一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制 備，具體涉及一種具有結(jié)腸癌腫瘤識別功能的TCP-ι多肽與磁性氧化鐵納米粒子的結(jié)合， 制備出一種新型的多功能靶向性腫瘤分子影像探針，旨在提供一種無創(chuàng)性和靈敏的早期診 斷結(jié)腸癌的T2造影劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，造影劑輔助的核磁共振成像是目前腫瘤診斷的最好方法之一。但是由于 核磁共振成像內(nèi)在的低靈敏性以及造影劑的非特異性，導(dǎo)致腫瘤早期診斷較為困難。在過 去20年，已開發(fā)了各種無機材料作為造影劑。在眾多納米材料中，磁性納米粒子由于具有 良好的生物安全性、生物相容性以及表面的多功能性，已經(jīng)成為生物醫(yī)學中實際應(yīng)用最成 功的納米材料之一。
[0003] 氧化鐵納米粒子（Fe3O4或Fe2O 3)是一種網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對比劑，可用于肝、脾、淋 巴結(jié)、骨髓等富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的組織和器官的磁共振信號增強。通過被動傳遞機制，氧化 鐵納米粒子可以被細胞網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的選擇性攝取，從而能夠大大縮短在肝臟、脾和骨髓 的T2弛豫時間而被檢測到。到目前為止，全世界已經(jīng)有多種商品化氧化鐵納米顆粒造影劑 上市。
[0004] 構(gòu)建靶向性腫瘤分子影像探針，最重要的是發(fā)現(xiàn)及合成對某種特定腫瘤具有特異 性親和力的靶向分子。這種靶向分子需要能夠引導(dǎo)影像探針及藥物分子，甚至是納米顆粒 進入特定的細胞，而且必須要區(qū)分健康組織和患病組織。小于20個氨基酸的短肽是非常有 應(yīng)用前景的靶向性分子。
[0005] 因此，將多功能磁性納米顆粒與可以有效識別腫瘤的靶向性分子進行偶聯(lián)，進而 獲得可主動識別腫瘤的多功能磁共振分子影像探針，來有效實現(xiàn)對微小腫瘤的早期診斷， 已成為腫瘤MR成像診斷的一個重要的發(fā)展趨勢。
[0006] 本發(fā)明通過將具有結(jié)腸癌識別功能的TCP-I多肽與熒光染料偶聯(lián)后與磁性納米 載體結(jié)合，使磁性納米載體具有分子祀向性功能，研制一種針對結(jié)腸癌的早期診斷的新型 造影劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前結(jié)腸癌的特異性造影劑在臨床上還是空 白，針對這一迫切的需要，提供第一個無創(chuàng)性和靈敏的早期診斷結(jié)腸癌的T2造影劑。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0009] ( 一）合成炔基（Alkyne)修飾的 TCP-l_Cy5. 5
[0010] 將固相合成多肽TCP-ι側(cè)鏈標記Cy5. 5,然后N端脫保護后加入丙炔酸，在縮合劑 的作用下將N端修飾為炔烴。
[0011] (二）合成疊氮修飾的均一性Azide-SPIO
[0012] (1)合成氨基修飾的SPIO
[0013] 采用化學沉淀法制備Fe3O4納米粒子，將納米粒子與氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷混合 后，加入氨水，反應(yīng)24小時后得到氨基修飾的SPI0。
[0014] (2)合成疊氮修飾的 SPIO(Azide-SPIO)
[0015] 氨基修飾的SPIO與Azide-dPEG4-NHS混合反應(yīng)后，通過superdex200層析柱分離 純化，得到Azide-SPIO。
[0016] (三）炔基修飾的TCP-l_Cy5. 5與Azide-SPIO通過點擊化學偶聯(lián)
[0017] SPIO表面的疊氮與靶向多肽TCP-l_Cy5. 5的炔基通過點擊化學連接。將 Azide-SPIO 與過量革巴向多肽混合，加入 Bathocuproinedisulfonic acid(BCS)，CuSO4和 Sodium ascorbate，室溫反應(yīng)過夜。透析進行純化得到SPI〇-TCP-l_Cy5. 5。
【附圖說明】
[0018] 圖1 :多功能納米材料SPI0-TCP-1-Cy5. 5的合成示意圖。
[0019] 圖2 :炔基修飾的TCP-l_Cy5. 5的合成步驟示意圖。
[0020] 圖3 :合成疊氮修飾的SPIO示意圖。
[0021] 圖4 :炔基修飾的TCP-l_Cy5. 5與Azide-SPIO通過點擊化學偶聯(lián)示意圖。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明將就以下實施例作進一步說明，但應(yīng)了解的是，這些實施例僅為例示說明 之用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實施的限制。
[0023] 實施例1合成多功能造影劑SPI0-TCP-1-Cy5. 5
[0024] ( 一）合成炔基（Alkyne)修飾的 TCP-l_Cy5. 5
[0025] a)采用Fmoc化學固相多肽合成，使用溶脹性非常好的R丨nk AmideuChemMainxlv 樹脂，用5倍過量的Fmoc保護的氨基酸和縮合試劑（HBTU/HOBt)完成多肽序列。
[0026] b)將側(cè)鏈Mtt保護的賴氨酸（K)用1 %三氟乙酸（TFA)選擇性地脫保護，加入 Cy5. 5free acid，EDC和HOBt作為縮合試劑，室溫過夜反應(yīng)偶聯(lián)Cy5. 5。
[0027] c)多肽N端用20%哌啶（Piperidine)脫保護，加入丙炔酸（propiolic acid)，以 Ν，Ν' -二異丙基碳化二亞胺（DIC)為縮合試劑，將N端修飾為炔烴。
[0028] d)用95%的TFA(以及自由基清除劑）將多肽從樹脂上切割下來，用乙醚沉淀，得 到的粗肽用C18反相高效液相色譜法（RF-HPLC)分析并分離純化。然后將線性肽在空氣中 氧化形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過RF-HPLC和質(zhì)譜來證實，最終產(chǎn)品凍干和儲存在-20°C。詳細的合 成計劃如圖2所示。
[0029] (二）合成疊氮修飾的均一性Azide-SPIO
[0030] (1)合成氨基修飾的SPIO
[0031] 根據(jù)文獻報道的方法，采用化學沉淀法制備Fe3O4納米粒子。0. 73g FeCl 2和I. 97g ?冗13分別溶解于12. 5mL去離子水中，冷卻到4°C，待用。將25g葡聚糖（Dextran，T10)溶 解于50mL去離子水，冷卻到4°C并用氮氣脫氣1小時，加入FeCljP FeCl 3的水溶液。用磁 力攪拌器攪拌，同時滴加28%氨水15mL，升溫至90°C，反應(yīng)1小時，得到黑褐色懸濁液。冷 卻后離心，棄去沉淀。將上清液放置透析袋中透析24小時（截留分子量IOOkD)。通過改變 反應(yīng)條件，可制備不同粒徑的氧化鐵納米粒子。
[0032] 將透析后的產(chǎn)物與25 %的IOM氫氧化鈉和33 %環(huán)氧氯丙烷混合24小時后，加入 25%氨水，再反應(yīng)24小時后得到氨基修飾的SPI0。
[0033] (2)合成疊氮修飾的 SPIO(Azide-SPIO)
[0034] 如圖3所示，將氨基修飾的SPIO與Azide-ClPEG4-NHS混合（摩爾比1 :100)，溶解 于0.1 M磷酸鈉緩沖液（pH9)中，反應(yīng)8小時后，通過superdex200層析柱分離純化，得到 Azide-SPIO0
[0035] (三）炔基修飾的TCP-l_Cy5. 5與Azide-SPIO通過點擊化學偶聯(lián)
[0036] SPIO的表面的疊氮與靶向多肽TCP-l_Cy5. 5的炔基通過點擊化學連接（圖4)。 將 Azide-SPIO 與過量革巴向多肽混合，加入 5mM Bathocuproinedisulfonic acid (BCS)，ImM CuS<VFP5mM Sodium ascorbate，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析（截留分子量100KD) 進行純化，除去未反應(yīng)的多肽和其他小分子反應(yīng)物，得到SPI0-TCP-1-Cy5. 5。
[0037] 實施例2合成多功能造影劑SPIO-TCP-1-ATT0 590
[0038] 合成步驟如實施例1相同，熒光染料為ATTO 590,得到新型多功能造影劑 SPIO-TCP-1-ATT0 590〇
[0039] 以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完 全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的變更及修改。本項發(fā)明的技術(shù)性 范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法，其特征在于，將染料標記后的結(jié)腸 癌腫瘤祀向多肽與磁性納米載體結(jié)合，通過近紅外染料Cy5. 5標記TCP-I多肽，并將N端 修飾為炔基，合成炔基修飾的TCP-1-Cy5. 5,然后合成疊氮修飾的均一,性氧化鐵納米粒子 (Azide-SPIO)，最終將兩者通過點擊化學偶聯(lián)制備多功能造影劑（SPI0-TCP-1-Cy5. 5)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法，其特征在 于，所述多肽為TCP-I為環(huán)狀多肽CTPSPFSHC，這個多肽序列在體內(nèi)可以特異性地結(jié)合結(jié)腸 腫瘤新生的血管細胞（CD31 +陽性細胞）。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法，其特征在 于，所述磁性納米載體為氧化鐵納米粒子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法，其特征在 于，所述結(jié)合方法為點擊化學偶聯(lián)，具體將多肽N端修飾為炔基，SPIO表面修飾疊氮。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結(jié)腸癌核磁共振多功能造影劑的制備方法。將染料標記后的結(jié)腸癌腫瘤靶向多肽(TCP-1)與磁性納米載體結(jié)合，一方面具體通過Cy5.5有機染料標記TCP-1多肽，并將N端修飾為炔基，合成炔基修飾的TCP-1-Cy5.5。另一方面，合成疊氮修飾的均一性氧化鐵納米粒子(Azide-SPIO)，最終將兩者通過點擊化學偶聯(lián)制備多功能造影劑(SPIO-TCP-1-Cy5.5)。本發(fā)明研制一種針對結(jié)腸癌的早期診斷的新型造影劑，TCP-1將引導(dǎo)納米粒子特異性地結(jié)合并進入腫瘤的新生血管細胞，用磁共振顯影聯(lián)合遠紅外熒光成像將可以實現(xiàn)小至幾個毫米的早期腫瘤檢測。
【IPC分類】A61K49/14
【公開號】CN105126127
【申請?zhí)枴緾N201510660787
【發(fā)明人】王建浩, 李進晨, 柳麗, 蔣鵬舉, 邱琳, 楊麗, 樊杰, 程永江, 吳昊, 董冰玉, 孫凱, 謝雨佳, 蔣雨
【申請人】常州大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年10月14日