一種通過自由基攻擊微小rna造成rna氧化損傷的方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過自由基攻擊微小RNA造成RNA氧化損傷的方法，屬于生物應 用技術領域。
【背景技術】：
[0002] 目前，氧化應激（oxidativestress)狀態(tài)下細胞凋亡的分子機制是自由基和氧化 損傷學說的核心問題。非編碼的小核苷酸分子--微小RNA(microRNA，miRNA)是近幾年新 發(fā)現(xiàn)的一類長約22nt(19-25nt)在進化方面屬保守的非編碼RNA，這種小分子RNA通過互 補配對原則作用于mRNA，由此影響蛋白翻譯過程引起基因沉默，其作用體現(xiàn)為在轉(zhuǎn)錄后水 平對基因表達進行調(diào)控。目前，越來越多的證據(jù)表明miRNA在多種生物學進程中的關鍵作 用，并且miRNA已經(jīng)成為生命科學研宄的重要工具和多種疾病治療的新手段。研宄表明RNA 比DNA和蛋白質(zhì)更容易受到活性氧簇（R0S)的攻擊，氧化修飾的RNA在生物體中廣泛存在。 活性氧簇（R0S)能夠?qū)NA分子中的鳥嘌呤氧化修飾成為羥基鳥嘌呤（8-0HG)。目前許多 研宄表明氧化修飾后的信使RNA分子對細胞的各種功能有重大影響，但是微小RNA氧化修 飾的研宄還十分有限。目前還沒有對miRNA進行有效氧化修飾方法的報道，在體外或體內(nèi)， R0S的攻擊能夠?qū)е挛⑿NA發(fā)生鳥嘌呤特異的氧化修飾，對開發(fā)核酸藥物具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種通過自由基攻擊微小RNA造成 RNA氧化損傷的方法，確定在氧化應激狀態(tài)下miRNA發(fā)生氧化損傷并產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤。
[0004] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明方法是在氧化應激狀態(tài)下通過氧化鳥嘌呤8位碳 產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤而使微小RNA發(fā)生氧化損傷，損傷方式選自以下4種的一種或幾種：1)用 Fenton試劑氧化體系氧化損傷微小RNA;2)用H202處理誘導細胞凋亡的過程中氧化損傷微 小RNA;3)在鐵超載誘導的心肌損傷動物模型中氧化損傷微小RNA;4)在心肌缺血-再灌注 損傷動物模型中氧化損傷微小RNA;所述Fenton試劑氧化體系是由Cu+或Fe2+與H202組成 的；Cu+/Fe2+的濃度分別為0. 5mM，H202的濃度為0.l-2mM;或者Fenton試劑氧化體系是將 Fe3+或Cu2+分別與抗壞血酸（Asc)和H202在磷酸鹽緩沖液中混合制備的；所述用H202處理 誘導心肌細胞凋亡的過程中，H202的濃度優(yōu)選為0. 4-lmM;用H202處理誘導心肌細胞凋亡的 時間為1-6小時；其中所述鐵超載誘導的心肌損傷動物模型是通過向動物腹腔注射右旋糖 酐鐵而建立的；所述右旋糖酐鐵的注射劑量為12mg/日，連續(xù)注射5日；所述方法還包括純 化被氧化損傷的微小RNA的步驟；所述純化被氧化損傷的微小RNA是通過免疫沉淀反應進 行的，所述免疫沉淀反應中的抗體為抗8-氧鳥嗓呤抗體；純化既是篩選氧化修飾miRNA所 需的，也是鑒定氧化修飾miRNA所需的。
[0005] 本發(fā)明通過上述方法氧化損傷的微小RNA選自rno-miR-184、rn〇-miR-21*、 rno-miR-lSSa*、rno_miR_139_3p、rno-miR-SOc-S*、rno_miR_290、rno_miR_29a、 rno-miR-SSajno-miR-SKrno-miR-SCM* 和rn〇-miR_106b中的一種或多種，其序列如序列 表中SEQIDNO:1-11所示：
[0006]rn〇-miR-184(5' -uggacggagaacugauaagggu-3' (SEQIDNO:1))
[0007]rn〇-miR-21*(5' -caacagcagucgaugggcuguc-3' （SEQIDNO:2))
[0008]rn〇-miR_135a*(5' -uguagggauggaagccaugaaa-3' (SEQIDNO:3))
[0009]rn〇-miR-139_3p(5'-uggagacgcggcccuguuggag-3'（SEQIDNO: 4))
[0010]rn〇-miR-30c_2*(5'-cugggagaaggcuguuuacucu-3'（SEQIDNO:5))
[0011]rn〇-miR-290 (5'-cucaaacuaugggggcacuuuuu-3' (SEQIDNO: 6))
[0012] rn〇-miR_29a(5' -uagcaccaucugaaaucgguua-3' （SEQIDNO:7))
[0013]rn〇-miR_23a(5' -aucacauugccagggauuucc-3' （SEQIDNO:8))
[0014]rn〇-miR-21(5' -uagcuuaucagacugauguuga-3' （SEQIDNO:9))
[0015]rn〇-miR-204*(5' -gcugggaaggcaaagggacguu-3' （SEQIDNO:10))
[0016]rn〇-miR_106b(5' -uaaagugcugacagugcagau-3' （SEQIDNO:11))
[0017] 本發(fā)明在體外的Fenton試劑氧化體系的細胞水平的H202誘導心肌細胞凋亡過程， 以及鐵超載和心肌缺血-再灌注誘導心肌損傷動物模型中，miRNA發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生8-氧 鳥嘌呤；其特征如下：
[0018] l)miRNA在Cu+/Fe2+與H202構(gòu)成Fenton試劑氧化體系中發(fā)生氧化損傷，S卩鳥嗓呤 8位碳被氧化產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤，而單獨以Fe37AsC或H202處理，不會造成miRNA氧化損傷； 證實Fenton試劑氧化體系產(chǎn)生的? 0H自由基是miRNA氧化損傷反應所必需的；
[0019] 2)在H202誘導心肌H9c2細胞凋亡過程中miRNA發(fā)生氧化損傷，并且在0-lmM H202處理濃度范圍內(nèi)，H9c2細胞的miRNA氧化損傷程度與H202處理呈劑量依賴性關系；以 0. 4nMH202處理H9c2細胞，細胞內(nèi)miRNA氧化損傷程度與H202處理呈時間依賴性關系；
[0020] 3)采用鐵超載和心肌缺血-再灌注誘導心肌損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)與活性氧和細胞 凋亡檢測結(jié)果一致，鐵超載組小鼠各器官miRNA樣品中8-氧鳥嘌呤含量與安慰劑組比較均 明顯升高，缺血-再灌注組小鼠心臟危險區(qū)miRNA樣品中8-氧鳥嘌呤含量與假手術組比較 也明顯升高；
[0021] 本發(fā)明確定了 H202誘導心肌細胞凋亡過程中發(fā)生氧化損傷的miRNA亞型種類，通 過對氧化損傷miRNA在心肌細胞中生成與降解，定位特性，與其他生物大分子協(xié)同作用以 及氧化損傷miRNA調(diào)控基因表達功能差異，有助于了解在氧化應激狀態(tài)下細胞凋亡及壞死 等生理病理過程的分子機制，將其作為氧化應激細胞凋亡模型。
[0022] 本發(fā)明確定了氧化損傷的miRNA中miR-184和oxi-miR-184差異調(diào)芐基因，采用 大鼠全基因組表達譜芯片分析，最終確證過表達miR-184會使33個基因在mRNA水平發(fā)生 顯著變化，而過表達oxi-miR-184會使66個基因在mRNA水平發(fā)生顯著變化；差異調(diào)芐基 因包括BCL2L1和BCL2L2 ;BCL2L1和BCL2L2同屬細胞凋亡抑制基因Bcl-2家族，所編碼蛋 白產(chǎn)物分別為Bcl-xL和Bcl-w，Bcl-2家族成員通常以二聚體的形式發(fā)揮作用，Bcl-xL和 Bcl-w具有對抗細胞凋亡的功能，兩者說明伴隨miRNA在氧化應激狀態(tài)下發(fā)生氧化損傷，其 調(diào)節(jié)細胞中基因表達水平的功能也發(fā)生改變，出現(xiàn)差異調(diào)芐基因；其工藝過程簡單，原理可 靠，損傷效果明顯，應用范圍廣泛，應用環(huán)境友好。
【附圖說明】：
[0023] 圖1為HPLC-UV/MS檢測miRNA樣品中的8-氧鳥嘌呤，其中a為8-氧鳥嘌呤標準 品；b為雙鏈miRNAhas-let-7a_l對照；c為鐵（Fe3+)和抗壞血酸（Asc)處理組；d為H202 處理組；e為Fe3+/Asc+H202處理組；f為Cu2+/Asc+H202處理組。
[0024] 圖2為H202誘導心肌H9c2細胞凋亡過程中miRNA氧化損傷，其中a為以0-200yM 的不同濃度H202處理H9c2細胞，NorthwesternBlot分析8-氧鳥嘌呤含量變化結(jié)果；b為 采用DCF熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧變化結(jié)果；c為以0. 4mM濃度的H202處理H9c2細胞 0-6h，取不同時間點檢測miRNA中8-氧鳥嘌呤含量的結(jié)果；d為細胞內(nèi)活性氧變化結(jié)果。
[0025] 圖3為鐵超載誘導心肌損傷模型中miRNA的氧化損傷，其中a為鐵超載誘導心肌 損傷模型的建立；b為小鼠心臟左心室細胞活性氧水平；c為小鼠心臟左心室細胞凋亡水 平；d為Northwestern Blot分析小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦各器官miRNA中8-氧鳥嗓呤含 量的結(jié)果。
[0026] 圖4為心肌缺血-再灌注損傷模型中miRNA的氧化損傷，其中a為心肌缺血-再 灌注損傷模型的建立；b為小鼠心臟邊界區(qū)細胞活性氧水平；c為小鼠心臟邊界區(qū)細胞凋亡 水平；d為Northwestern Blot分析小鼠心臟危險區(qū)和非危險區(qū)miRNA中8-氧鳥嗓呤含量 的結(jié)果。
[0027] 圖5為芯片檢測氧化miRNA，其中a為NorthwesternBlot鑒定免疫沉淀法純化得 到的氧化miRNA的結(jié)果；b為芯片檢測氧化miRNA的結(jié)果；c為利用qRT-PCR方法驗證芯片 的結(jié)果。
[0028] 圖6為大鼠全基因組表達譜芯片篩選得到過表達miR-184和過表達oxi-miR-184 的差異調(diào)芐基因。
【具體實施方式】：
[0029] 下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步闡述。
[0030] 實施例1 :Fent〇n試劑氧化體系造成miRNA氧化損傷，產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤
[0031] 本實施例的Cu+/Fe2+與H202構(gòu)成Fenton試劑氧化體系具有極強的氧化能力，是 生物體產(chǎn)生? 0H(羥基自由基）的主要反應；應用該反應體系體外氧化化學合成的雙鏈 miRNA(80yg)與0. 5mM檸檬酸鐵（Fe3+)或硫酸銅（Cu2+)，5mM抗壞血酸（Asc)和2mMH202，在 10禮他1^04/似2冊04緩沖液&117.4)體系中，371：孵育111。孵育結(jié)束后，加入1(^11001111 甲磺酸去鐵胺（鐵離子清除劑）或雙環(huán)己酮草酰二腙（銅離子清除劑）以終止反應。在上 述溶液中加入1/10體積的3MNaAc，1/10體積的1yg/ml糖原和2. 5倍體積的乙醇，-20°C 沉淀miRNA。上述沉淀得到的miRNA樣品中加入10y1核酸酶P1 (可購自Promega, 0? 4U/ U1 儲存于 300mMNaAc和 0? 2mMZnCl2,pH5. 3, -20°C凍存），37°C孵育 2h，再補加 5y1 堿 性磷酸酶（可購自？1'〇11^3，川/^1)，501：孵育60111111;200(^離心108。100^1酶解產(chǎn)物 轉(zhuǎn)移至Micropure-EZfilter(可購自Millipore)，0°C，14000g離心 2min以去除蛋白。離 心得到的清液，如所述進行HPLC-UV/MS分析。
[0032] 本實施例的結(jié)果證實，在Cu+/Fe2+與H202構(gòu)成Fenton試劑氧化體系中，miRNA發(fā)生 氧化損傷，即鳥嘌呤8位碳被氧化產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤（圖le和圖If)，而Fe37Asc組與H202 組，因不能產(chǎn)生? 0H，故不造成miRNA氧化損傷（圖lc和圖Id)。
[0033] 實施例2 :H202誘導心肌H9c2細胞凋亡過程中miRNA氧化損傷，產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤
[0034] 本實施例為檢測H202誘導心肌H9c2細胞（其可得自AmericanTypeCulture Collection)凋亡過程中miRNA氧化損傷程度；分別以0-200yM的不同濃度H202處理 H9c2細胞，3h后收集細胞進行活性氧（Reactiveoxygenspecies,R0S)檢測（其可得 自Invitrogen)，并采用flashPAGE?分餾器系統(tǒng)（Ambion，Inc)提取miRNA，如所述進行 NorthwesternBlot分析，結(jié)果見圖2a和圖2b。
[0035] 本