蛋白質(zhì)的體內(nèi)產(chǎn)生的制作方法
【專利說明】蛋白質(zhì)的體內(nèi)產(chǎn)生
[0001 ] 序列表參考
[0002] 本申請連同序列表以電子格式一同提交。名稱為M313SQLST.txt的序列表文件在 2013年3月15日創(chuàng)建并且大小為240, 793字節(jié)。所述序列表的電子格式中的信息以引用 的方式整體并入本文。
[0003] 相關(guān)申請的交叉引用
[0004] 本申請涉及以下各項：2012年12月14日提交的名稱為Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions 的國際 申請?zhí)?PCT/ US2012/069610、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies的美國臨時專利申請?zhí)?1/618,862、2012年8月10提交的名 稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies 的美國臨時專利 申請?zhí)?61/681，645、2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies的美國臨時專利申請?zhí)?1/737, 130、2012年4月2日提交 的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies 的美國臨時 專利申請?zhí)?61/618,866、2012 年 8 月 10 提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies 的美國臨時專利申請?zhí)?61/681，647、2012 年 12 月 14 日 提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies 的美國 臨時專利申請?zhí)?1/737, 134、2012年4月2日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines 的美國臨時專利申請?zhí)?61/618,868、2012 年 8 月 10 提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines 的美國臨 時專利申請?zhí)?1/681，648、2012年12月14日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines 的美國臨時專利申請?zhí)?61/737，135、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and P印tides的美國臨時專利申請?zhí)?1/618, 870、2012年8月10日提交的 名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and P印tides的美國臨時專利申請?zhí)?1/681，649、2012年12月14日提交的名稱 為 Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and P印tides的美國臨時專利申請?zhí)?1/737, 139、2012年4月2日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins 的美國臨時專利申請 號 61/618, 873、2012 年 8 月 10 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/681，650、2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins的美國臨時專利申請?zhí)?1/737, 147、2012年4月2日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins 的美國臨時專 利申請?zhí)?61/618, 878、2012 年 8 月 10 提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/681,654、 2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/737，152、2012年4月 2 日 提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美國臨時專利申請?zhí)?1/618, 885、2012年8月10日提 交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美國臨時專利申請?zhí)?1/681，658、2012年12月14日提 交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins的美國臨時專利申請?zhí)?1/737, 155、2012年4月2日提交的名稱 為 Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins的美國臨時專利申請?zhí)?1/618, 896、2012年7月5日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins 的 美國臨時專利申請?zhí)?1/668, 157、2012年8月10提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins 的美國臨時專利 申請?zhí)?61/681，661、2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins 的美國臨時專利申請 號 61/737, 160、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/618,911、2012年8月 10提交 的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins 的美國 臨時專利申請?zhí)?1/681，667、2012年12月14日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/737, 168、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins 的美 國臨時專利申請?zhí)?1/618, 922、2012年8月10日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins 的美國臨時專利申請?zhí)?61/681，675、2012 年 12 月 14 日 提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins 的美國臨時 專利申請?zhí)?61/737，174、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的美國臨時專利申請?zhí)?61/618, 935、2012年8月 10提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的美國臨時專利申請?zhí)?61/681，687、 2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的美國臨時專利申請?zhí)?61/737, 184、2012 年 4 月 2 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的美國臨時專利申請?zhí)?61/618, 945、2012 年 8 月 10 日提 交的名稱為 Modif ied Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美國臨時專利申請?zhí)?1/681，696、2012年12月14日提交的 名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美國臨時專利申請?zhí)?1/737，191、2012年4月2日提交的名稱 為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美國臨時專利申請?zhí)?1/618,953、2012年8月10日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease的美國臨時專利申請?zhí)?1/681，704、2012年12月14日提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的美國臨時專利申請?zhí)?1/737, 203、美國臨時專利申請?zhí)?1/753, 661、2012年4月2日 提交的名稱為Dosing Methods for Modified mRNA的美國臨時專利申請?zhí)?1/618, 961、 2012年5月17日提交的名稱為Dosing Methods for Modified mRNA的美國臨時專利申 請?zhí)?61/648,286、2013年3月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Biologies and Proteins Associated with Human Disease 的國際申請 號 PCT/US2013/030062、2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucloetides 的國 際申請?zhí)?PCT/US2013/030063、名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins的國際申請?zhí)朠CT/US2013/030064、2013年3月9日提交的名稱 為 Modified Polynucleotides for theProduction of Membrane Proteins 的國際申 請?zhí)?PCT/US2013/030059、2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins 的國際申請?zhí)?PCT/ US2013/030066、2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins 的國際申請?zhí)?PCT/US2013/030067、2013 年 3 月 9 日 提交的名稱為Modified Polynucleotides for the Production of Proteins 的國際 申請?zhí)?PCT/US2013/030060、2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease 的國際申請?zhí)?PCT/ US2013/030061、2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides 的國際申請?zhí)朠CT/US2013/030068 和 2013 年 3 月 9 日提交的名稱為 Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides 的國際申請?zhí)?PCT/US2013/030070,所述申請 各自的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
[0005] 本申請還涉及2012年10月3日提交的名稱為Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof 的國際公布號 PCT/ US2012/58519 和 2012 年 12 月 14 日提交的名稱為 Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions的國際公布號PCT/US2012/69610,所述申請各自的內(nèi)容以引 用的方式整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及用于設(shè)計、制備、制造和/或配制多核苷酸、初級構(gòu)建體以及修飾mRNA 分子（_RNA)的組合物、方法、過程、試劑盒以及裝置。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 影響蛋白質(zhì)表達(dá)的現(xiàn)有方法論存在多種問題。例如，引入的DNA可在一些頻率下 整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組DNA的改變和/或損傷?；蛘撸?入到細(xì)胞中的異源脫氧核糖核酸（DNA)可由子代細(xì)胞（無論異源DNA是否整合到染色體 中）或由后代繼承。此外，假設(shè)適當(dāng)遞送并且無損傷或整合到宿主基因組中，那么在制成編 碼的蛋白質(zhì)之前必須發(fā)生多個步驟。一旦在細(xì)胞內(nèi)部，DNA必須被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，在細(xì)胞 核中它被轉(zhuǎn)錄成RNA。從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA然后必須進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中它被翻譯成蛋白 質(zhì)。從施用的DNA至蛋白質(zhì)的多個加工步驟不僅在產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)之前形成延遲時間， 而且每個步驟還意味著誤差和對細(xì)胞造成損傷的機(jī)會。此外，已知難以在細(xì)胞中獲得DNA 表達(dá)，因為DNA頻繁進(jìn)入細(xì)胞但不表達(dá)或不以合理的速率或濃度表達(dá)。當(dāng)將DNA引入到原 代細(xì)胞或修飾細(xì)胞系中時，這尤其成問題。
[0009] 在二十世紀(jì)90年代初期，Bloom和同事通過將體外轉(zhuǎn)錄的加壓素（vasopressin) mRNA注射至下丘腦中成功地拯救了加壓素缺陷的大鼠 （Science 255:996 - 998 ;1992)。然 而，低翻譯水平和分子的免疫原性阻礙mRNA作為治療劑的發(fā)展，并且自其之后的工作一直 集中于可相反采用這些缺陷的替代應(yīng)用，即用編碼癌癥抗原的mRNA進(jìn)行免疫。
[0010] 其他人研宄了使用mRNA來遞送目標(biāo)多肽并且顯示mRNA分子的某些化學(xué)修飾、特 別是假尿苷和5-甲基-胞嘧啶降低了免疫刺激作用。
[0011] 這些研宄在以下中公開：例如Ribostem Limited于2003年7月9日提交（現(xiàn) 已放棄）的英國專利申請序號0316089. 2、2004年7月9日提交的公布為W02005005622 的PCT申請?zhí)朠CT/GB2004/002981、2006年6月8日提交的公布為US20060247195 (現(xiàn) 已放棄）的美國專利申請國家階段進(jìn)入序號10/563,897、以及2004年7月9日提交的 公布為EP1646714(現(xiàn)已撤回）的歐洲專利申請國家階段進(jìn)入序號EP2004743322中； Novozymes, Inc.于2007年12月19日提交的公布為W02008140615的PCT申請?zhí)朠CT/ US2007/88060、2009年7月2日提交的公布為US20100028943的美國專利申請國家階段 進(jìn)入序號12/520, 072、以及2009年7月7日提交的公布為EP2104739的歐洲專利申請國 家階段進(jìn)入序號EP2007874376中；羅徹斯特大學(xué)（University of Rochester)于2006 年12月4日提交的公布為W02007064952的PCT申請?zhí)朠CT/US2006/46120和2006年12 月1日提交的公布為US20070141030的美國專利申請序號11/606,995中；BioNTech AG 在2007年12月14日提交（現(xiàn)已放棄）的歐洲專利申請序號EP2007024312、2008年12 月12日提交的公布為W02009077134的PCT申請?zhí)朠CT/EP2008/01059、2010年6月2日 提交的公布為EP2240572的歐洲專利申請國家階段進(jìn)入序號EP2008861423、2010年11月 24日提交的公布為US20110065103的美國專利申請國家階段進(jìn)入序號12/，735,060、2005 年9月28日提交的德國專利申請序號DE 10 2005 046 490、2006年9月28日提交的公 布為W02007036366的PCT申請PCT/EP2006/0448、2012年3月21日公布的國家階段歐 洲專利EP1934345和2009年8月14日提交的公布為20100129877的國家階段美國專利 申請序號11/992, 638;免疫疾病研宄所有限公司（Immune Disease Institute Inc.)于 2011年4月15日提交的公布為US20120046346的美國專利申請序號13/088, 009和2011 年 4 月 15 日提交的公布為 W020110130624 的 PCT 申請 PCT/US2011/32679;Shire Human Genetic Therapeutics于2010年11月20日提交的公布為US20110244026的美國專利申 請序號12/957,340中；Sequitur Inc.于1998年9月18日提交的公布為W01999014346 的 PCT 申請 PCT/US1998/019492 中；The Scripps Research Institute 于 2010 年 2 月 24日提交的公布為W02010098861的PCT申請?zhí)朠CT/US2010/00567和2011年11月 3日提交的公布為US20120053333的美國專利申請國家階段進(jìn)入序號13/203,229中； Ludwig-Maximillians University 于 2010 年 7 月 30 日提交的公布為 W02011012316 的 PCT 申請?zhí)?PCT/EP2010/004681 中；Cellscript Inc.于 2008 年 6 月 30 日提交并且 2011 年10月18日授權(quán)的美國專利號8, 039, 214、美國專利申請序號2010年12月7日提交的 公布為 US20110143436 的 12/962, 498、2010 年 12 月 7 日提交的公布為 US20110143397 的 12/962, 468、2011 年 9 月 20 日提交的公布為 US20120009649 的 13/237, 451 以及 PCT 申請 2010年12月7日提交的公布為TO2011071931的PCT/US2010/59305和2010年12月7日 提交的公布為 W02011071936 的 PCT/US2010/59317 中；The Trustees of the University of Pennsylvania于2006年8月21日提交的公布為W02007024708的PCT申請?zhí)朠CT/ US2006/32372和2009年3月27日提交的公布為US20090286852的美國專利申請國家階 段進(jìn)入序號11/990,646中；Curevac GMBH于德國專利申請序號2001年6月5日提交的 DElO 2001 027 283. 9、2001 年 12 月 19 日提交的 DElO 2001 062 480. 8 以及 2006 年 10 月31日提交的DE 20 2006 051 516(都已放棄）、歐洲專利號2005年3月30日授權(quán)的 EP1392341和2008年1月2日授權(quán)的EP1458410、PCT申請?zhí)?002年6月5日提交的公布 為 TO2002098443 的 PCT/EP2002/06180、2002 年 12 月 19 日提交的公布為 W02003051401 的 PCT/EP2002/14577、2007 年 12 月 31 日提交的公布為 TO2008052770 的 PCT/EP2007/09469、 2008 年 4 月 16 日提交的公布為 TO2009127230 的 PCT/EP2008/03033、2005 年 5 月 19 日提交的公布為W02006122828的PCT/EP2006/004784、2007年1月9日提交的公布為 W02008083949的PCT/EP2008/00081、以及美國專利申請序號2003年12月5日提交的公 布為舊20050032730的10/729,830、2004年6月18日提交的公布為舊20050059624的 10/870, 1KK2008 年 7 月 7 日提交的公布為 US20080267873 的 11/914, 945、2009 年 10 月 27日提交的公布為舊2010047261(現(xiàn)已放棄）的12/446,912、2010年1月4日提交的公 布為 US20100189729 的 12/522, 214、2010 年 5 月 26 日提交的公布為 US20110077287 的 12/787, 566、2010 年 5 月 26 日提交的公布為 US20100239608 的 12/787, 755、2011 年 7 月 18日提交的公布為US20110269950的13/185, 119以及2011年5月12日提交的公布為 US20110311472的13/106, 548中，所述專利都以引用的方式整體并入本文。
[0012] 盡管存在被限制于包括假尿苷和5-甲基-胞嘧啶的化學(xué)修飾的選擇的這些報道， 但本領(lǐng)域中仍然需要用于解決圍繞細(xì)胞內(nèi)翻譯的有效調(diào)節(jié)和編碼多肽或其片段的核酸的 加工的大量障礙的治療方式。
[0013] 為此，本發(fā)明人已證實某些修飾mRNA序列具有作為益處超過僅逃避、避免或減弱 免疫應(yīng)答的治療劑的潛力。這類研宄詳細(xì)描述于公布的共同未決申請國際申請2011年8 月 5 日提交的 PCT/US2011/046861 和 2011 年 10 月 3 日提交的 PCT/US2011/054636、2011 年10月3日提交的國際申請?zhí)朠CT/US2011/054617中，所述申請的內(nèi)容以引用的方式整體 并入本文。
[0014] 本發(fā)明通過提供基于核酸的化合物或多核苷酸來解決這種需要，所述多核苷酸編 碼目標(biāo)多肽（例如，修飾HiRNA或mmRNA)并且具有避免本領(lǐng)域中的一個或多個問題的結(jié)構(gòu) 和/或化學(xué)特征，例如適用于優(yōu)化基于核酸的治療劑的配制和遞送且同時保持結(jié)構(gòu)和功能 完整性、克服表達(dá)的閾值、改進(jìn)表