相對于親本HepG2 SC細胞，在N-Cad herin中 的EFla 2. 3、CMV 2. 31和CMV2. 60細胞，分別有2. 9、2. 9和2. 4倍的增長。蝸牛實驗的分 析還顯示，EF1A2. 3顯著增加2. 6倍、CMV 2. 31顯著增加6倍、巨細胞病毒2. 60顯著增加 4. 3倍。遵循相同的趨勢，EFlA 2. 3-1. 7倍，巨細胞病毒2. 31-5倍和巨細胞病毒2. 60-1. 6 倍；與SC細胞HepG2相比，這也體現(xiàn)了一個巨大的增長。
[0046] 實施例3 :針對腫瘤干細胞標志物的DC疫苗
[0047] 樹突狀細胞來源于人外周血單個核細胞（PBMC)。PBMCs是采用Ficoll Gradient Ficoll-Paque?技術（GE醫(yī)療生命科學）從新鮮的白細胞層中分離出來的。本發(fā)明使用 的冷凍/解凍的肝癌腫瘤干細胞生成溶解產物和人類外周單個核細胞-衍生的樹突狀細 胞與溶解產物。為了研究產生的樹突狀細胞的啟動能力，T細胞從easysep?人初始CD8+T 細胞富集試劑盒的外周血單個核細胞被分離出來（干細胞分離技術）。還未成熟的T細胞 在專門培養(yǎng)T細胞的Cellgro培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入5%的人類AB血清（美國生命技術公 司）、IL-2 (為50IU/ml)、20ng/ml IL-7 (為）啟動初始T細胞和成熟樹突狀細胞的比例是 1 : 2. 5，1 : 5或1 : 10。在上述細胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)和擴大。混合細胞1周之后，進行新 一輪的抗原脈沖刺激，成熟和已經(jīng)啟動的初始T細胞和T細胞就開始進行擴張。經(jīng)過2輪 啟動后，據(jù)T細胞表型分析，在T細胞群，不同功能的子集進行了表征，尤其是那些記憶T細 胞所表達淋巴結歸巢信號CCR7。中央記憶細胞（⑶45R0/CCR7+)被認為迀移到淋巴組織，而 缺乏淋巴結歸巢信號的效應記憶細胞（⑶45R0/CCR7-)被認為主要是在外周組織。效應記 憶T細胞可迅速形成Thl反應，產生效應細胞因子如IFN-Y和IL-4 Y，從而形成第一道免 疫防御。本發(fā)明觀察到在初始T細胞標記物顯著下降（CCR7+⑶45RA+)從1 : 10(37. 5%) 的比例變成1 : 2. 5 (16. 8% ) (DC預激后的T細胞特性結果如圖5所示）。更重要的是，其 在效應記憶T細胞標記物的表達增加了（CCR7-⑶45RA-)，從36. 7%到57. 5%。這些結果表 明，增加脈沖樹突狀細胞數(shù)量會增加初始T細胞分化的效應記憶T細胞。然而，過量的脈沖 樹突狀細胞可能導致成熟的前T細胞疲憊進而影響他們的生存能力和殺傷能力。因此，本 發(fā)明認為，成熟樹突狀細胞和初始T細胞按1 : 5的比例共培養(yǎng)也許會生成很多的具有抗 腫瘤效果的細胞毒性淋巴細胞。
[0048] 使用如上所述的優(yōu)化直流脈沖和初始T細胞的啟動條件，ELISP0T試驗確定肝 癌CSC樣細胞可以用來制備具有肝癌CSC抗原特異性的靶向CTL。酶聯(lián)斑點試驗（瑞典， MabTech AB)HLA-A2+T2細胞被用來作為靶向細胞。對于CSC相關抗原的表達，T2細胞在 Ce 11 gro培養(yǎng)基分別孵育10 y g/mL Oc t4、Sox2、EpCAM和EGFP肽，條件為無血清的Ce 11 gro 介質、溫度37°C、C02濃度為5%。T細胞應答后產生的啟動HLA-A2+初始T細胞的自體脈 沖樹突狀細胞分別與T2靶向細胞以10 : 1的比例目標培養(yǎng)，在Cellgro培養(yǎng)基內加入5% 人類AB血清用96孔板節(jié)流Cellgro介質。培養(yǎng)4h后，細胞轉入ELISP0T板孵育培養(yǎng)一 夜。根據(jù)制造商的指示進行抗原特異性T細胞的檢測。開發(fā)出相應的IFNy干擾素產生細 胞，使用自動讀板CTL-biospot?.S6紫外分析儀（美國俄亥俄州，Cellular Technology Limited)進行掃描和分析。當將所產生的T細胞混合T2脈沖與0CT4 (69)、S0X2 (63)和 EpCAM (119)肽與對照組（未經(jīng)過脈沖=29,綠色熒光蛋白=33) (ELISP0T測定具有CSC抗 原特異性的CTL的產生結果如圖6、圖7所示）結果是每5x104個細胞中含有能分泌干擾 素-Y的細胞個數(shù)。結果由三個獨立的實驗而來，表述形式平均數(shù)土標準差。
[0049] 比較觀察時，觀察到IFN-Y產生斑點的數(shù)量顯著增加。測試顯著增加T細胞反應 與IFN- 丫 ELISP0T檢測證明所產生的細胞毒性T淋巴細胞（CTL)的溶解作用，具體的測試 癌癥干細胞抗原包括0ct4 (69)、Sox2 (63)和EpCAM。這些結果證實人類樹突狀細胞負載腫 瘤干細胞標志物表達的肝癌細胞裂解物能夠在自體T細胞引起抗CSC抗原反應。由于腫瘤 干細胞是罕見的腫瘤細胞，因此要獲得足夠的資源和特定的CSC抗原量是很困難的。本發(fā) 明的方法填補了 DC免疫治療針對腫瘤干細胞的技術差距，即利用0ct4/S〇x2表達所形成的 類腫瘤干細胞的細胞體作為通用的腫瘤抗原的基因來源。
[0050] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述樹突狀細胞疫苗的制備使用0ct4和Sox2基 因高表達的肝癌細胞株。2. 如權利要求1所述的樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述制備疫苗的肝癌細胞株基 因組的AAVSl位點中插入了 0ct4和Sox2基因。3. 如權利要求2所述的樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述肝癌細胞株AAVSl位點位 于基因編碼的蛋白磷酸酶1調節(jié)亞基內，調節(jié)位于人類基因組的19號染色體亞基12C，即 ppplrl2c上；是非致病性腺相關病毒的特異性結合位點2型。4. 如權利要求2所述的樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述插入肝癌細胞株AAVSl位點 中的0ct4基因序列長度為1080 ;所述Sox2基因序列長度為951。5. 如權利要求1所述的樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述樹突狀細胞疫苗將肝癌干 細胞通過細胞誘導技術誘導擴增而來。6. 如權利要求5所述的樹突狀細胞疫苗，其特征在于，所述肝癌干細胞是由修改后的 0ct4和Sox2基因高表達的肝癌細胞株，通過腫瘤干細胞球體形成法富集而來。7. -種制備如權利要求1所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 采用桿狀病毒-鋅指核酸酶技術向肝癌細胞株基因組的AAVSl位點中插入0ct4和 Sox2基因，制備得到修改后的肝癌細胞； (2) 對所述的修改后的肝癌細胞，采用腫瘤干細胞球體形成法富集類肝癌干細胞，提升 肝癌干細胞標記物的表達； (3) 由自體血分離制備單核細胞，加入細胞因子誘導擴增抗原遞呈樹突狀細胞，然后用 類肝癌干細胞凍融裂解液刺激樹突狀細胞以獲得負載肝癌干細胞抗原的抗原遞呈樹突狀 細胞。8. 如權利要求1-6任一所述疫苗和權利要求7所述方法在肝癌免疫領域的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學生物工程技術領域，具體涉及一種樹突狀細胞疫苗及其制備方法與應用。公開了一種制備針對肝癌干細胞的人樹突狀細胞(DC)癌癥疫苗方法：用鋅指核酸酶技術向肝癌細胞株基因組的AAVSl位點中插入Oct4和Sox2基因；采用腫瘤干細胞球體形成法，從修改過的肝癌細胞中富集了類肝癌干細胞；用類肝癌干細胞凍融裂解液刺激自體血分離制備的樹突狀細胞得負載肝癌干細胞抗原的抗原遞呈DC細胞，建立的肝癌干細胞株能高水平地表達肝癌干細胞的分子標記物，顯著提升CDl3、CD90和EpCAM等數(shù)個肝癌干細胞標記物的表達，特異性強；采用的抗原遞呈樹突狀細胞源自自體血、安全性高，毒副作用??；制備DC細胞癌癥疫苗經(jīng)試用后顯著激發(fā)腫瘤干細胞特異性細胞毒性效應CTL反應。
【IPC分類】A61P1/16, A61P35/00, C12N5/10, A61K39/00, C12N5/0784
【公開號】CN105031632
【申請?zhí)枴緾N201510334814
【發(fā)明人】卓朗, 王暉, 王柯
【申請人】深圳市科暉瑞生物醫(yī)藥有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月16日...