一種組織工程軟骨支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種組織工程軟骨支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)功能執(zhí)行的必要成分，由骨組織及其周圍的軟骨膜構(gòu)成，軟骨組織則由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成。軟骨在關(guān)節(jié)功能中發(fā)揮著重要的作用。然而，關(guān)節(jié)軟骨損傷是十分常見疾病，臨床上各種原因進(jìn)行的關(guān)節(jié)鏡手術(shù)約80%的病人均發(fā)現(xiàn)有軟骨損傷，20%為較重的軟骨損傷。由于軟骨內(nèi)缺乏血管組織，而且軟骨組織細(xì)胞被包裹在基質(zhì)成分中，不能迀移到損傷部位修復(fù)缺損，致使關(guān)節(jié)軟骨損傷后的自愈能力很差，不能實(shí)現(xiàn)再生。軟骨損傷若不及時(shí)治療，容易造成關(guān)節(jié)彈響、僵硬、疼痛加重等，最終需要關(guān)節(jié)置換，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。
[0003]目前，針對(duì)軟骨組織損傷治療方法由關(guān)節(jié)灌洗術(shù)、關(guān)節(jié)清理術(shù)、骨膜移植、軟骨移植和自體軟骨細(xì)胞移植等。但是該些方法存在著明顯的不足，關(guān)節(jié)清理術(shù)只能暫時(shí)緩解癥狀；微骨折受傷只能在缺損部位再生纖維軟骨，不能達(dá)到正常軟骨的力學(xué)要求；自體軟骨僅適用于軟骨缺損面積較小的損傷治療。現(xiàn)有制備方法也得不到合格適用于人體的組織工程軟骨。
[0004]由此可見，常規(guī)治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法和手段存在明顯的不足，治療的效果并不理想。因此，如何基于軟骨組織的結(jié)構(gòu)，在體外條件下制備組織工程軟骨，應(yīng)用于軟骨損傷的修復(fù)，為軟骨缺損治療提供最佳的選擇，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種組織工程軟骨支架及其制備方法，該制備方法具有流程簡(jiǎn)單，制備的組織工程軟骨支架合格率高，該組織工程軟骨支架具有生物相容性好，毒性低，適用范圍廣，各項(xiàng)性能參數(shù)均適合人體軟骨組織修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種組織工程軟骨支架的制備方法，其包括以下步驟:
步驟A:提取II型膠原蛋白；
步驟B:利用所述II型膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素以及羥基磷灰石制備初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架；
步驟C:利用EDC/NHS系統(tǒng)將步驟B中的初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架進(jìn)行交聯(lián)，再冷凍干燥得到CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架；
步驟D:對(duì)所述CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架進(jìn)行消毒，得到可應(yīng)用于人體的組織工程軟骨支架。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述的II型膠原蛋白從牛骨、豬骨、羊骨中提取得到或者所述II型膠原蛋白通過(guò)基因工程菌株生產(chǎn)得到。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟B中，所述II型膠原蛋白、所述透明質(zhì)酸、所述硫酸軟骨素配制成l%_2%(m/V)的溶液；
其中，所述透明質(zhì)酸溶液和所述硫酸軟骨素溶液混合后，再加入透明質(zhì)酸溶液或者硫酸軟骨素溶液質(zhì)量的4-14倍的II型膠原蛋白溶液得到CI1-HA-CS混合液；
所述羥基磷灰石添加量為所述II型膠原蛋白、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素總質(zhì)量的30%-80%，與所述CI1-HA-CS混合液形成均一的混合溶液。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述均一的混合溶液轉(zhuǎn)移至24孔板中，冷凍干燥得到初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC的混合溶液中，在培養(yǎng)箱中20 °C -25 °C條件下交聯(lián)24-36小時(shí)得到CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0011]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟D中，所述CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架通過(guò)紫外線、Co6°滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌進(jìn)行消毒。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟B中，通過(guò)3D打印機(jī)得到初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0013]本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述方法制備的組織工程軟骨支架，該組織工程軟骨支架吸水率為300-600%，孔隙率為90%以上，孔徑為50-300 μ m，抗壓強(qiáng)度為大于8kPa。
[0014]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述組織工程軟骨支架3周的降解率為15%_35%。
[0015]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述組織工程軟骨支架經(jīng)過(guò)小鼠成軟骨細(xì)胞ATDC-5培養(yǎng)，可使得成軟骨細(xì)胞ATDC-5生長(zhǎng)良好。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的組織工程軟骨支架制備方法應(yīng)用機(jī)體中存在的天然物質(zhì)的復(fù)合材料，制備的組織工程軟骨支架具有生物相容性好、毒性低、易降解、降解產(chǎn)物無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明制得的組織工程軟骨支架外觀形態(tài)致密，各項(xiàng)性能參數(shù)適于人體軟骨組織的修復(fù)；本發(fā)明構(gòu)建組織軟骨支架的材料來(lái)源廣泛、容易塑形、可用于大面積創(chuàng)傷修復(fù)。本發(fā)明可根據(jù)3D打印技術(shù)構(gòu)建出不同的形狀，針對(duì)不同部位的缺損大小及形狀量體裁衣，方便應(yīng)用，可在室溫下長(zhǎng)期保存。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明的組織工程軟骨支架一實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明的組織工程軟骨支架1000倍的電鏡圖；
圖3為本發(fā)明的組織工程軟骨支架3500倍的電鏡圖；
圖4為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)2天的軟骨細(xì)胞ATDC-5熒光染色圖；
圖5為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)4天的軟骨細(xì)胞ATDC-5熒光染色圖；
圖6為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)7天的軟骨細(xì)胞ATDC-5熒光染色圖；
圖7為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)12天的軟骨細(xì)胞ATDC-5熒光染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0019]實(shí)施例1
本發(fā)明組織工程軟骨支架制備方法，包括以下步驟:
步驟一:11型膠原蛋白的提取。
[0020]首先，選擇新鮮的牛軟骨，用三氯甲烷、甲醇除去骨膜，并將該新鮮牛軟骨粉碎。接著，用含4mol/L鹽酸胍溶液0.05mol/L Tris-HCl攪拌處理粉碎的軟骨組織、并在4°C下低溫離心，去上清。重復(fù)多次除去蛋白多糖。然后，將離心得到的沉淀物用0.1-0.5 mol/L乙酸充分洗滌后，溶解于同濃度的乙酸中，加入胃蛋白酶對(duì)沉淀物進(jìn)行消化處理10-18小時(shí)，4°C保存離心，將離心得到的上清液，再進(jìn)行消化處理5-8小時(shí)，合并上述得到的上清液，制備得到II型膠原蛋白溶液。最后，將上述上清液經(jīng)鹽析，通過(guò)冷凍干燥機(jī)干燥得到II型膠原蛋白O
[0021]在本步驟中，II型膠原蛋白還可以通過(guò)豬軟骨、羊軟骨等動(dòng)物軟骨中提取的得到，或者II型膠原蛋白通過(guò)基因工程菌株生產(chǎn)得到。
[0022]步驟二:制備初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0023]首先，將步驟一中提取的冷凍干燥得到的II型膠原蛋白溶于0.05mol/L HCl溶液中，在4°C條件下，攪拌使其溶解完全，得到終濃度為l%-2%(m/V)的II型膠原蛋白溶液。同時(shí)，用去離子水分別溶解透明質(zhì)酸HA和硫酸軟骨素CS，在4°C條件下，攪拌使其完全溶解得到濃度為l%_2%(m/V)的透明質(zhì)酸溶液，終濃度為l%_2%(m/V)硫酸軟骨素溶液，其中，m/V為溶質(zhì)質(zhì)量相對(duì)于溶液體積的百分比，例如，Ig固體溶于10ml液體，則m/V為1%。并將上述透明質(zhì)酸溶液和硫酸軟骨素溶液進(jìn)行混合。接著，在透明質(zhì)酸溶液和硫酸軟骨素溶液的混合溶液中加入透明質(zhì)酸溶液或者硫酸軟骨素溶液質(zhì)量的4-14倍的II型膠原蛋白溶液，并不斷攪拌。最后，添加II型膠原蛋白，透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素總質(zhì)量的30%-80%的羥基磷灰石得到混合溶液體系。將該混合溶液體系在4°C條件下繼續(xù)攪拌，得到均一的混合溶液。最后，將上述均一的混合溶液體系轉(zhuǎn)移至24孔板中，真空冷凍干燥，得到初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0024]本步驟中，可以利用上述均一的混合溶液通過(guò)3D打印機(jī)得到初級(jí)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架，3D打印機(jī)可以根據(jù)具體的需要有針對(duì)性的進(jìn)行制備組織工程軟骨支架的形狀。
[0025]本步驟中，也可通過(guò)模具根據(jù)具體的需要，制備相應(yīng)的組織工程軟骨支架。
[0026]本步驟中，所述的酸溶液包括鹽酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液等常用的酸溶液。
[0027]步驟三:應(yīng)用EDC/NHS系統(tǒng)對(duì)CI1-HA-CS-HAP三維軟骨初級(jí)支架進(jìn)行交聯(lián)。首先，將CI1-HA-CS-HAP三維軟骨初級(jí)支架在乙醇、MES混合溶液中室溫條件下浸泡30 min。然后，將該三維軟骨初級(jí)支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培養(yǎng)箱中20°C條件下交聯(lián)24小時(shí)。再在震蕩條件下，將該三維軟骨支架在Na2HPO4溶液中洗滌2次，每次15-30 min ;NaCl溶液中多次洗滌；三蒸水多次洗滌。最后，將處理過(guò)的三維軟骨支架在真空中冷凍干燥，得到CI1-HA-CS-HAP三維軟