京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料的用圖
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日：2014年4月10日、【申請(qǐng)?zhí)枴?01410143074. 0、發(fā)明名稱(chēng)：一種促 消化道粘膜修復(fù)材料及其制備方法和用途的專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 消化道潰瘍，主要指發(fā)生在胃和十二指腸的慢性潰瘍，亦可發(fā)生于食管下段、胃空 腸吻合口周?chē)昂挟愇晃刚衬さ拿揽藸枺∕ECKEL)憩室，這些潰瘍的形成與胃酸和胃蛋 白酶的消化作用有關(guān)，故稱(chēng)消化性潰瘍。消化道潰瘍是臨床上消化系統(tǒng)常見(jiàn)病癥之一，近年 來(lái)隨著生活節(jié)奏的加快，飲食結(jié)構(gòu)的改變以及進(jìn)食時(shí)間的不規(guī)律，發(fā)病率逐漸上升。消化道 潰瘍的發(fā)生與很多因素有關(guān)，臨床上常見(jiàn)的病因有胃酸分泌過(guò)多、膽汁反流、HP(幽門(mén)螺旋 桿菌）感染、胃黏膜防御能力下降等。該病病程漫長(zhǎng)，若不能給予有效治療，長(zhǎng)期發(fā)展可導(dǎo) 致胃癌，嚴(yán)重影響患者生命安全。
[0004]臨床上治療消化道潰瘍的方式主要有保守治療方式和手術(shù)治療方式。保守治療方 式的藥效溫和，痛苦小，但見(jiàn)效較慢，治療常常不徹底，而且復(fù)發(fā)率較高，每一次復(fù)發(fā)，病情 一般比上一次更為嚴(yán)重，因此患者不得不加大用藥劑量，或換用其他藥物治療，長(zhǎng)此以往， 機(jī)體耐藥性增加，臨床效果卻并不一定有顯著改善。手術(shù)治療方式見(jiàn)效快，治療較為徹底， 但創(chuàng)傷較大，并發(fā)癥較為明顯。近年來(lái)隨著材料學(xué)以及內(nèi)鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究 者已將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到利用內(nèi)鏡技術(shù)將生物材料送至消化道潰瘍處，來(lái)達(dá)到修復(fù)損傷黏膜的目 的，這將有望既徹底地治愈消化道潰瘍，又減少手術(shù)巨大創(chuàng)傷帶來(lái)的痛苦，同時(shí)達(dá)到診斷治 療一體化。
[0005] 小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS)是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi) 生物材料，通常由豬小腸制備。SIS主要含有膠原、氨基多糖、糖蛋白等成分，適宜上皮細(xì)胞 的黏附和生長(zhǎng)，其所包含的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growthfactors，F(xiàn)GF)等還能促進(jìn)修復(fù)組織的血 管化，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞和組織的迀移。SIS是當(dāng)前廣泛用于組織工程研究的天然細(xì)胞外基質(zhì)類(lèi) 生物材料，具有良好的細(xì)胞相容性、含有多種生長(zhǎng)因子、無(wú)免疫原性、具有抗微生物活性、各 向異性、組織特異性誘導(dǎo)再生等特點(diǎn)，是較為理想的黏膜修復(fù)材料。然而，將SIS用于消化 道黏膜的修復(fù)材料仍存在一些明顯的缺陷，如遇水易變形，容易被強(qiáng)酸和胃蛋白酶降解，摩 擦系數(shù)低等，導(dǎo)致SIS難以用內(nèi)鏡輸送，到達(dá)病灶處容易過(guò)早降解而失去功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料的用 途。
[0007] 本發(fā)明促消化道粘膜修復(fù)材料，它是含有京尼平的小腸黏膜下層，具體是由京 尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成，小腸粘膜下層經(jīng)過(guò)京尼平交聯(lián)后的交聯(lián)指數(shù)為30 %~ 100%〇
[0008] 交聯(lián)指數(shù)，表征高分子鏈的交聯(lián)程度。
[0009] 本發(fā)明京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料在制備具有抗酸性能的組織修 復(fù)材料中的用途；其中，所述材料的交聯(lián)指數(shù)為30%~100%。
[0010] 優(yōu)選地，所述交聯(lián)指數(shù)為30. 63%~86. 52%。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述交聯(lián)指數(shù)為 67. 28 %~86. 52%。再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述交聯(lián)指數(shù)為67. 28 %~85. 22%。最優(yōu)選地，所 述交聯(lián)指數(shù)為83. 74~85. 22 %或者67. 28~69. 92 %。
[0011] 所述京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料由如下方法制備而成：
[0012] (1)取京尼平溶于緩沖液，制成濃度不低于0? 01% (w/v)的京尼平溶液；
[0013] (2)將小腸粘膜下層浸泡于步驟（1)制得的京尼平溶液中，浸泡時(shí)間不低于3h;
[0014] ⑶取出小腸黏膜下層，清洗，冷凍干燥，即得。
[0015] 步驟⑴中，所述緩沖液的pH為4~11。優(yōu)選地，所述緩沖液的pH為7. 2。
[0016] 步驟（1)中，所述緩沖液為PBS溶液。
[0017] 驟（1)中，京尼平溶液的濃度為0. 01~0. 6 % (w/v)。優(yōu)選地，所述京尼平溶液的 濃度為0.05~0.6% (w/v)。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述京尼平溶液的濃度為0.05~0.3% (w/ v)。再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述京尼平溶液的濃度為0.3% (w/v)。
[0018] 步驟（2)中，小腸粘膜下層表面積與京尼平溶液體積的比值為（200~3) :1。
[0019] 步驟⑵中，浸泡時(shí)間為3~24h。
[0020] 步驟⑵中，浸泡的溫度為4°C~65°C。優(yōu)選地，所述浸泡的溫度為37°C。
[0021] 本發(fā)明京尼平交聯(lián)小腸黏膜下層制備而成的材料，具有抗胃液中強(qiáng)酸和胃蛋白酶 分解的特性，可以制成具有抗酸抗酶解性能的組織修復(fù)材料，如促消化道修復(fù)材料，且其力 學(xué)性能優(yōu)良，無(wú)細(xì)胞毒性，溶血率低，組織相容性性好，孔徑大小合適，適于細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí) 含有大量生長(zhǎng)因子，體內(nèi)修復(fù)無(wú)明顯鈣化現(xiàn)象，使用安全，為消化道粘膜修復(fù)提供了一種新 的選擇，制備方法簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0022] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1 SIS膜。其中，A:新鮮制備的SIS膜呈半透明狀；B:凍干后SIS膜呈白色紙 狀；
[0025] 圖2京尼平交聯(lián)SIS后交聯(lián)指數(shù)。（*P < 0. 05表示各組與SIS相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異；#P < 0. 05,表示各交聯(lián)組與0. 01%交聯(lián)組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。
[0026] 圖3京尼平交聯(lián)后SIS在人工胃液中不同時(shí)間段降解情況。1 :SIS+人工胃液；2: SIS+PBS ;3 :0? 01% GP 交聯(lián) SIS+ 人工胃液；4 :0? 05% GP 交聯(lián) SIS+ 人工胃液；5 :0? 1% GP 交聯(lián)SIS+人工胃液；6 :0? 3% GP交聯(lián)SIS+人工胃液；7 :0? 5% GP交聯(lián)SIS+人工胃液；8: 0.6% GP交聯(lián)SIS+人工胃液
[0027] 圖4京尼平交聯(lián)后SIS在人工胃液中2周，4周，8周降解的宏觀觀察。
[0028] 圖5 SIS交聯(lián)指數(shù)與京尼平交聯(lián)時(shí)間的關(guān)系。（*P〈0. 05表示在京尼平溶液中交聯(lián) 24h組與京尼平溶液中交聯(lián)12h組的交聯(lián)指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）
[0029] 圖6 IS交聯(lián)指數(shù)與交聯(lián)溫度的關(guān)系。（*P〈0. 05表示37°C京尼平溶液交聯(lián)組與 25°C京尼平交聯(lián)組的交聯(lián)指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）
[0030] 圖7 SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)SIS的溶脹率。（*P〈0. 05表示與未交聯(lián)SIS組相 比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；#P〈〇. 05表示與0. 05%組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）
[0031] 圖8 SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)SIS的紅外掃描圖譜。
[0032] 圖9京尼平交聯(lián)后SIS極限抗張強(qiáng)度測(cè)試。（*P < 0. 05表示各組與SIS相比較有 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，#P < 〇. 05,表示各交聯(lián)組與0. 5%交聯(lián)組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。
[0033] 圖10 SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)SIS在人工胃液中浸泡0周，2周，4周和8周后 極限抗張強(qiáng)度測(cè)試。（*P < 0. 05表示各組與SIS相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，#P〈0. 05表示與對(duì) 應(yīng)0周組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。
[0034] 圖11 SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)SIS在人工胃液中浸泡0周，2周，4周和8周后 剛度測(cè)試。
[0035] 圖12 ELISA法檢測(cè)SIS及濃度為0.3%京尼平交聯(lián)組SIS中VEGF和TGF-0 1在 14天內(nèi)釋放情況。
[0036] 圖13京尼平交聯(lián)后SIS掃描電鏡圖。A:未交聯(lián)SIS ;B:0. 05% GP交聯(lián)材料；C: 0. 1% GP交聯(lián)材料；D :0. 3% GP交聯(lián)材料；E :0. 5% GP交聯(lián)的材料。
[0037] 圖14人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1接種到SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)的SIS上3天 后活細(xì)胞染色。a-e為40倍下觀察到的細(xì)胞。a:未交聯(lián)SIS ;b:0. 05% GP交聯(lián)材料；c : 0. 1% GP交聯(lián)材料；d :0. 3% GP交聯(lián)材料；e :0. 5% GP交聯(lián)的材料。f-j為100倍下觀察到 的細(xì)胞。f:未交聯(lián)SIS ;g:0. 05% GP交聯(lián)材料；h :0. 1% GP交聯(lián)材料；i :0. 3% GP交聯(lián)材 料；j :0. 5%GP交聯(lián)的材料。
[0038] 圖15促消化道粘膜修復(fù)材料浸提液溶血情況。1:陰性對(duì)照；2:陽(yáng)性對(duì)照；3:未交 聯(lián)SIS浸提液；4 :0. 05% GP交聯(lián)材料浸提液；5 :0. 1% GP交聯(lián)材料浸提液；6 :0. 3% GP交 聯(lián)材料浸提液；7 5% GP交聯(lián)材料浸提液。
[0039] 圖16 SD大鼠背部皮下植入SIS及不同濃度京尼平交聯(lián)SIS材料組織學(xué)觀察。 圖（a)-(e)材料第2周時(shí)炎性細(xì)胞情況。（a):未交聯(lián)SIS ; (b) :0. 05% GP交聯(lián)材料；（c): 0. 1 % GP交聯(lián)材料；(d) :0. 3 % GP交聯(lián)材料；(e) :0. 5 % GP交聯(lián)的材料。圖（f) - (j)材料 第2周時(shí)炎性細(xì)胞