結(jié)核分枝桿菌Wag31基因的免疫功能用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及結(jié)核分枝桿菌基因Wag31其免疫功能應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是人類(lèi)健康的嚴(yán)重威脅,近年來(lái)，中國(guó)結(jié)核分枝桿菌感染形式不容樂(lè)觀，有愈演愈烈的趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，可侵入巨噬細(xì)胞并長(zhǎng)期存活，導(dǎo)致結(jié)核病。
[0003]結(jié)核病疫苗是結(jié)核病防控的重中之重。
[0004]BCG菌株是bacillus Calmette_Gu6rin的簡(jiǎn)稱(chēng)，中文翻譯成卡介苗,最早由法國(guó)科學(xué)家卡爾梅特(Calmette)和介朗(Gu6rin)研制成功的疫苗，即將有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基上長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代，得到減毒菌株，可用于預(yù)防結(jié)核菌感染。但正在使用的結(jié)核病疫苗BCG存在保護(hù)效果不穩(wěn)定的缺陷，仍有很大的提升空間。在小鼠模型中，利用BCG免疫后，可以觀察到多種水平上的免疫增強(qiáng)，比如CD4+CD8+ T細(xì)胞水平提高，脾淋巴細(xì)胞刺激后分泌干擾素gamma，TNF-a水平提高等，在免疫后4?6周達(dá)到頂峰，之后逐漸回落。
[0005]利用重組結(jié)核病疫苗方法改善免疫效果有兩種策略，一種是在BCG菌株中表達(dá)抗原性較高的抗原，以提高峰值的水平，一種是在BCG菌株中表達(dá)某種抗原，減緩免疫水平降低。這兩種策略都依賴(lài)于抗原蛋白的篩選與檢驗(yàn)。
[0006]Wag31，又名Ag84，是DivIVA同源蛋白，在結(jié)核分枝桿菌中保守存在。近年來(lái)的研究表明，wag31廣泛參與到結(jié)核分枝桿菌的極點(diǎn)生長(zhǎng)與細(xì)胞壁合成，對(duì)菌體生長(zhǎng)分裂起到重要作用，對(duì)菌體形態(tài)的維持也有重要影響。同時(shí)也是較早發(fā)現(xiàn)的抗原蛋白之一。但是對(duì)于其確切的免疫原性并不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供結(jié)核分枝桿菌Wag31的新用途。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供在原核細(xì)胞中重組表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Wag31，從而制備免疫效果較好的BCG疫苗的一種方法。
[0009]本發(fā)明提供了結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白的新應(yīng)用，即結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白在制備重組BCG疫苗中的應(yīng)用。
[0010]具體而言，結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白可以作為亞單位疫苗組分。
[0011]本發(fā)明的試驗(yàn)表明，第7周，重組BCG疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-ga_a，TNF-a和IL-2的水平低于BCG對(duì)照組，但是第11周時(shí)，重組BCG疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-gamma，IL-2的水平優(yōu)于BCG對(duì)照，這表明Wag31的過(guò)表達(dá)降低了小鼠中BCG免疫效果衰退的速度。因此，wag31可以作為優(yōu)化BCG疫苗的一種另類(lèi)的候選抗原，著眼于增強(qiáng)BCG后期的免疫效果。
[0012]結(jié)核分枝桿菌Wag31基因的NCBI登錄號(hào)為NC_000962.2，蛋白的NCBI登錄號(hào)為NP_216661.1。
[0013]本發(fā)明中的“Wag31基因序列”也包括對(duì)NC_000962.2中一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與NC_000962.2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與NC_000962.2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與NC_000962.2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。
[0014]相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種重組BCG疫苗，利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的蛋白作為疫苗組分，構(gòu)建重組BCG疫苗。
[0015]本發(fā)明提供了一種DNA疫苗，利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的基因片段作為DNA疫苗基因片段的一部分，構(gòu)建DNA疫苗。
[0016]將Wag31基因片段插入表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白，可以作為亞單位疫苗組分。
[0017]另一方面，本發(fā)明提供了一種在原核細(xì)胞中重組表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Wag31，最終制備重組疫苗的方法。
[0018]本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，其含有原核生物的啟動(dòng)子序列和結(jié)核分枝桿菌wag31的基因片段。
[0019]上述重組質(zhì)粒的制備方法，主要包括如下步驟:
(O結(jié)核分枝桿菌H37RV菌株基因組的制備；
(2)Wag31基因的擴(kuò)增；
(3)Wag31基因插入表達(dá)質(zhì)粒，獲得重組子。
[0020]隨后，可以將(3)中所得的重組子轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中。
[0021]較好的，所述的表達(dá)質(zhì)粒含有真核生物的啟動(dòng)子序列。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，結(jié)核分枝桿菌Wag31抗原的表達(dá)純化方法是以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴(kuò)增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達(dá)型質(zhì)粒pMV261中，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至分枝桿菌屬菌株Mycobacterium bovis BCG獲得過(guò)表達(dá)Wag31的重組BCG菌株。
[0023]本發(fā)明提供了一種新的重組質(zhì)粒，即將Wag31基因序列插入一般的商用表達(dá)質(zhì)粒(包括但不限于PMV261)中。
[0024]本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Wag31基因插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)既得。
[0025]本發(fā)明的重組質(zhì)粒制備過(guò)程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作的連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
[0026]本發(fā)明中，可采用的載體有pMV261，pMV361等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所用的質(zhì)粒是PMV261。
[0027]所用的宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)與表達(dá)質(zhì)粒相匹配，可使用多種BCG亞型等。
[0028]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中用的是BCG丹麥菌株。
[0029]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種在分枝桿菌屬菌株Mycobacterium bovisBCG中表達(dá)Wag31的方法。
[0030]Wag31是結(jié)核分枝桿菌抗原，以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組DNA作為模板，用PCR法擴(kuò)增Wag31的基因片段,并插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pMV261中,在分枝桿菌菌株Mycobacteriumbovis BCG中過(guò)表達(dá)Wag31，利用此重組BCG疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)第7周，重組BCG疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌TNF-a和IL-2的水平低于BCG對(duì)照組，但是第11周時(shí)，重組BCG疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的水平優(yōu)于BCG對(duì)照，這表明Wag31的過(guò)表達(dá)降低了小鼠中BCG免疫效果衰退的速度。因此，wag31可以作為優(yōu)化BCG疫苗的一種另類(lèi)的候選抗原，著眼于增強(qiáng)BCG后期的免疫效果。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1:第7周，不同免疫組小鼠(n=5)脾細(xì)胞刺激后分泌的TNF_a的水平。BCG+ffag31表示W(wǎng)ag31過(guò)表達(dá)重組BCG疫苗。
[0032]圖2:第7周，不同免疫組小鼠(n=5)脾細(xì)胞刺激后分泌的IL-2的水平。BCG+ffag31表示W(wǎng)ag31過(guò)表達(dá)重組BCG疫苗。
[0033]圖3:第11周，不同免疫組小鼠(n=5)脾細(xì)胞刺激后分泌的IL_2的水平。BCG+ffag31表示W(wǎng)ag31過(guò)表達(dá)重組BCG疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，wag31可以結(jié)合淋巴細(xì)胞趨化因子X(jué)CL2。XCL2由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以趨化影響樹(shù)突狀細(xì)胞，T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，可能介導(dǎo)肉芽腫的形成。進(jìn)一步的研究表明，Wag31可以誘導(dǎo)XCL2在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索wag31的免疫原性，我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Wag31的重組BCG菌株，并以此菌株免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)雖然第7周的免疫水平低于BCG對(duì)照菌株，但是第11周免疫水平優(yōu)于BCG對(duì)照菌株。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究完成。
[0035]本發(fā)明提出的結(jié)核分枝桿菌Wag31抗原的表達(dá)純化方法是以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴(kuò)增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達(dá)型質(zhì)粒pET30a中，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)株BL21 (DE3)中表達(dá)蛋白Wag31。表達(dá)的Wag31蛋白攜帶6X his-tag，分子質(zhì)量29.7kd，用親和純化法得到的蛋白Wag31蛋白純度好，得率高，可為進(jìn)一步的生物學(xué)研究創(chuàng)造條件。
[0036]本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的重組質(zhì)粒，即將Wag31基因序列插入一般的商用表達(dá)質(zhì)粒中。
[0037]Wag31 基因的 NCBI 登錄號(hào)為 NC_000962.2，蛋白的 NCBI 登錄號(hào)為 NP_216661.1。
[0038]本發(fā)明中的“Wag31基因序列”也包括對(duì)NC_000962.2中一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與NC_000962.2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與NC_000962.2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與NC_000962.2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。
[0039]本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Wag31基因插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)既得。
[0040]本發(fā)明的重組質(zhì)粒制備過(guò)程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作的連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
[0041]本發(fā)明中，可采用的載體有pET32a，pET28a，pET30a等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所用的質(zhì)粒是pET30a。
[0042]本發(fā)明的另一方面，提供了一種結(jié)核分枝桿菌相關(guān)的重組蛋白，即重組蛋白是將插入Wag31基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞而得到的。
[0043]在本發(fā)