一種響應(yīng)面優(yōu)化高純度茼蒿總黃酮的提取純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物有效成分提取工藝，具體涉及一種響應(yīng)面優(yōu)選高純度茼蒿總 黃酮的提取純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 茼蒿，是菊科植物蒿子桿和茼蒿的莖葉，由于它的花很像野菊，所以又名菊花菜， 茼蒿的莖和葉可以同食，蒿之清氣、菊之甘香，一般營養(yǎng)成分無所不備，尤其胡蘿卜素的含 量超過一般蔬菜，中醫(yī)認(rèn)為茼蒿辛、甘、平，歸脾、胃經(jīng)，能開胃增食、降壓補腦等，對咳嗽多 痰、脾胃不和、便秘、記憶力減退、睡眠不足等癥有一定的療效，還有養(yǎng)血清心的作用，比較 適合冠心病、高血壓病人食用。黃酮類物質(zhì)具有抗癌、抗病毒，調(diào)節(jié)免疫力、治療心腦血管疾 病、骨質(zhì)疏松和糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性藥用作用。有研究報告茼蒿內(nèi)含有較為豐富 的黃酮，茼蒿總黃酮對羥自由基具備較好的清除作用。但是目前提取方法得到的茼蒿總黃 酮的純度普遍偏低，一直制約著茼蒿總黃酮藥理和質(zhì)量控制的研究。因此發(fā)明一種從茼蒿 內(nèi)提取獲得純度含量高的茼蒿總黃酮變得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種響應(yīng)面優(yōu)化高純度茼蒿總黃酮 的提取純化工藝。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下： 一種響應(yīng)面優(yōu)化高純度茼蒿總黃酮的提取純化方法，其關(guān)鍵技術(shù)點在于，包括如下步 驟： 步驟一：茼蒿總黃酮的粗提 選取茼蒿，粉碎，稱取茼蒿粉末，按1:30-35( g:mL)料液比，加入提取劑體積分?jǐn)?shù)為 60%-70%的乙醇溶液，20-30°C下，對混合液在80khz 200W條件下超聲波處理50-70min，置 于60°C恒溫水浴鍋中浸提0. 5-1. 5h，離心，取上清液，得到粗提液； 步驟二：雙水相萃取 將步驟一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的雙水相體系，所述C 2Η50Η的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為20%-28%，所述（NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%-24%，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%-3%的NaCl， 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 3-0. 5%的羥丙基-β -環(huán)糊精，調(diào)節(jié)pH值為6-8,混勻，分相； 取出富含茼蒿總黃酮的乙醇上相，進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮溶液，得到0. 25-2. 00mg/ml不 同質(zhì)量濃度的茼蒿黃酮乙醇提取液； 步驟三：茼蒿總黃酮的純化 (1) 大孔吸附樹脂預(yù)處理 (2) 大孔吸附樹脂分離純化 將步驟二得到的0. 25-2. 00mg/ml不同質(zhì)量濃度的茼蒿黃酮乙醇提取液，用酸或堿調(diào) 至4-9的不同pH值，加入到D-101大孔樹脂柱中，用55%-95%不同的體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑乙 醇以I. 0-5. OmL/min的不同的流速進(jìn)行洗脫，對洗脫液進(jìn)行濃縮，得到提取液； (3) 用吸光光度法測定總黃酮含量 步驟⑵得到的吸取提取液lmL，用70%乙醇補至5mL，加入濃度為5%NaN020. 3mL， 搖勻置6min;再加入濃度為10%A1 (NO3)3 0. 3mL，搖勻置6min ;加濃度為4%NaOH4mL，用 蒸餾水定容至10mL，搖勻15min后測定吸光度，根據(jù)吸光度（Y)和濃度（X)的回歸方程： y=9. 12χ-0· 023, R2=O. 9986,計算濃度； (4) 實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析 a單因素試驗 依次改變上樣濃度、上樣PH、洗脫劑濃度、流速進(jìn)行單因素試驗，用步驟（3)中吸光光 度法測定所得的茼蒿總黃酮提取液中的總黃酮的濃度； b響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇上樣濃度、上樣PH、洗脫劑濃度、流速四個因素，利用 Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原則進(jìn)行實驗設(shè)計，以樣濃度A、上樣pH B、洗 脫劑濃度C、洗脫流速D為自變量，以TFCL回收率為響應(yīng)值Y，建立多元二次方程： Y=63. 31-0. 72A-0. 83B-0. 14C-0. 072D-0. 71AB-0. 053AC-0. 7AD-0. 41BC+0. 54BD-0. 21C D-2. 500Ε-0. 78Α2-0. 53Βζ-2. 22Cz-〇. 7ID2 (5) 實驗結(jié)果分析與優(yōu)化 利用Design-Expert軟件根據(jù)多元二次回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到回歸方程的響應(yīng) 面及其等高線圖。
[0005] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟（1)的大孔吸附樹脂預(yù)處理方法具體如下： 用95%乙醇大孔吸附樹脂完全浸泡24h，采用濕法裝柱，用95%乙醇反復(fù)洗滌，直至水與 流出液不產(chǎn)生白色渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味；接著先后用體積分?jǐn)?shù)5%的鹽酸與質(zhì)量分 數(shù)2%的強氧化鈉反復(fù)淋洗，并靜止置2-4h后，用蒸餾水洗至pH值中性，浸泡于蒸餾水中備 用。
[0006] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟（2)大孔吸附樹脂分離純化具體如下： 將質(zhì)量濃度分別為〇. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50和2. 00mg/ml的步驟二得到的茼 蒿黃酮乙醇提取液，用酸或堿調(diào)至pH值分別為4、5、6、7、8、9，加入到0-101大孔樹脂柱中， 用體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的洗脫劑乙醇以I. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. OmL/min的 流速進(jìn)行洗脫，對洗脫液進(jìn)行濃縮。
[0007] 本發(fā)明中"加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%_3%的NaCl，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3-0. 5%的羥丙 基-β -環(huán)糊精"，是指"NaCl在雙水相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%-3%，羥丙基-β -環(huán)糊精在雙水 相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 3-0. 5%。" 為了得到高純度的茼蒿總黃酮，發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的 植物內(nèi)總黃酮的提取方法較多，例如超聲波輔助提取法，索氏提取法，熱回流提取法，超聲 波協(xié)同復(fù)合酶法，微波提取法等。發(fā)明人采用常規(guī)的提取方法對茼蒿總黃酮進(jìn)行了提取，雖 然可以得到一定含量的茼蒿總黃酮液，但是提取結(jié)果讓發(fā)明人沮喪。由于茼蒿本身的多種 復(fù)雜成分所影響，采用常規(guī)的黃酮提取工藝得到的茼蒿總黃酮提取液的純度不高。為了想 得到高純度的茼蒿總黃酮，發(fā)明人進(jìn)入了新的一輪思索。發(fā)明人不得不對獲得的茼蒿總黃 酮提取液進(jìn)行分離純化，大孔樹脂分離純化是化合物提取純化中常用的方法，可以簡單的 將粗提物進(jìn)行分離純化，發(fā)明人欣喜于上述構(gòu)思，但是當(dāng)付諸實施后，實際情況讓發(fā)明人失 望。發(fā)明人嘗試用了多種大孔樹脂：0-101、48-8、、04-201、30-401和01-301，無論如何調(diào) 整上樣濃度、PH、洗脫劑種類和濃度以及流速分離純化結(jié)果均不理想。正當(dāng)發(fā)明人想要放棄 時，意外的發(fā)現(xiàn)，在用大孔樹脂純化之前，用雙水相體系中加入羥丙基-β -環(huán)糊精可以達(dá) 到良好的萃取分離效果，使得萃取產(chǎn)物可以利用大孔樹脂得到純化分離，分析其原因是羥 丙基-β-環(huán)糊精將雜質(zhì)物質(zhì)選擇性的進(jìn)行了包裹，由于羥丙基β環(huán)糊精的水溶性大，將雜 質(zhì)滯留在下相中，基于上述發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過合理的實驗設(shè)計、無數(shù)次的探索和巨大的創(chuàng)造性勞動 尋找到了一種高純度茼蒿總黃酮的提取純化方法，整體形成了本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得有益效果為： 本發(fā)明針對茼蒿本身，采用超聲波輔助提取，雙水相萃取的工藝，使茼蒿總黃酮的提取 率變高，其他非黃酮成分的提取率變低，并且可以用大孔樹脂進(jìn)行分離純化，使最終得到的 茼蒿總黃酮純度顯著提高。
[0009] 本發(fā)明利用Box-Benhnken Designs中心組合設(shè)計模型的響應(yīng)面分析法，用四個變 量因素、3個水平共29個試驗點（5個中心點）就可以得出優(yōu)化結(jié)果，獲得最佳的大孔樹脂 分離純化工藝，提高純化后茼蒿總黃酮的純度。
[0010] 本發(fā)明操作工藝簡單、成本低、易操作，得到的最終茼蒿總黃酮的含量可以提高到 96. 51% 以上。
【附圖說明】
[0011] 附圖1為上樣pH、上樣質(zhì)量濃度對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖； 附圖2為洗脫流速、上樣質(zhì)量濃度對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖； 附圖3為洗脫流速、上樣pH對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖； 附圖4為洗脫流速、上樣質(zhì)量濃度對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖； 附圖5為洗脫流速、洗脫濃度對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖； 附圖6為洗脫濃度、上樣pH對回收率的影響的響應(yīng)面三維圖。
【具體實施方式】
[0012] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的敘述。
[0013] 實施例1 一種響應(yīng)面優(yōu)化高純度茼蒿總黃酮的提取純化方法，其關(guān)鍵技術(shù)點在于，包括如下步 驟： 步驟一：茼蒿總黃酮的粗提 選取茼蒿，粉碎，稱取茼蒿粉末〇. 5Kg，加入提取劑體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液15L， 25°C下，對混合液在80khz 200W條件下超聲波處理60min，置于60°C恒溫水浴鍋中浸提lh， 離心，取上清液，得到粗提液； 步驟二：雙水相萃取 將步驟一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的雙水相體系，所述C 2Η50Η的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為24%，所述（NH4) 2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 7%的NaCl，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 5%的羥丙基-β -環(huán)糊精，調(diào)節(jié)pH值為7,混勻，分相； 取出富含茼蒿總黃酮的乙醇上相，進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮溶液，得到0. 25-2. OOmg/ml不 同質(zhì)量濃度的茼蒿黃酮乙醇提取液； 步驟三：茼蒿總黃酮的純化 (1)大孔吸附樹脂預(yù)處理 取樹脂適量，95%乙醇完全浸泡24h，去除大孔樹脂碎片及雜物。采用濕法裝柱，用95% 乙醇反復(fù)洗滌，直至水與流出液不產(chǎn)生白色渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味；接著先后用體積 分?jǐn)?shù)5%的鹽酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的強氧化鈉反復(fù)淋洗，并靜止置2-4h后，用蒸餾水洗至pH值 中性，浸泡于蒸餾水中備用。
[0014] (2)大孔吸附樹脂分離純化 將質(zhì)量濃度分別為〇. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50和2. OOmg/ml步驟二得到的茼 蒿黃酮乙醇提取液，用酸或堿調(diào)至pH值分別為4、5、6、7、8、9，加入到0-101大孔樹脂柱中， 上樣體積為60ml，用體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的洗脫劑乙醇以I. 0、2. 0、3. 0、 4. 0、5. OmL/min的流速進(jìn)行洗脫，對洗脫液進(jìn)行濃縮，得到提取液； (3) 用吸光光度法測定總黃酮含量 步驟⑵得到的吸取提取液lmL，用70%乙醇補至5mL，加入濃度為5%似勵2的水溶液 0. 3mL，搖勻置6min;再加入濃度為10%A1 (NO3)3的水溶液0. 3mL，搖勻置6min;加濃度為 4%NaOH的水溶液4mL，用蒸餾水定容至10mL，搖勻15min后測定吸光度，根據(jù)吸光度（Y)和 濃度（X)的回歸方程：y=9. 12x-0. 023, R2=O. 9986,計算濃度；的水溶液 (4) 實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析 a單因素試驗 依次改變上樣濃度、上樣PH、洗脫劑濃度、流速進(jìn)行單因素試驗，用步驟（3)中吸光光 度法測定所得的茼蒿總黃酮提取液中的總黃酮的含量； b響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對上樣濃度、上樣PH、洗脫劑濃度、流速四個因素，利用 Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原則進(jìn)行實驗設(shè)計，以樣濃度A、上樣pH B、洗 脫劑濃度C、洗脫流速D