長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3) 重組蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] C型凝集素是一類重要的模式識(shí)別受體，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。糖類 識(shí)別結(jié)構(gòu)域（CRD)是C型凝集素的重要功能區(qū)域，以鈣離子依賴的形式識(shí)別并結(jié)合糖蛋白。 典型的CRD通常由大約130個(gè)氨基酸組成，呈長(zhǎng)形雙環(huán)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)上部由4個(gè)0片層 構(gòu)成，下部則包含兩個(gè)a螺旋和四個(gè)0片層。四個(gè)保守的Cys(Cl-C4)形成環(huán)基部的兩 個(gè)二硫鍵。經(jīng)研宄表明，C型凝集素在固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中不僅作為模式識(shí)別分子參與識(shí) 別并結(jié)合入侵病原，同時(shí)也可作為效應(yīng)分子在清除病原微生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如C 型凝集素能抑制微生物生長(zhǎng)，破壞微生物細(xì)胞壁，促進(jìn)吞噬、結(jié)節(jié)形成及激活補(bǔ)體。C型凝集 素的抑菌活性首先在小鼠中被發(fā)現(xiàn)，隨后在文昌魚、小龍蝦中也有類似報(bào)道。
[0003] 長(zhǎng)牡蠣是世界上重要的養(yǎng)殖貝類之一，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中占據(jù)重要地位。 長(zhǎng)牡蠣常棲息在潮間帶及淺海的巖礁海底，時(shí)刻面臨各種病原微生物的侵襲。近年來(lái)，頻繁 爆發(fā)的養(yǎng)殖牡蠣大規(guī)模死亡事件造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。作為缺乏獲得性免疫的無(wú)脊椎動(dòng) 物，識(shí)別并清除有害非己成分的能力顯得尤為重要。因此，牡蠣C型凝集素功能的研宄可為 養(yǎng)殖牡蠣的病害防治提供支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明在于提供一種長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 一種長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，長(zhǎng)牡蠣C型凝集 素-3 (CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。
[0007] 所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備抑制抗大腸桿菌或金 黃色葡萄球菌的抑菌劑。
[0008] 所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備破壞金黃色葡萄球菌 細(xì)胞的制劑。
[0009] 所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白是在CgCLec-3開(kāi)放閱讀框的兩端 分別設(shè)計(jì)含有限制性酶切位點(diǎn)的引物（序列為5' -CGCGGATCCATGGGTGCCAACTCCATTG-3'和 5' -CCCAAGCTITTAITGCGTGITCCTCTCGC-3'），以pET-32a原核表達(dá)載體為重組載體模板，而 后通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得編碼區(qū)基因，并將其克隆到pET-32a表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大 腸桿菌Transetta(DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表達(dá)。
[0010] 所述重組產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠柱純化，透析復(fù)性。
[0011] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)蛋白，所得 長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)，具有非典型CRD，只包含四個(gè)e片層組成，且只有一個(gè)二 硫鍵。本發(fā)明重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌有抑制生 長(zhǎng)作用且對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞有破壞作用，在開(kāi)發(fā)抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼 料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的長(zhǎng)牡蠣重組蛋白CgCLec-3對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)的影響。
[0014] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的長(zhǎng)牡蠣重組蛋白CgCLec-3對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng) 的影響。
[0015] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的長(zhǎng)牡蠣重組蛋白CgCLec-3對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞的 破壞。
【具體實(shí)施方式】：
[0016] 下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)基因編碼區(qū)的體外原核重組表達(dá)
[0019] 1、重組載體的構(gòu)建
[0020] 本發(fā)明以pET_32a原核表達(dá)載體為重組載體模板。通過(guò)PCR技術(shù)，采用5'末端分 別添加了BamHI和HindIII特定酶切位點(diǎn)的基因特異性引物：
[0021] Pl(5, -CGCGGATCCATGGGTGCCAACTCCATTG-3,）：
[0022] P2(5'-CCCAAGCTTTTATTGCGTGTTCCTCTCGC-3'），
[0023] 反應(yīng)條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94°C變性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸45秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增片段純化回收， 與PMD19-T載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒；使用BamHI和HindIII兩個(gè)酶酶切 質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收； 回收目的片段與經(jīng)BamHI和HindIII兩個(gè)酶酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，完成載體的構(gòu) 建。上述實(shí)驗(yàn)操作的具體方法請(qǐng)參照《分子克隆第三版》。
[0024] 2、重組蛋白的表達(dá)
[0025] 將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌Transetta(DE3)中，并篩選陽(yáng)性 克隆，測(cè)序確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于200mL的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm， 37°C培養(yǎng)至OD600 = 0. 4-0. 8。加入IPTG，使終濃度達(dá)到lmmolL'繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4°C， 5000rpm，離心10分鐘，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離心，棄去上清后，加入 80yL水和20yL的5倍的蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘，稍離心，利用SDS-PAGE檢 測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。
[0026] 3、重組蛋白CgCLec-3的純化與復(fù)性
[0027] 本發(fā)明中重組蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF柱純化，獲得的變性重組蛋白采用透析 緩沖液透析復(fù)性。具體操作步驟如下：
[0028] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱（I. 6X20cm)，柱床體積為IOmL;
[0029] (2)用緩沖液I(50mmolL-1Tris-Hcl緩沖液，pH= 7. 4, 50mmolL-1NaCl, 8molI71 尿素）平衡2-5個(gè)床體積，流速為2mLmirT1;
[0030] (3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用緩沖液I重懸，150瓦超聲破碎30分鐘，12000轉(zhuǎn)， 4°C離心30分鐘，上清液用0. 45ym濾膜過(guò)濾后，過(guò)柱，流速為ImLmirT1;
[0031] (4)用緩沖液1再洗2-5個(gè)床體積，流速為2mLmirT1;
[0032] (5)用有50mmolT1咪唑的緩沖液I再洗2-5個(gè)柱床體積，流速為2mLmin
[0033] (6)用400mmolI71咪唑的緩沖液I洗脫目的蛋白，收集。
[0034] (7)用SDS-PAGE檢測(cè)獲得的蛋白分子量和純度；
[0035] (8)變性純化產(chǎn)物采用不同濃度尿素的透析液進(jìn)行復(fù)性（透析液含2mM還原谷胱 甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、ImMEDTA、50mMTris-HClUOOmMNaCl、10%甘油、1%甘氨酸， 口117.5~8.0，尿素濃度從起始的611逐漸替換到411、311、211、說(shuō)、(^最后一次透析1^8緩沖 液中（50mMTris-HCl，IOOmMNaCl，pH7. 5 ~8. 0)。每次在 4°C透析 12h，用SDS-PAGE檢測(cè) 復(fù)性后蛋白分子量和純度，確認(rèn)得到長(zhǎng)牡蠣CgCLec-3基因重組蛋白。
[0036] 實(shí)施例2 :
[0037] 長(zhǎng)牡蠣CgCLec-3重組蛋白的抑菌活性檢測(cè)
[0038] 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別用LB培養(yǎng)基37°C，220rpm，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 所得菌體分別經(jīng)離心收集后用TBS(50mMTris-Hcl，IOOmMNaCl，pH= 8. 0)進(jìn)行洗滌并重 懸至濃度l〇4CFU。
[0039] 將上述或得到的50yL的長(zhǎng)牡嫩重組蛋白CgCLec-3 (2mgml/1或者4mg與等 體積的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌重懸液在CaCl2終濃度IOmM的條件下室溫孵育2h。取 20yL上述混合物于平底96孔板（Costar，F(xiàn)isher)中，每孔加入200yLLB液體培養(yǎng)基， 于酶標(biāo)儀中37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih分別檢測(cè)記錄各孔0D600值。另設(shè)rTrx蛋白對(duì)照組和 TBS空白對(duì)照組。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，根據(jù)3次測(cè)定結(jié)果取平均值作圖（參見(jiàn)圖1和圖 2)。實(shí)驗(yàn)表明濃度為4mgml/1的重組CgCLec-3蛋白能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 的生長(zhǎng)；CgCLec-3蛋白濃度為2mgml/1時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制作用不 顯著。
[0040] 實(shí)施例3 :
[0041] 重組蛋白CgCLec-3對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞的破壞作用的測(cè)定
[0042] 將上述實(shí)施例2中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌離心收集后用TBS清洗重 懸（IO4CFU)。同時(shí)將上述獲得50yL的長(zhǎng)牡蠣重組蛋白CgCLec-3 (4mgml/1)與等體積金黃 色葡萄球菌重懸液在CaCl2終濃度IOmM的條件下室溫孵育2h。設(shè)立TBS空白對(duì)照和rTrx 陰性對(duì)照。將孵育后的菌徹底清洗后離心收集。用2. 5%戊二醛于4°C固定24h后，將菌 用TBS徹底清洗并重懸于TBS中，滴于24X24mm蓋玻片上。在2. 5%戊二醛中固定Ih后， 將蓋玻片在TBS中漂洗lOmin，再用乙酸戊酯清洗30min。梯度酒精脫水后，烘干樣品并鍍 金。該樣品在KYKY-2800B掃描電鏡下觀察拍照（KYKY，Beijing，China)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重 組CgCLec-3蛋白能夠破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞（參見(jiàn)圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：長(zhǎng)牡蠣C型凝 集素-3(CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。2. 按權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備抑制抗大腸桿菌或金黃色葡 萄球菌的抑菌劑。3. 按權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞的 制劑。4. 按權(quán)利要求1、2或3所述的長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特 征在于：所述長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白是在CgCLec-3開(kāi)放閱讀框的兩端 分別設(shè)計(jì)含有限制性酶切位點(diǎn)的引物，而后通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得編碼區(qū)基因，并將其克隆到 pET-32a表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌Transetta (DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表 達(dá)。5. 按權(quán)利要求4所述的長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述重組產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠柱純化，透析復(fù)性。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用。長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)蛋白，所得長(zhǎng)牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)，具有非典型CRD，只包含四個(gè)β片層組成，且只有一個(gè)二硫鍵。本發(fā)明重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌有抑制生長(zhǎng)作用且對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞有破壞作用，在開(kāi)發(fā)抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】A61K38/57, A61P31/04
【公開(kāi)號(hào)】CN104888205
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510333344
【發(fā)明人】宋林生, 李慧, 張峘, 劉瑞, 賈志浩, 王玲玲
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月16日