一種治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的三色堇提取物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取物領(lǐng)域，具體涉及一種治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的三色堇提取物及 其制備方法，該提取物可以應(yīng)用于制備治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥材三色堇為堇菜科堇菜屬植物三色堇的全草，又名蝴蝶花（《中國藥用植物圖 鑒》）、游蝶花（《臺灣藥用植物志》）。
[0003] 原植物三色堇（學(xué)名：Viola tricolor L.)是堇菜目、堇菜科、堇菜屬的二年或多 年生草本植物?；~葉片長卵形或披針形，具長柄，莖生葉葉片卵形、長圓形或長圓披針 形，先端圓或鈍，邊緣具稀疏的圓齒或鈍鋸齒。三色堇是歐洲常見的野花物種，也常栽培于 公園中，是冰島、波蘭的國花?；ǘ渫ǔＣ炕ㄓ凶稀?、黃三色，故名三色堇。該物種較耐寒， 喜涼爽，開花受光照影響較大。
[0004]三色堇可殺菌、治療皮膚上青春痘、粉刺、過敏問題，三色堇藥浴也有很好的豐胸 作用。在中國醫(yī)藥古籍記載的護(hù)膚圣品中，三色堇無疑是最炫目的。三國時期的《名醫(yī)別 錄》中就已把三色堇列為重要護(hù)膚藥材，隋煬帝為討后宮佳麗的歡心，曾組織太醫(yī)研究三色 堇去痘的多種方法，并將其一一寫進(jìn)《隋煬帝后宮諸宮藥方》與《香方粉澤》等書之中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種三色堇提取物，其制備方法和液相分析方法，含有該 提取物的藥物制劑及利用該提取物制備治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0007] -種二色堇提取物，該提取物由以下方法制備：
[0008] (a)以重量計，每100份藥材包含干燥的三色堇80~90份和干燥的甘草10~20 份，混合粉碎，用75 %乙醇溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮 液；(b)將步驟（a)所得乙醇提取濃縮液用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（c)正丁 醇萃取物用水溶解，過濾，用大孔樹脂富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去大 極性成分，再用70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮即得。
[0009] 為了能夠通過建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同批次制備的提取物的批間差 異，所述提取物的液相分析方法為：
[0010]色譜柱：Agilent Zorbax Extent_C18柱（4. 6mmX 250mm，5 y m);
[0011] 流動相：A為乙腈，B為0. 5%磷酸溶液；
[0012] 梯度洗脫程序：0? 01 ~5min，A 10%- 15% ;5 ~lOmin，A 15%-48% ;10 ~ 25min，A 48%- 78% ;25 ~30min，A 78%- 10%;
[0013] 流動相流速：1. OmL ? min S檢測波長：270nm ;柱溫：35°C ;進(jìn)樣量：10 y L。
[0014] 藥物制劑，含有治療有效量的所述提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0015] 所述的提取物在制備治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 所述的藥物制劑在制備治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明提取物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物制劑的形式使用。
[0018] 所述藥物制劑含有治療有效量的本發(fā)明三色堇提取物，其余為藥物學(xué)上可接受 的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0019] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明提取物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明通過對干燥的三色堇和甘草進(jìn)行提取、除雜、富集處理，能 得到具有治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的提取物；本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建立該提取物 的指紋圖譜，用于控制不同批次制備的提取物的批間差異。
【附圖說明】
[0021] 圖1為三色堇提取物HPLC液相圖譜。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0023] 實施例1:三色堇提取物①制備（85份三色堇，15份甘草）
[0024] 藥材來源：三色堇和甘草購自安徽亳州中藥材市場。
[0025] 主要試劑：食品級乙醇購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；醫(yī)藥級AB-8大孔樹脂購 自天津波鴻樹脂有限公司；乙腈為HPLC級，購于TEDIA ;85 %磷酸為HPLC級，購于TEDIA; 色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。
[0026]制備方法：將8. 5kg干燥三色堇根莖和I. 5kg干燥甘草混合粉碎，用75 %乙醇溶 液熱回流提取（25LX3次），合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液（2L);將所得 乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽和 的正丁醇（3LX3次）萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物232g;(c)正丁醇萃取物用I. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂（2kg，柱體 積1.5L)富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積（12L)除去大極性成分，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積（18L)，收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得三色堇提取物約150g。
[0027] 實施例2:三色堇提取物②制備（80份三色堇，20份甘草）
[0028]制備方法：將8. Okg干燥三色堇根莖和2. Okg干燥甘草混合粉碎，用75 %乙醇溶 液熱回流提取（25LX3次），合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液（2L);將所得 乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽和 的正丁醇（3LX3次）萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物232g;(c)正丁醇萃取物用I. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂（2kg，柱體 積I. 5L)富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積（12L)除去大極性成分，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積（18L)，收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得三色堇提取物約150g。
[0029] 實施例3:三色堇提取物③制備（90份三色堇，10份甘草）
[0030] 制備方法：將9. Okg干燥三色堇根莖和1.0 kg干燥甘草混合粉碎，用75 %乙醇溶 液熱回流提?。?5LX3次），合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液（2L);將所得 乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽和 的正丁醇（3LX3次）萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物232g;(c)正丁醇萃取物用I. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂（2kg，柱體 積1.5L)富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積（12L)除去大極性成分，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積（18L)，收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得三色堇提取物約150g。
[0031] 實施例4:三色堇提取物④制備（75份三色堇，25份甘草）
[0032] 制備方法：將7. 5kg干燥三色堇根莖和2. 5kg干燥甘草混合粉碎，用75 %乙醇溶 液熱回流提?。?5LX3次），合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液（2L);將所得 乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽和 的正丁醇（3LX3次）萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物232g;(c)正丁醇萃取物用I. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂（2kg，柱體 積1.5L)富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積（12L)除去大極性成分，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積（18L)，收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得三色堇提取物約150g。
[0033] 實施例5:三色堇提取物⑤制備（95份三色堇，5份甘草）
[0034] 制備方法：將9. 5kg干燥三色堇根莖和0. 5kg干燥甘草混合粉碎，用75 %乙醇溶 液熱回流提?。?5LX3次），合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液（2L);將所得 乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽和 的正丁醇（3LX3次）萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物232g;(c)正丁醇萃取物用I. 5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂（2kg，柱體 積1.5L)富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積（12L)除去大極性成分，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積（18L)，收集70%洗脫液，減壓濃縮，即得三色堇提取物約150g。
[0035] 實施例6 :液相色譜分析
[0036] 供試品溶液配制：取實施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加 30mL 10 %乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續(xù)加10 %乙腈水溶液定容。分析方法如 下：
[0037] 高效液相色譜儀：Agilent 1260,二元栗；
[0038]色譜柱：Agilent Zorbax Extent_C18 柱（4. 6mmX 250mm，5 y m);
[0039] 流動相：A為乙腈，B為0. 5%磷酸溶液；
[0040]梯度洗脫程序：0?01 ~5min，A 10% - 15% ;5 ~lOmin，A 15% - 48% ;10 ~ 25min，A 48%- 78% ;25 ~30min，A 78%- 10%;
[0041] 流動相流速：1. OmL ? min S檢測波長：270nm;柱溫：35°C;進(jìn)樣量：10 y L。
[0042]用制備的10批次的三色堇提取物進(jìn)行分析，進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果1~10號峰在 10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)。因此標(biāo)定10個峰為共有色譜峰，據(jù)此建立該提取物的HPLC質(zhì) 量控制圖譜，結(jié)果見圖1。該10批次的三色堇提取物藥理活性相似。
[0043] 實施例7 :提取物藥理試驗
[0044] 一、材料與方法
[0045] I. 1藥物：三色堇提取物①~⑤分別按照實施例1~5制得。秋水仙堿片，批號 100206,規(guī)格0. 5mg/s，西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司；取