蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物活性物制劑及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì) 體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 研宄發(fā)現(xiàn)蠶蛹含有多種活性物質(zhì)，其中蠶蛹蛋白具有抗氧化、降血壓、延緩衰老、 提尚人體免疫力等多種功能。
[0003] 脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)及多肽等產(chǎn)品的載體，能有效提高蛋白質(zhì)及多肽產(chǎn)品的穩(wěn)定 性和活性；且脂質(zhì)體在結(jié)構(gòu)上類似于人體細(xì)胞，對人體細(xì)胞具有高度的親和性，能有效提高 蛋白質(zhì)及多肽產(chǎn)品的膜通透性，易于被組織吸收從而提高生物利用度。
[0004] 蠶蛹抗氧化肽在體內(nèi)易被消化酶解，從而影響其生物活性，而如果將蠶蛹抗氧化 肽制成脂質(zhì)體后，蠶蛹抗氧化肽能被包裹在雙分子層內(nèi)，有效減少蠶蛹抗氧化肽的降解，延 長其在體內(nèi)的循環(huán)作用時間，從而提高其抗氧化的作用。
[0005] 目前，脂質(zhì)體的制備方法包括：注入法、薄膜分散法、超聲波分散法、逆向蒸發(fā)法、 冷凍干燥法。薄膜分散法的步驟為：液態(tài)脂質(zhì)體與含分散劑的水溶液混合、超聲分散后加入 需要包裹的物質(zhì)、反復(fù)凍融、冷凍干燥；其中，凍融溫度為_20°C。例如，CN102793667,小菜 蛾抗菌脂質(zhì)肽及其制備方法和應(yīng)用。但是，采用上述公開的薄膜分散法制備蠶蛹抗氧化肽 脂質(zhì)體時存在以下問題：1.包封率低；2.穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于公開了由上述制備方法制得的蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟： (1) 、制備液態(tài)脂質(zhì)體； (2) 、向液態(tài)脂質(zhì)體中加入含分散劑的水溶液，超聲充分分散后，得空白脂質(zhì)體； (4) 、向空白脂質(zhì)體加入蠶蛹抗氧化肽，置于渦旋儀上震蕩均勻，得混懸液； (5) 、混懸液以5-10°C /min的速度降溫至-40~-45°C后恒溫15min，然后反復(fù)凍融3-4 次；所述凍融：于_80°C恒溫45min后室溫下解凍； (6) 、取凍融處理后的混懸液冷凍干燥，即得蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體凍干品； 脂質(zhì)體與蠶蛹抗氧化肽的質(zhì)量比為（15-25):1 所述含分散劑的水溶液，分散劑在水溶液中的含量為2-10g/100ml。
[0009] 本發(fā)明中，混懸液的凍融處理與之前的凍融處理相比，增加了"以5-10°C /min的 速度降溫至-40~_45°C后恒溫15min"的步驟，且將凍融溫度降低至-80°C。經(jīng)大量實驗 研宄證明，直接凍融會形成大的冰晶破壞雙分子層磷脂膜，影響產(chǎn)品的包封率、穩(wěn)定性和粒 徑；而本發(fā)明通過增加"以5_10°C /min的速度降溫至-40~-45°C后恒溫15min"、同時將 凍融溫度降低至-80°C，則不會形成大的冰晶；進而能有效提高產(chǎn)品的包封率和穩(wěn)定性、降 低粒徑。
[0010] 另外，本發(fā)明嚴(yán)格限定了分散劑的用量；實驗研宄證明，在本發(fā)明的制備方法中， 如果分散劑的用量超出上述范圍，體系將不穩(wěn)定，發(fā)生絮凝；則無法制備出本發(fā)明的產(chǎn)品。 [0011] 上述制備方法，所述"制備液態(tài)脂質(zhì)體"是指：將脂質(zhì)體成膜劑置于燒杯內(nèi)，加入 3-6倍體積的劑溶解，然后加入到圓底燒瓶中，35-50°C水浴加熱減壓旋轉(zhuǎn)干燥至有機溶劑 揮盡。
[0012] 上述制備方法，所述的脂質(zhì)體為氫化大豆卵磷脂、合成二棕櫚酰-DL-α -磷脂酰 膽堿、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)鞘磷脂、膽固醇、十八胺或磷脂酸中的一種或 兩者以上的組合。更優(yōu)選的，其中任意兩種的重量比為（1.5-7) :1。
[0013] 上述制備方法，所述的有機溶劑為氯仿、異丙醇、乙醇和甲醇中的一種或兩者以上 的組合。
[0014] 上述制備方法，步驟（2)所用分散劑是一種在分子內(nèi)同時具有親油性和親水性兩 種相反性質(zhì)的界面活性劑；可均勻分散那些難于溶解于液體的無機，有機顏料的固體顆粒， 同時也能防止固體顆粒的沉降和凝聚，形成安定懸浮液所需的藥劑。優(yōu)選的，分散劑包括甘 露醇、琥珀酸鹽和葡萄糖溶液中的一種或兩者以上的組合；兩者以上的組合為任意比例組 合。
[0015] 上述制備方法，優(yōu)選的，脂質(zhì)體為：氫化大豆卵磷脂和膽固醇；溶劑為氯仿，分散劑 為甘露醇；其中，氫化大豆卵磷脂、膽固醇和蠶蛹抗氧化肽的質(zhì)量比為：1. 05:0. 225:0. 1 ; 甘露醇在其水溶液中的含量為5. 48g/100ml 一種通過上述任意一種技術(shù)方案所述的方法所制備的蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體。
[0016] 蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體對體外血管緊張素誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)氧化損 傷具有明顯的保護作用，具有用量小，毒副作用小，抗氧化活性強的特點。由于蠶蛹抗氧化 肽為肽類物質(zhì)，體內(nèi)易被消化系統(tǒng)內(nèi)的蛋白酶水解使其活性喪失，并且在自然條件下也很 容易失活，因此，本發(fā)明將蠶蛹抗氧化肽制備成脂質(zhì)體通過靜脈注射等非口服途徑給藥。
[0017] 本發(fā)明具有以下有益效果： 產(chǎn)品優(yōu)勢： 1、 脂質(zhì)體可以提高被包裹藥物的穩(wěn)定性，延長抗氧化肽的抗氧化活性； 2、 脂質(zhì)體可以提高抗氧化肽被動靶向性，提高藥物的生物利用度，減少用藥劑量，降低 毒性； 3、 抗氧化肽脂質(zhì)體緩慢釋放，延長腎排泄和代謝，從而延長作用時間； 4、 原料來源豐富，價格低廉，利于擴大化生產(chǎn)和運輸； 制備方法的優(yōu)勢：提高了產(chǎn)品的包封率和穩(wěn)定性，降低了產(chǎn)品的粒徑；另外，方法新 穎，流程操作簡便。
【附圖說明】
[0018] 圖1為蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體（μ g/mL)對AngII損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的 影響。
【具體實施方式】
[0019] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的說 明。
[0020] 實施例1 原料： 氫化大豆卵磷脂I. 05g 膽固醇0. 225g 氯仿 5. 5ml 甘露醇 1.45g 水 25ml 蠶蛹抗氧化肽〇. Ig ; 將甘露醇和水混合，得甘露醇水溶液。將氫化大豆卵磷脂和膽固醇置圓底燒瓶中，加 入氯仿溶解，45°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜；加入 甘露醇水溶液，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化5min后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。（水浴超 聲：在水浴中進行超聲處理；儀器：超聲波恒溫水浴，SCQ-HC600A ;內(nèi)膽尺寸：400*300*180 ; 加熱功率：1500W ;溫度范圍：RT-10 ;精度：0.1 MM ;容量：24L ;電源！220V/50HZ ;超聲波功 率：400W)向空白脂質(zhì)體中加入蠶蛹抗氧化肽，置于渦旋儀上以1000 rpm的轉(zhuǎn)速震蕩90min， 即得脂質(zhì)體混懸液；脂質(zhì)體混懸液放入冰箱中，以5°C /min的速度快速降溫至-45°C， 于-45°C預(yù)凍15min。然后于-80°C平衡45min，后在室溫下解凍（凍融），反復(fù)凍融3-4次。 取凍融處理的混懸液冷凍干燥（冷凍干燥的條件：于真空冷凍干燥機中干燥，-80°C，真空 度8,28小時）后即得蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體凍干品。
[0021] 實施例2 原料： 十八胺Ig 膽固醇0. 158g 乙醇 4. 5ml 琥珀酸鹽2. Ig 水 25ml 蠶蛹抗氧化肽〇. Ig ; 將琥珀酸鹽和水混合，得琥珀酸鹽水溶液。將十八胺和膽固醇置圓底燒瓶中，加入乙醇 溶解，45°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜；加入琥珀酸 鹽水溶液，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化5min后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。（水浴超聲同實 施例1)向空白脂質(zhì)體中加入蠶蛹抗氧化肽，置于渦旋儀上以1000 rpm的轉(zhuǎn)速震蕩90min， 即得脂質(zhì)體混懸液；脂質(zhì)體混懸液放入冰箱中，以l〇°C /min的速度快速降溫至-40°C， 于-40°C預(yù)凍15min，然后于-80°C平衡45min，后在室溫下解凍（凍融），反復(fù)凍融3-4次。 取凍融處理的混懸液冷凍干燥（冷凍干燥的條件：于真空冷凍干燥機中干燥，-80°C，真空 度8,28小時）后即得蠶蛹抗氧化肽脂質(zhì)體凍干