長非編碼rna h19與癌癥鉑類化療藥物耐藥相關(guān)性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域，具體涉及長非編碼RNA H19與癌癥鉑類化療藥 物耐藥相關(guān)性。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌死亡率仍居?jì)D科腫瘤之首。盡管卵巢癌治療方案不斷改進(jìn)，如手術(shù)切除范 圍的擴(kuò)大、紫杉醇和鉑類藥物的聯(lián)合化療，但死亡率仍居高不下，據(jù)報(bào)道III期患者的五年生 存率僅為29%。究其原因，除了早期診斷困難外，化療耐藥是影響卵巢癌患者存活率的重要 因素。目前在卵巢癌化療方案中，鉑類藥物是臨床上首選藥物之一。雖然卵巢癌患者對以 鉑類為主的聯(lián)合化療首次有效率達(dá)到70% -80%，但大部分患者都會(huì)在今后的化療中產(chǎn)生 繼發(fā)性耐藥。因此如何預(yù)測耐藥，如何避免發(fā)生耐藥，以及如何逆轉(zhuǎn)耐藥和開發(fā)針對耐藥腫 瘤細(xì)胞的新藥等，不僅是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，也將是今后卵巢癌研究中的長期任務(wù)。
[0003] 卵巢癌耐藥機(jī)制的深入理解是解決臨床耐藥問題的基礎(chǔ)，也是改善化療效果的關(guān) 鍵。已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卵巢癌對鉑類藥物耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制可能和以下因素有關(guān)：1) 腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的吸收減少、排出增強(qiáng)或藥物作用失效：北京協(xié)和醫(yī)院潘凌亞課題組 的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌鉬類耐藥特異性標(biāo)記蛋白Annexin A3通過降低細(xì)胞內(nèi)鉬含量及鉬一 DNA結(jié)合量而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。2)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)：鉑類藥物引起的DNA損傷主 要通過核苷酸切除修復(fù)途徑，例如切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 I(ERCCl)和ERCCl基因的表達(dá) 產(chǎn)物與DNA修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因 F(XPF)形成緊密的異二聚體（ERCC1/XPF)基因等來矯 正。同時(shí)DNA同源修復(fù)途徑和DNA聚合酶相關(guān)基因也與鉑類藥物抗性有關(guān)，如乳腺癌1號 (BRCAl)，DNA聚合酶eta等。因此，DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在鉑類敏感細(xì)胞中往往是有缺陷的。 3)細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)：細(xì)胞凋亡信號通路的異常和順鉑抗性有關(guān)。P53低表達(dá)或Mdm2高表 達(dá)使腫瘤細(xì)胞對順鉑不敏感。4)信號通路相關(guān)：鉑類耐藥機(jī)制也與相關(guān)信號通路有關(guān)，如 Cadherins/catenins和PTEN/PI3K/AKT等信號通路，PI3K抑制劑增加耐藥株對順鉑的敏 感性。5)miRNAs相關(guān):miR-128在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SK0V3/CP中低表達(dá)，在該細(xì)胞株 中過表達(dá)miR-128降低ABCC5和Bmi-I蛋白表達(dá)，也使得該細(xì)胞對順鉑的敏感性增加。雖 然我們對卵巢癌鉑類耐藥機(jī)制有了比較多的了解，但是離解決臨床耐藥問題還有一定的距 離，對其耐藥機(jī)制還需展開深入的研究。
[0004] 最近研究發(fā)現(xiàn)一些長片段非編碼RNA(long noncoding RNA, IncRNA)參與了腫瘤 細(xì)胞對DNA損傷時(shí)的應(yīng)答。Huarte等研究發(fā)現(xiàn)IncRNAs在p53途徑中起重要作用，其中 lincRNA-p21在DNA損傷時(shí)作為p53的靶基因起作用；lincRNA-p21進(jìn)一步與hnRNP-K互 相作用調(diào)控下游系統(tǒng)基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞凋亡。另一個(gè)長片段非編碼RNA PANDA，也是 P53的靶基因，在DNA損傷時(shí)被誘導(dǎo)；PANDA進(jìn)一步和轉(zhuǎn)錄因子NF-YA互作引起細(xì)胞周期停 滯。又如Cdc281ncRNA在逆境下能誘導(dǎo)⑶C28表達(dá)，而⑶C28表達(dá)量增加使細(xì)胞容易在逆 境消除后重新進(jìn)入細(xì)胞周期等。由此可見，長片段非編碼RNA廣泛參與了 DNA損傷應(yīng)答的 各個(gè)環(huán)節(jié)。而鉑類藥物主要與DNA交聯(lián)，誘發(fā)DNA損傷，從而引起系列生物學(xué)效應(yīng)。因而， 長片段非編碼RNA有可能參與了卵巢癌鉑類耐藥的作用機(jī)理。但關(guān)于長片段非編碼RNA與 鉑類耐藥相關(guān)的研究至今還未見報(bào)道。
[0005] H19基因編碼一個(gè)2. 3kb的非編碼RNA分子，包含5個(gè)外顯子，是最早發(fā)現(xiàn)的 印跡基因之一。長非編碼RNA H19的序列（如SEQ ID NO: 1所示）可以從GeneBank數(shù) 據(jù)庫查閱獲知，其在NCBI數(shù)據(jù)庫，Nucleotide子庫中的登錄號為NR_002196. 2。已有研 究發(fā)現(xiàn)H19廣泛參與各種生理病理過程。H19的表達(dá)受上游2到4kb處的印記調(diào)控區(qū) (imprintingcontrolregion，ICR)和上下游的增強(qiáng)子調(diào)控，印記調(diào)控區(qū)包括差異甲基化區(qū) (differentiallymethylatedregion，DMR)和沉默元件（silencer element)，DMR 能結(jié)合 CTCF絕緣子蛋白。在母系遺傳的等位基因，DMR區(qū)結(jié)合CTCF，H19通過其上下游增強(qiáng)子激 活。而在父系遺傳的等位基因，DMR區(qū)被甲基化，H19轉(zhuǎn)錄被沉默元件抑制。雖然在細(xì)胞質(zhì) 及細(xì)胞核內(nèi)都能檢測到H19分子，但H19主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其不僅參與了胚胎發(fā)育調(diào) 控，還以抑癌基因或癌基因角色參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼H19在 多種腫瘤中異常表達(dá)，如膀胱癌等多種惡性腫瘤，并發(fā)現(xiàn)其具有原癌活性。但也有研究認(rèn)為 H19具有抑癌活性，可以抑制腫瘤的惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管的形成。因此，H19 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)理可能是比較復(fù)雜的。另外，至今為止，H19參與卵巢癌順鉑耐藥的 情況以及具體作用機(jī)制尚未見諸報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于：通過研究長非編碼RNA H19與癌癥鉑類化療藥物 耐藥相關(guān)性，提供長非編碼RNA H19在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物、用于診斷癌癥發(fā)生或預(yù) 測癌癥復(fù)發(fā)的試劑盒中的應(yīng)用，以及提供長非編碼RNA H19在調(diào)控癌癥的鉑類化療藥物耐 藥性、預(yù)測、檢測或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供能夠減少和/或抑制癌細(xì)胞中的長非編碼RNA H19表 達(dá)的藥劑在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供能夠減少和/或抑制癌細(xì)胞中的長非編碼RNA H19表 達(dá)的藥劑在制備降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。
[0009] 例如：
[0010] 就本發(fā)明的上述用途，所述藥劑優(yōu)選自：抑制所述長非編碼RNA H19表達(dá)的反義 RNA或特異切割所述長非編碼RNA H19的核酶。
[0011] 就本發(fā)明的上述用途，所述藥劑優(yōu)選自：抑制所述長非編碼RNA H19表達(dá)的小分 子化學(xué)藥劑。
[0012] 在本發(fā)明上述用途的一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的反義RNA，其包含能夠特異結(jié) 合所述長非編碼RNA H19或其互補(bǔ)序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，優(yōu)選所述 反義RNA包含與H19的一個(gè)或多個(gè)部分互補(bǔ)的序列區(qū)域，更優(yōu)選地所述反義RNA包含與全 長H19完全互補(bǔ)的DNA序列，優(yōu)選地，所述反義核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最優(yōu) 選地，所述反義RNA包含在能夠表達(dá)其的表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)選真核表達(dá)質(zhì)粒中。
[0013] 在本發(fā)明上述用途的一些實(shí)施方案中，所述藥劑優(yōu)選為對所述長非編碼RNA H19 進(jìn)行定向干擾的慢病毒質(zhì)粒。
[0014] 在本發(fā)明上述用途的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選構(gòu)建所述慢病毒質(zhì)粒所用的對所述長 非編碼RNA H19進(jìn)行定向干擾的核苷酸序列如下：
[0015] 正義鏈如SEQ ID NO:6所示；
[0016] 反義鏈如SEQ ID NO:7所示。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供能夠檢測長非編碼RNA H19表達(dá)的藥劑在制備用于 診斷癌癥發(fā)生或預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的診斷或預(yù)測試劑盒中的用途。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供能夠檢測癌細(xì)胞中的長非編碼RNA H19表達(dá)的藥劑 在制備用于檢測癌細(xì)胞的鉑類化療藥物耐藥性或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性的 檢測或診斷試劑盒中的用途。即，一般地，可以檢測癌細(xì)胞株或從癌癥患者獲得的腫瘤活檢 組織中長非編碼RNA H19的表達(dá)量，并將所得的量與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較，由此預(yù)測或預(yù)后 所述癌細(xì)胞和癌癥患者是否具有鉑類化療藥物耐藥性。
[0019] 就本發(fā)明的上述用途，所述藥劑選自對所述長非編碼RNA H19具有檢測特異性的 核苷酸探針或PCR引物。
[0020] 在本發(fā)明上述用途的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的對所述長非編碼RNA H19具有檢測 特異性的PCR引物的核苷酸序列優(yōu)選如下：
[0021] 正義鏈如SEQ ID NO:2所示；
[0022] 反義鏈如SEQ ID NO:3所示。
[0023] 本發(fā)明的再一個(gè)方面在于提供一種藥物組合物，包含前述的能夠減少和/或抑制 癌細(xì)胞中的長非編碼RNA H19表達(dá)的藥劑或者前述的能夠檢測癌細(xì)胞中的長非編碼RNA H19表達(dá)的藥劑。
[0024] 在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是