓣膜材料；
[0060] 第三步，將共交聯(lián)的脫細(xì)胞心臟瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心 臟瓣膜材料。
[0061] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，上述第一歩和第二步使用的含有原花青素的溶液和 戊二醛溶液是在根據(jù)濃度要求分別取用用D-Hanks溶液（pH7. 4)配置成的lOmg/ml的PC原 液，和用D-Hanks溶液（pH7. 4)配置成的0. 625%的GA原液。其中第一歩中使用的含有原 花青素的溶液，以其總體積計(jì)，其中原花青素的濃度為6-8mg/ml;第二步中使用的戊二醛 溶液，以其總體積計(jì)，其中戊二醛的濃度為〇. 1-0. 25%。
[0062] 為了便于說明問題和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述第一歩和第二 步中使用的含有原花青素的溶液(簡稱PC溶液）和戊二醛溶液(簡稱GA溶液）的交聯(lián)濃 度范圍分別為 6mg/mL<PC< 10111g/mL(例如但不限于 6、6. 5、7、7. 5、7. 8 和 8mg/mL)， 0? 1%￡GA逆? 25% (例如但不限于 0? 22%、0. 20%、0. 18%、0. 15%、0. 125% 和 0? 10%);PC和GA濃 度在此范圍內(nèi)按PC濃度自6mg/mL遞升且GA濃度自0. 25%遞減，即它們的組合按下述組成 取用：P2G5 為 2mg/mLPC+0. 5%GA;P4G4 為 4mg/mLPC+0. 37%GA;P5G3 為 5mg/mLPC+0. 32%GA; P6G2 為 6mg/mLPC+0. 25%GA;P8G1 為 8mg/mLPC+0. 125%GA。
[0063] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第一歩和第二步中涉及的交聯(lián)反應(yīng)條件為 10-42°C(更佳地為25-42°C，最佳地為35-38°C)，60-240轉(zhuǎn)/分鐘(更佳地為100-200轉(zhuǎn)/ 分鐘，最佳地為120-150轉(zhuǎn)/分鐘）搖動交聯(lián)。
[0064] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第一步中涉及的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1-96小時(shí)，更佳 地為10-72小時(shí)，最佳地為24小時(shí)。
[0065] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第一歩中脫細(xì)胞心臟瓣膜和含有原花青素的溶液 混合吋，以每片（因屠宰場宰殺的成年豬主動脈心臟瓣膜一般大小3. 0-3. 5_X1. 5-2. 0_， 厚薄基本一致）瓣膜加2mL的PC溶液。
[0066] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第二步中涉及的脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a在第一歩 結(jié)束后經(jīng)過D-Hanks溶液清洗了1-5次，較佳地為2-4次，更佳地為3次。
[0067] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第二步中涉及的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1-24小時(shí)，更佳 地為12-24小時(shí)，最佳地為12小時(shí)。
[0068] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第二步中脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a和戊二醛溶液混 合吋，以每片（因屠宰場宰殺的成年豬主動脈心臟瓣膜一般大小3. 0-3. 5mmXI. 5-2.Omm， 厚薄基本一致）瓣膜加2mL的GA溶液。
[0069] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第三步中所述的混合溫度為1-6 °C，最佳地為 4°C.
[0070] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述第三步中所述的混合時(shí)間為15-40天，更佳地為 25-35天，最佳地為30天。
[0071] 用途
[0072] 本發(fā)明提供的人工生物心臟瓣膜材料可以用作心臟瓣膜或用于制備心臟瓣膜組 織工程移植物。
[0073] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所掲示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所掲示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所掲示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0074] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在干：
[0075] 1、本發(fā)明采用戊二醛與原花青素共交聯(lián)動物心臟瓣膜，使兩種交聯(lián)劑的優(yōu)點(diǎn)互 ネト，從而制備優(yōu)于戊二醛和原花青素単獨(dú)交聯(lián)制備的瓣膜。
[0076] 2、本發(fā)明提供的瓣膜材料減少了戊二醛用量，降低其細(xì)胞毒性。
[0077] 3、本發(fā)明提供的瓣膜材料的穩(wěn)定性、抗血栓性、抗鈣化能力和抗菌性都有很大提 高，保持瓣膜的天然形態(tài)、柔軟性和血液相容性。
[0078] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按 重量計(jì)。
[0079] 本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。
[0080] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0081] 下述實(shí)施例中涉及的性能測定的項(xiàng)目和相應(yīng)的方法如下：
[0082] 形態(tài)學(xué)觀察
[0083] 將未交聯(lián)和交聯(lián)后的脫細(xì)胞豬心臟瓣膜材料樣品經(jīng)如下常規(guī)電鏡制樣方法脫水、 制樣，用掃描電子顯微鏡（SEM)觀察脫細(xì)胞后的豬心臟瓣膜。將未交聯(lián)和交聯(lián)后的脫細(xì)胞 豬心臟瓣膜材料鋪展在干凈的藍(lán)色紙上，使用數(shù)碼相機(jī)拍攝瓣膜材料的直觀形態(tài)。
[0084] 所述的常規(guī)電鏡制樣脫水步驟
[0085] (1)樣品浸入0? 25%戊二醛溶液4小吋；PBS溶液洗三次；
[0086] (2)樣品依次浸泡在系列濃度的乙醇溶液中（乙醇的體積份數(shù)分別為30%，50%， 70%，90%，95%，100%)，各10分鐘，逐步替換樣品中的水分；
[0087] (3)樣品浸入體積分?jǐn)?shù)為50%的六甲基二硅胺烷（HMDS)-乙醇溶液中10分鐘，再 轉(zhuǎn)入純的六甲基二硅胺烷（HMDS)中10分鐘，以逐步替換樣品中的乙醇。
[0088] (4)樣品放入通風(fēng)櫥中干燥過夜；
[0089] (5)觀察之前，將干燥的樣品噴上金粉以增加導(dǎo)電性能。
[0090] 力學(xué)性能：最大抗張強(qiáng)度的測定
[0091] 將未交聯(lián)、GA、P2G5、P4G4、P5G3、P6G2、P8G1、PC各組交聯(lián)的豬心臟瓣膜材料以及 保存在D-Hanks溶液中不同時(shí)間后的豬心臟瓣膜材料，沿膠原纖維的方向剪成寬約4mm，長 約25mm的長條。姆組6個(gè)樣品，經(jīng)SHIMADZU材料力學(xué)測試儀在2mm/min的拉伸速率下測 試張力。最大抗張強(qiáng)度的數(shù)值可從圖中直接讀出。
[0092] 抗鈣化能力測定
[0093] 1.掃描電鏡下能譜測定
[0094] 本發(fā)明主要應(yīng)用模擬體液浸泡各實(shí)驗(yàn)組瓣膜材料后，使其對照組鈣化，通過電鏡 觀察各組瓣膜材料的I丐沉淀-羥基磷灰石（Hydroxyapatite,HA)的狀況。將未交聯(lián)和各 組交聯(lián)的瓣膜材料分別浸泡在SBF中（IOmL/瓣膜)，在37°C恒溫?fù)u床中孵育10天。此后， 取出的瓣膜經(jīng)D-Hanks溶液清洗ー小時(shí)。洗凈后的瓣膜材料剪成4mmX5mm的大小，按前述 方法干燥后電鏡觀察。Ca/P比可用電鏡配套設(shè)備能譜儀分析得出。
[0095] 所述的模擬體液SBF的配制
[0096]將分析純級的CaC12,K2HPO4 ? 3H20,NaCl,KC1,NaHCO3,MgCl2. 6H20,和Na2SO4 按下 列配方精確稱量后溶解在去離子水中，用Tris-HCl調(diào)pH至7. 25。此時(shí)其離子濃度接近人 體的體液。
[0097]SBF的組成與實(shí)際比較如表1所示：
[0098]表I.SBF與Bloodplasma的對比
[0099]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人工生物心臟瓣膜材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟： (1) 將脫細(xì)胞心臟瓣膜和含有原花青素的溶液混合進(jìn)行交聯(lián)，得到脫細(xì)胞心臟瓣膜材 料a ; (2) 將脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a和戊二醛溶液混合進(jìn)行交聯(lián)，得到共交聯(lián)的脫細(xì)胞心臟 瓣膜材料；和 (3) 將共交聯(lián)的脫細(xì)胞心臟瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心臟瓣膜材 料； 以所述含有原花青素的溶液的總體積計(jì)，其中原花青素的濃度為6-8mg/ml ;以所述戊 二醛溶液的總體積計(jì)，其中戊二醛的濃度為0. 1-0. 25%。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的混合在60-240轉(zhuǎn)/分鐘的速度 下進(jìn)行。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)溫度為10_42°C。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的交聯(lián)時(shí)間為1-96小 時(shí)。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中所述的交聯(lián)時(shí)間為1-24小 時(shí)。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述的混合溫度為1-6°C。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述的混合時(shí)間為15-40 天，優(yōu)選為30天。
8. 如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，每克瓣膜濕重加l-10ml D-Hanks溶液，優(yōu)選為3ml。
9. 一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的人工生物心臟瓣膜材料。
10. -種如權(quán)利要求9所述的人工生物心臟瓣膜材料的用途，用作心臟瓣膜或用于制 備心臟瓣膜組織工程移植物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人工生物心臟瓣膜材料及制備方法和用途。所述制備方法包括步驟：（1）將脫細(xì)胞心臟瓣膜和含有原花青素的溶液混合進(jìn)行交聯(lián)，得到脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a；（2）將脫細(xì)胞心臟瓣膜材料a和戊二醛溶液混合進(jìn)行交聯(lián)，得到共交聯(lián)的脫細(xì)胞心臟瓣膜材料；和（3）將共交聯(lián)的脫細(xì)胞心臟瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心臟瓣膜材料；以所述含有原花青素的溶液的總體積計(jì)，其中原花青素的濃度為6-8mg/ml；以所述戊二醛溶液的總體積計(jì)，其中戊二醛的濃度為0.1-0.25%。
【IPC分類】A61L27-36, A61L27-54
【公開號】CN104623732
【申請?zhí)枴緾N201310571743
【發(fā)明人】翟萬銀, 常江
【申請人】中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月13日