(A，右），Acl〇-HC-LS/LC-GGGS-LS (B，左）和 AC10-HC-LS/LC-GGGGS-LS (B，右）結(jié) 合。反應(yīng)產(chǎn)物在變性還原性SDS-PAGE凝膠上按大小進(jìn)行分離。通過將凝膠置于UV箱中來令 卩11^可視化。所用的分選酶4濃度為 ：第1、8、15、22道：25 1^;第2、9、16、23道：12.5 1^; 第3、10、17日、24道：6.25 1^;第4、11、18、25道：3.13 1^;第5、12、19、26道：1.56 1^;第 6、13、20、27 道：0? 78 yM ;第 7、14、21、28 道：0? 39 yM。
[0077] 圖12 :分選酶A介導(dǎo)的mAb AClO與vc-PAB-MMAE毒素的重鏈結(jié)合ADC的疏水作 用色譜（HIC)分析，該分析能夠區(qū)分未反應(yīng)的底物（藥物抗體比例DARO = 0)，兩個(gè)重鏈之 一被結(jié)合（藥物抗體比例DARl = 1)的底物，和兩個(gè)經(jīng)修飾的重鏈均被結(jié)合（藥物抗體比 例DAR2 = 2)，如圖所示。圖A顯示了標(biāo)準(zhǔn)的分選酶A介導(dǎo)的HC修飾AClOmAb的結(jié)合反應(yīng) 后的HIC分布，其中可檢測(cè)仍為DARO和DARl的種類，旁邊是期望的DAR2產(chǎn)物。圖B顯示 了圖A中的ADC制劑經(jīng)過4輪StrepTactin?親和純化柱分析后的HIC分布。
[0078] 圖13 :對(duì)以合成Gly5修飾的a -鵝膏蕈堿毒素（a)和以Gly 5修飾的美登素毒素 (b)的分析。圖a和b中，所述合成結(jié)構(gòu)顯示于上方，所述五個(gè)甘氨酸由框高亮顯示。下方 提供了各化合物的質(zhì)譜法和反相HPLC分析結(jié)果。a)Gly 5修飾的a-鵝膏蕈堿毒素的預(yù)期 分子量為1302. 07道爾頓，所觀察到的分子量為1325. 38道爾頓，對(duì)應(yīng)于Ms+Na+。RP-HPLC 分布表明純度>95%。b)Gly5修飾的美登素毒素的預(yù)期分子量為991. 41道爾頓，所觀察到 的分子量為957. 69道爾頓，對(duì)應(yīng)于Ms+Na+。RP-HPLC分布表明純度>95%。
[0079] 圖 14 :已由 Concortis 公司（San Diego, CA, U. S.)合成（結(jié)構(gòu) 1_6、9)的或可以合 成（結(jié)構(gòu)7&8)的5xGlycine(Gly5)修飾的毒素的結(jié)構(gòu)，表明任何毒素均可被功能化并用于 分選酶介導(dǎo)的酶促結(jié)合，只要毒素連接5個(gè)甘氨酸（如此處所示），或大于或等于一個(gè)甘氨 酸的任何數(shù)目甘氨酸殘基。甘氨酸修飾的毒素既可以合成為含有附加的經(jīng)驗(yàn)證的連接子/ 間隔子結(jié)構(gòu)，如圖14a中的結(jié)構(gòu)1-3所示，從而可能加入某些附加功能（例如，在某些亞細(xì) 胞區(qū)室中的剪切能力），也可以合成為不具有附加的連接子，如圖14b中的結(jié)構(gòu)4-6所示。 如果指定毒素處有幾個(gè)可用的反應(yīng)性基團(tuán)，例如，在a -鵝膏蕈堿毒素的情況下，甘氨酸殘 基可被添加到所述不同基團(tuán)，如圖14c中的結(jié)構(gòu)7-9所示。
[0080] 圖15 :實(shí)施例12中測(cè)定的腫瘤體積。所述結(jié)果表明，采用相同的抗體和毒素部分 的分選酶結(jié)合ADC，具有與市售的化學(xué)結(jié)合的仿的腫瘤殺傷活性。
[0081] 圖16 :實(shí)施例13中所述的用考馬斯蘭染色的凝膠。該數(shù)據(jù)顯示了意想不到的發(fā) 現(xiàn)，即，由分選酶A介導(dǎo)的在粗細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體結(jié)合反應(yīng)與使用純化抗體具有 同樣的效率。
【具體實(shí)施方式】
[0082] 本申請(qǐng)公開了一種用于制備免疫配體/效應(yīng)分子結(jié)合物的方法，包括將效應(yīng)分子 通過序列-特異性轉(zhuǎn)肽酶或其催化域與免疫配體結(jié)合。
[0083] 在本申請(qǐng)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述效應(yīng)分子和/或免疫配體
[0084] a)完全由蛋白或肽組成
[0085] b)包含至少一種蛋白或肽結(jié)構(gòu)域，或
[0086] c)包含至少一種肽鏈，
[0087] 且進(jìn)一步地，蛋白或肽或域優(yōu)選地包含能夠由序列-特異性轉(zhuǎn)肽酶或其催化域檢 測(cè)到的氨基酸序列。
[0088] 這意味著，例如，在效應(yīng)分子和/或免疫配體是蛋白的情況下，這意味著所述蛋白 的N-或C-端包含能被序列-特異性轉(zhuǎn)肽酶檢測(cè)的氨基酸序列。若原蛋白缺乏所述氨基酸 序列，可以通過本領(lǐng)域已知重組方法將其融合到所述蛋白的N-或C-端。
[0089] 在效應(yīng)分子和/或免疫配體不是蛋白的情況下，所述能被序列-特異性轉(zhuǎn)肽酶檢 測(cè)的氨基酸序列可以通過本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法與前者結(jié)合。
[0090] 可以在特異性轉(zhuǎn)肽酶識(shí)別序列和效應(yīng)分子之間插入其他功能。這可以通過內(nèi)吞入 細(xì)胞后分類為可斷鍵（例如包含腙，或二硫化物化學(xué)，或胞內(nèi)蛋白酶特異性肽序列）或不可 斷鍵（例如，包含硫醚化學(xué)）的化學(xué)結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。
[0091] 包含腙化學(xué)的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)溶酶體中選擇性地?cái)噫I（pH低于全身血 液循環(huán)）。
[0092] 肽連接子具有被溶酶體蛋白酶（例如組織蛋白酶-B)選擇性斷裂的潛力，且與 腙連接子對(duì)比，其已經(jīng)展現(xiàn)出增加的血清穩(wěn)定性和提高的抗腫瘤效果。.纈氨酸-胍氨酸 (Val-Cit)對(duì)是最常用的肽連接子，并理想地適合用于阿里他汀類藥物，例如單甲基阿里 他汀 E (MMAE)。
[0093] 不可斷鍵連接肽連接子長(zhǎng)期受到忽視，因?yàn)檠芯空邆兿嘈艛嚅_連接子是釋放藥物 的最合理方法。但是，結(jié)合物可以在與膜受體結(jié)合時(shí)快速內(nèi)吞，且一旦內(nèi)吞，免疫配體可以 分解到可令效應(yīng)分子，例如藥物，暴露出來的程度。舉一個(gè)突出的例子，硫醚連接子，使用 SMCC(N-琥珀酰亞胺基-4_(N-馬來酰亞胺甲基）_環(huán)己烷-1-羧酸酯）連接子（圖。
[0094] 所有這些方法的共同之處在于不存在真正的連接反應(yīng)位點(diǎn)特異性。因?yàn)檫B接子 介導(dǎo)的化學(xué)結(jié)合時(shí)隨機(jī)過程，連接子介導(dǎo)的效應(yīng)分子化學(xué)連接會(huì)得到結(jié)合蛋白的不均一混 合物，其在療效和/或診斷潛力上均可能不同。顯然，蛋白_效應(yīng)分子結(jié)合物的混合物也 對(duì)治療結(jié)合物的監(jiān)管審批過程帶來了顯著挑戰(zhàn)，因?yàn)榕伍g差異和/或活性藥學(xué)成分差異 (API)由于潛在安全隱患而導(dǎo)致了監(jiān)管部門的負(fù)面看法。
[0095] 不可斷鍵連接肽連接子長(zhǎng)期受到忽視，因?yàn)檠芯空邆兿嘈艛嚅_連接子是釋放藥物 的最合理方法。但是，結(jié)合物可以在與膜受體結(jié)合時(shí)快速內(nèi)吞，且一旦內(nèi)吞，免疫配體可以 分解到可令效應(yīng)分子，例如藥物，暴露出來的程度。舉一個(gè)突出的例子，硫醚連接子，使用 SMCC(N_琥珀酰亞胺基-4_(N-馬來酰亞胺甲基）_環(huán)己烷-1-羧酸酯）連接子（參見圖 14a，結(jié)構(gòu) 2)。
[0096] 所有這些方法的共同之處在于不存在真正的連接反應(yīng)位點(diǎn)特異性。因?yàn)檫B接子 介導(dǎo)的化學(xué)結(jié)合時(shí)隨機(jī)過程，連接子介導(dǎo)的效應(yīng)分子化學(xué)連接會(huì)得到結(jié)合蛋白的不均一混 合物，其在療效和/或診斷潛力上均可能不同。顯然，蛋白_效應(yīng)分子結(jié)合物的混合物也 對(duì)治療結(jié)合物的監(jiān)管審批過程帶來了顯著挑戰(zhàn)，因?yàn)榕伍g差異和/或活性藥學(xué)成分差異 (API)由于潛在安全隱患而導(dǎo)致了監(jiān)管部門的負(fù)面看法。
[0097] 本申請(qǐng)的又一優(yōu)選實(shí)施例中，免疫配體/效應(yīng)分子結(jié)合物中包含的免疫配體至少 選自以下一種：至少選自以下一種
[0098] 抗體，修飾抗體形式，抗體衍生物或片段，和/或
[0099] 擬抗體。
[0100] 優(yōu)選地，在此實(shí)施例中，通過小于13個(gè)氨基酸的肽與小分子效應(yīng)分子結(jié)合，得到 用作序列-特異性轉(zhuǎn)肽酶底物的小分子效應(yīng)分子，由此其可通過轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合到含有可由所 述轉(zhuǎn)肽酶識(shí)別的C端修飾的單克隆抗體的C端。所述C端修飾可以包含在兩條重鏈中，或 兩條輕鏈中，或全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈中，從而允許以藥物-抗體比例2或4 (DAR2或DAR4) 生成位點(diǎn)特異性結(jié)合的ADC。
[0101] 本申請(qǐng)的又一優(yōu)選實(shí)施例中，免疫配體與至少一種選自以下的實(shí)體結(jié)合：
[0102] 受體，
[0103] 抗原，
[0104] 生長(zhǎng)因子，
[0105] 細(xì)胞因子，和/或
[0106] 激素。
[0107] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"受體"指的是細(xì)胞表面分子，優(yōu)選地為如下細(xì)胞表面分子 (i)結(jié)合特異性的信號(hào)分子或信號(hào)分子群（例如受體，例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體），和/ 或（ii)沒有已知配體（即孤兒受體，例如，HER2/neu)。天然受體表達(dá)在細(xì)胞群表面上，或 者它們僅僅具有所述分子的胞外域（無論所述形式是否天然存在），或在血漿或細(xì)胞或器 官內(nèi)執(zhí)行天然結(jié)合功能的可溶性分子。優(yōu)選地，所述受體是涉及特定致病過程的信號(hào)級(jí)聯(lián) 成員（例如，參與生長(zhǎng)因子信號(hào)級(jí)聯(lián)的受體），或者表達(dá)在參與病理過程的細(xì)胞或粒子（例 如癌細(xì)胞）表面上。
[0108] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"抗原"是指具有誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答且可包含表面蛋白或蛋 白復(fù)合物（例如，離子通道）的能力的物質(zhì)。很多時(shí)候，抗原與致病實(shí)體相關(guān)，例如癌細(xì)胞。
[0109] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"細(xì)胞因子"是指小細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)分子，其由許多細(xì)胞分 泌，且是一類廣泛用于胞內(nèi)通訊的信號(hào)傳導(dǎo)分子。細(xì)胞因子可以被分類為蛋白質(zhì)，肽，或糖 蛋白；術(shù)語"細(xì)胞因子"包含了大量和多樣化的調(diào)控因子家族，其在全身由多樣化胚胎起源 細(xì)胞產(chǎn)生。
[0110] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"生長(zhǎng)因子"涉及天然存在的能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞分 化的物質(zhì)。通常，生長(zhǎng)因子是蛋白質(zhì)或類固醇激素。生長(zhǎng)因子是用于調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程的 重要因子。
[0111] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"激素"涉及由體內(nèi)局部發(fā)出影響生物體其他部分細(xì)胞的信息 的細(xì)胞、腺或器官釋放的化學(xué)物質(zhì)。該術(shù)語包括肽激素，脂質(zhì)和磷脂衍生的激素（包括類固 醇激素），和單胺。
[0112] 若免疫配體結(jié)合受體或抗原，所述免疫配體效應(yīng)分子結(jié)合物可以例如被引導(dǎo)到一 個(gè)特異的位點(diǎn)，例如，到一個(gè)致病實(shí)體，例如癌細(xì)胞，向其遞送所述效應(yīng)分子，例如毒素或化 療劑。因此，毒素或化療劑的全身性毒性降低，而后者在作用位點(diǎn)的局部濃度增加，從而提 供更好的療效，而副作用降低。此外，相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)可被免疫配體的結(jié)合抑制。在效 應(yīng)分子是標(biāo)記的情況下，后者可以用來標(biāo)記特異位點(diǎn)，例如，通過免疫配體檢測(cè)以特定表面 抗原為特征癌細(xì)胞，用于診斷。
[0113] 若免疫配體結(jié)合生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，和/或激素，則所述免疫配體/效應(yīng)分子結(jié) 合物可以例如被引導(dǎo)到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或激素通常結(jié)合的位點(diǎn)，從而位點(diǎn)特異性地遞 送效應(yīng)分子。此外，相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)可由免疫配體的結(jié)合抑制。
[0114] 本申請(qǐng)所稱的術(shù)語"結(jié)合"是指本領(lǐng)域熟知的免疫配體（例如，抗體或抗體片段） 與它們的靶標(biāo)之間的相互作用或其它非隨機(jī)結(jié)合。優(yōu)選地，這種結(jié)合反應(yīng)的特征在于其高 特異性和/或標(biāo)靶靈敏度。優(yōu)選地，該結(jié)合反應(yīng)的特征在于解離常數(shù)（Kd) < 10 3M,優(yōu)選為 彡10 4M,彡10 5M,彡10 6M,彡10 7M,彡10 8M,彡10 9M,且最優(yōu)選為彡10 10。
[0115] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述序列特異性轉(zhuǎn)肽酶的至少一個(gè)催化域融合到免 疫配體或效應(yīng)分子的N端或C端。
[0116] 所述融合的發(fā)生可以通過重組工程或通過化學(xué)連接。在本實(shí)施例中，促成免疫配 體到效應(yīng)分子的位點(diǎn)特異性結(jié)合的酶活性，并不需要作為單獨(dú)的重組酶被加入到反應(yīng)中， 相反卻是待結(jié)合的蛋白底物的一部分。
[0117] 優(yōu)選地，所述序列特異性轉(zhuǎn)肽酶是選自下組中的至少一種：
[0118] 分選酶，或其一種或多種片段或衍生物；
[0119] 分裂內(nèi)含肽，或其一個(gè)或多個(gè)片段或衍生物。
[0120] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)肽酶是分選酶，作為分選酶結(jié)合底物的該效應(yīng)分子 (例如，毒素）優(yōu)選通過加入少量的甘氨酸氨基酸殘基，優(yōu)選3或5個(gè)甘氨酸殘基，來得到。
[0121] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，其中該轉(zhuǎn)肽酶是分裂內(nèi)含肽，例如Ssp GyrB的分裂內(nèi) 含肽，作為分選酶結(jié)合底物的所述效應(yīng)分子，例如毒素，是通過加入少于13個(gè)氨基酸殘基 的GVFVHN-SXn序列得到的，X是任何氨基酸，n是0彡和彡5之間的整數(shù)。
[0122] 現(xiàn)有技術(shù)中（Panowski et al. (2014))尚未記載使用轉(zhuǎn)肽酶（優(yōu)選為分選酶和分 裂內(nèi)含肽）令小分子量毒素與全長(zhǎng)抗體結(jié)合來制備抗體藥物結(jié)合物。
[0123] 分選酶已在各種革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌，鏈球菌和肺炎球菌物種中被 鑒定發(fā)現(xiàn)，并在體內(nèi)催化致病因子與細(xì)胞壁蛋白聚糖的結(jié)合，以改變細(xì)菌表面特征從而逃 避被感染宿主的有效免疫應(yīng)答（Mazmanian et al. (1999))。
[0124] 革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的分選酶A(sortase A)首先得到表征（Ton-That et al. (1999))，其后進(jìn)一步成為多種蛋白修飾中的工具 (Tsukiji(2009))〇
[0125] 分選酶的有益特征之一在于，兩個(gè)待結(jié)合分子可以僅需要短肽標(biāo)記（"分選酶標(biāo) 記")，其中對(duì)于金黃色葡萄球菌的分選酶A是，例如，在一個(gè)分子的C端（例如，效應(yīng)分子） 的LPXTG，和在另一分子的N端（例如，免疫配體，參見圖1)的一個(gè)3至5個(gè)氨基酸甘氨酸 短鏈。這些肽標(biāo)記可通過常規(guī)的交聯(lián)化學(xué)方式融合或結(jié)合到分子。這一方面允許利用該系 統(tǒng)連接兩種蛋白，另一方面也可用于結(jié)合小分子量化合物，優(yōu)選小分子量的毒素蛋白。對(duì)于 金黃色葡萄球菌的分選酶B的情況，各分選酶基序是NPQTN。
[0126] 內(nèi)含肽最初作為蛋白內(nèi)含子被發(fā)現(xiàn)，它能夠通過斷開肽鍵并形成新肽鍵來將自己 移除（剪接）出前體蛋白（Xu et al. (1993))(圖2a)。
[0127] 天然和人造分裂內(nèi)含肽包括，該內(nèi)含肽編碼區(qū)已經(jīng)被分成N-內(nèi)含肽域和C-內(nèi)含 肽域，其可以連接到不同的蛋白或肽，其連接方式使得隨后的外顯肽域的反式剪接（圖2b) 導(dǎo)致兩種蛋白的結(jié)合。
[0128] 分裂內(nèi)含肽就此被用于N-外顯肽和C-外顯肽部分的共價(jià)結(jié)合，也可用于蛋白的 純化和/或環(huán)化（ElleUChe(2010))。本文所公開的一個(gè)實(shí)施例中，利用分裂內(nèi)含肽用于 小分子量化合物的結(jié)合，優(yōu)選為小分子量毒素和其他小分子標(biāo)記，其中小于13個(gè)氨基酸的 C-外顯肽短肽序列被連接到任何尺寸的分子上，類似于分選酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽所要求的甘氨酸 氨短鏈。
[0129] 對(duì)于分選酶而言，將甘氨酸短鏈的（>2個(gè)甘氨酸殘基）添加到所選分子足以使分 子被結(jié)合到含有五肽分選酶識(shí)別基序（例如像金黃色葡萄球菌分選酶A的LPXTG)的免疫 配體。對(duì)于分裂內(nèi)含肽而言，包含來自Ssp GyrB的6個(gè)氨基酸的短C-內(nèi)含肽（GVFVHN)和 短C-外顯肽（這里：SAGSGK)的最低限度12氨基酸GVFVHNSAGSGK氨基酸短鏈，足以修飾 任何效應(yīng)分子，優(yōu)選為小分子量毒素，以用于通過分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)結(jié)合到含有Ssp GyrB分 裂內(nèi)含肽N-內(nèi)含肽域等免疫配體上（Volkmann et al. (2009))。還可以使用其他功能性內(nèi) 含肽域可以降低到〈13個(gè)氨基酸長(zhǎng)的小肽段的分裂內(nèi)含肽。
[0130] 即使在文獻(xiàn)中分裂酶并不總是稱為酶，但其卻具有此功能，因?yàn)槠浯呋姆磻?yīng)導(dǎo) 致肽鍵的斷裂和新肽鍵的形成，因此可以被看作是轉(zhuǎn)肽酶，因?yàn)楝F(xiàn)有肽鍵的能量被轉(zhuǎn)移到 了新的肽鍵。
[0131] 除了化學(xué)結(jié)合，轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的結(jié)合發(fā)生在生理緩沖水溶液和生理溫度的條件下， 從而最低限度地影響結(jié)合反應(yīng)中蛋白或抗體的完整性。此特征可確保所制得的結(jié)合物的最 佳功能。
[0132] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，包含在免疫配體/效應(yīng)分子結(jié)合物的效應(yīng)分子 是選自下組中的至少一種：
[0133] 標(biāo)記物；
[0134] 加工標(biāo)簽，和/或
[0135] 藥物。
[0136] 本申請(qǐng)所稱術(shù)語"標(biāo)記物"（也稱為"檢測(cè)標(biāo)記"），可以指包含一種或多種適當(dāng)?shù)?化學(xué)物質(zhì)或酶的任何分子或部分，其在化學(xué)，物理或酶促反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的 化合物或信號(hào)。
[0137] 本申請(qǐng)所稱術(shù)語"加工標(biāo)簽"，可以包括親和標(biāo)記，增溶標(biāo)記，色譜標(biāo)記和表位標(biāo) 記。親和標(biāo)記（也用作純化標(biāo)記）被附加到蛋白上，從而能夠使用親和技術(shù)從其粗生物源中 純化被標(biāo)記分子。這些包括幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（CBP)，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn) 移酶（GST)。聚（組氨酸）標(biāo)記，優(yōu)選為6xHis標(biāo)記，是一種廣泛使用的加工標(biāo)簽，它與金屬 基質(zhì)結(jié)合。增溶標(biāo)記用于，特別是對(duì)于表達(dá)分子伴侶缺失物種（如大腸桿菌）中的重組蛋 白，以協(xié)助蛋白的正確折疊并防止其析出。這些包括硫氧還蛋白（TRX)和聚（NANP)。某些 親和標(biāo)記有作為增溶劑（如MBP)和GST的雙重作用。
[0138] 色譜標(biāo)記用于改變蛋白的色譜特性，以提供特異性分離技術(shù)的不同精度。通常，這 些包括聚陰離子氨基酸，如FLAG標(biāo)記。
[0139] 表位標(biāo)記是因?yàn)槟軌蛟谠S多不同的物種中可靠地產(chǎn)生高親和力抗體而被選定的 短肽序列。表位標(biāo)記通常來自病毒基因，這解釋了它們的高免疫反應(yīng)。表位標(biāo)記包括，例如， V5標(biāo)記，MYC標(biāo)記和HA標(biāo)記。這些標(biāo)記在免疫印跡，免疫熒光和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中特別有用， 但它們也可用于蛋白純化中。
[0140] 加工標(biāo)簽還有許多其他用途，如特異性酶修飾（如生物素連接酶標(biāo)記）和化學(xué)修 飾（FLAsH)標(biāo)記。通常，使用組合標(biāo)記以對(duì)蛋白進(jìn)行多功能修飾。
[0141] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記物是選自下組中的至少一種：
[0142] 放射性標(biāo)記，優(yōu)選為放射性標(biāo)記的肽或蛋白；
[0143] 熒光標(biāo)記，優(yōu)選為熒光肽或蛋白，和/或
[0144] 酶標(biāo)記，優(yōu)選過氧化物酶。
[0145] 所述對(duì)作為效應(yīng)分子的潛在標(biāo)記物的列舉絕不是限制性的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 例中，所述藥物是選自下組中的至少一種：
[0146] 細(xì)胞因子；
[0147] 放射性試劑；
[0148] 抗炎藥；
[0149] 毒素，和/或
[0150] 化療劑。
[0151] 所述對(duì)作為效應(yīng)分子的的潛在藥物的列舉絕不是限制性的。本申請(qǐng)所稱"細(xì)胞因 子"是指由許多細(xì)胞分泌并且作為一類廣泛用于細(xì)胞間通信的信號(hào)傳導(dǎo)分子的細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)小蛋白分子。細(xì)胞因子可以被分類為蛋白質(zhì)，肽，或糖蛋白；術(shù)語"細(xì)胞因子"包含了大量 和多樣化的調(diào)控因子家族，其在全身由多樣化胚胎起源細(xì)胞產(chǎn)生。在本申請(qǐng)上下文中，細(xì)胞 因子用于例如削弱甚至殺死致病實(shí)體，例如癌細(xì)胞。
[0152] 本申請(qǐng)所稱術(shù)語"放射性試劑"涉及具有至少一個(gè)含不穩(wěn)定核的原子的實(shí)體，該實(shí) 體容易因此經(jīng)歷放射性衰變，放射y射線和/或亞原子粒子（如a或0粒子），從而具 有細(xì)胞殺傷效果。在本申請(qǐng)上下文中，放射性藥劑是為了削弱甚至殺死致病實(shí)體，例如癌細(xì) 胞。
[0153] 本申請(qǐng)所稱術(shù)語"抗炎藥"涉及減少炎癥的化合物。這可以是，例如，類固醇，如特 異性糖皮質(zhì)激素（通常被稱為糖皮質(zhì)激素），其通過結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體減少炎癥或腫脹。 該術(shù)語還包括非留體抗炎藥（NSAID)，其拮抗環(huán)氧合酶（COX)的酶。就其本身而言，COX酶 合成前列腺素，產(chǎn)生炎癥。在總體上，NSAIDs的防止前列腺素合成，從而減少或消除疼痛。 該術(shù)語還涵蓋免疫選擇性抗炎衍生物（ImSAIDs)，它是一類改變炎癥細(xì)胞的激活和迀移的 肽，炎癥細(xì)胞是負(fù)責(zé)放大炎性反應(yīng)的免疫細(xì)胞。
[0154] 本申請(qǐng)所稱"毒素"術(shù)語涉及一種對(duì)活細(xì)胞或有機(jī)體有毒的分子。毒素可以是肽， 或蛋白或優(yōu)選為小分子量化合物，其用于削弱甚至殺死致病實(shí)體，例如癌細(xì)胞。毒素，如本 文所意指，尤其包括蜂窩毒素。優(yōu)選地，所述毒素是一種小分子毒素，即，具有< 2500道爾 頓的分子量。
[0155] 本申請(qǐng)所稱術(shù)語"化療劑"涉及具有抑制腫瘤特別是惡性（癌性）病變（例如癌， 肉瘤，淋巴瘤，白血?。┑陌l(fā)展或進(jìn)展的功能性質(zhì)的分子?？拱﹦┗蚧焺┩ǔ＞哂幸种妻D(zhuǎn) 移或血管生成的性質(zhì)。化療劑可以是細(xì)胞毒性劑或化療劑。優(yōu)選地，所述化療劑是小分子 量細(xì)胞抑制劑，其抑制或壓制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或繁殖。
[0156] 將細(xì)胞因子、放射性劑、毒素或化學(xué)治療劑與免疫配體結(jié)合，可以幫助減少副作用 和給藥相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)椋?br>[0157] a)該免疫配體引導(dǎo)結(jié)合物到特異性位點(diǎn)，例如，到致病實(shí)體，如癌細(xì)胞，其中效應(yīng) 分子影響其毒性作用。因此，效應(yīng)分子的全身性毒性降低，而后者則在作用部位的局部濃度 增加，從而提供更好的療效和較低的副作用。
[0158] b)可以令該結(jié)合物內(nèi)吞入致病實(shí)體中，由此效應(yīng)分子在內(nèi)吞后釋放，才開始發(fā)展 其期望的細(xì)胞毒作用，即不影響