陰影顯示）的抗體hBU12人 IgGlV H-CH重鏈編碼區(qū)域）：



[0286] 用于帶Ssp GyrB 11分裂內(nèi)含肽的N-內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域標(biāo)記的hBU12抗人⑶19抗體 的PCDNA3. 1-hygro (+) IgL鏈表達(dá)載體的完整DNA序列如下：
[0287] SEQ ID NO 22 (帶有C端Ssp GyrB 11分裂內(nèi)含肽N-內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域、6xHi s標(biāo)記 和strepll標(biāo)記（下劃線）以及HindIII和NotI克隆位點（陰影顯示）的抗體hBU12人 IgGlV t-Ct k輕鏈編碼區(qū)域）：


[0289] SEQ ID NO 21和22所述的pcDNA3. l-hygro(+)表達(dá)載體能夠通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入哺乳 類細(xì)胞，例如但不限于，通常用于重組抗體表達(dá)、帶有添加至IgH和IgL鏈C端的分選酶A 標(biāo)記、6xHis標(biāo)記、Myc標(biāo)記和strepll的抗人0)19特異性人源化抗體hBU12的CHO細(xì)胞。
[0290] 實施例3 :重組金黃葡萄球菌分選酶A的克隆與表達(dá)
[0291] 金黃葡萄球菌分選酶A的ORF發(fā)表于Genbank數(shù)據(jù)庫中，可以索引號AF162687. 1 查找。該記錄下的氨基酸序列顯示為SEQ ID NO 23 (金黃葡萄球菌分選酶A的氨基酸序 列）。

[0293] 該Genbank索引對應(yīng)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 24所示：
[0295] 重組分選酶A酶促活性片段在大腸桿菌中的表達(dá)的相關(guān)技術(shù)信息，包括攜帶 6xHis標(biāo)記的氨基酸60-205 (公開于參考文獻(xiàn)W02007/108013A2中）。攜帶6xHis標(biāo)記的 金黃葡萄球菌分選酶A (aa60_205)的編碼區(qū)域如下SEQ ID NO 25所不：
[0297] SEQ ID NO 25 翻譯為氨基酸序列 SEQ ID NO 26 :
[0299] SEQ ID NO 25所示的6xHis標(biāo)記的金黃色葡萄球菌分選酶A片段的編碼區(qū)域， 可以被克隆到標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌表達(dá)載體中，例如像pET29 (Novagen)中，以轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 BL21(DE3) (Novagen)中，并根據(jù)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法生成可以用于細(xì)菌生產(chǎn)重組分選 酶A的大腸桿菌克隆?？傊?，分選酶A pET29表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)可以在 37 °C下以LB培養(yǎng)基與50 y g/mL卡那霉素培養(yǎng)，直到OD6。。為0. 5-0. 8 =為止。然后可加入 IPTG至0. 4mM終濃度，并在30°C下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)三小時。然后可以通過離心收獲細(xì)胞，重 懸于裂解緩沖液（50mM Tris，pH值8. 0,300mM NaCl，補(bǔ)充有ImM的氯化鎂，2單位/mL DNA 酶I (NEB)，260nM納米抑肽酶，I. 2 y M亮肽素和ImM PMSF)。然后可以通過超聲處理來裂解 細(xì)胞，并可以按照制造商的說明進(jìn)行操作，用Ni-NTA瓊脂糖純化澄清的上清液。
[0300] 根據(jù)SDS-PAGE判斷純度>90%的部分可以合并并用Tris緩沖鹽水（25mM Tris pH 值7. 5,150mM NaCl)透析，并使用已發(fā)表的消光系數(shù)17, 420M1Cm1從A 2S。測量值計算酶濃 度。根據(jù)上述實驗方案，制備ca. 20mg>90 %純度的金黃色葡萄球菌分選酶A重組酶促活性 片段（ca. 17kD)，重組蛋白的SDS-PAGE和免疫印跡分析如圖7所示。
[0301 ] 實施例4 :分選酶標(biāo)記或N-內(nèi)含肽標(biāo)記的重組抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)和純化
[0302] a)CHO細(xì)胞表達(dá)：實施例2和3中公開了，從表達(dá)結(jié)構(gòu)表達(dá)重組IgGl抗體，可以 使用例如市售的CHO表達(dá)體系通過瞬時轉(zhuǎn)染來實現(xiàn)，如使用購自Invitrogen的FreeStyle CHO體系，根據(jù)FreeStyle CHO廠商說明的指示進(jìn)行。
[0303] 簡言之，轉(zhuǎn)染前約1天，CHO細(xì)胞應(yīng)在搖瓶中的FreeStyle CHO培養(yǎng)基中以 5-6X 106個細(xì)胞/ml接種，令其在加濕的接種孵化器中，軌道搖動器120rpm、37°C和7. 5% 二氧化碳氛圍的條件下擴(kuò)增。次日，當(dāng)所述細(xì)胞到達(dá)I. 2-1. 5xl06/ml密度時，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 然后根據(jù)需要將細(xì)胞稀釋到I X 106細(xì)胞/ml。隨后需要取30ml所述細(xì)胞懸浮液，加入到 125ml搖瓶中，并向600iil OptiPro SF-培養(yǎng)基（Invitrogen)中加入40iig 1:1混合的 IgH和IgL表達(dá)質(zhì)粒DNA。同時，需要向600 yl OptiPro SF-培養(yǎng)基（Invitrogen)中加入 40 y I Freestyle MX轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混合兩個試樣，并在室溫下培養(yǎng)10分鐘，以允許形成 DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。然后，可以從上方將DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物緩慢加入到125ml CHO細(xì) 胞培養(yǎng)基中，隨后令轉(zhuǎn)染細(xì)胞在軌道搖動器120rpm、37°C和7. 5%二氧化碳氛圍的條件下 生長6天。
[0304] 此后，可收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液并通過本領(lǐng)域（ELISA，Luminex公司等）已知適當(dāng) 方法進(jìn)行抗體表達(dá)滴度分析。
[0305] b)蛋白A純化：可使用市售蛋白A瓊脂糖柱（Thermo Fisher, Pierce)，按照廠商 說明，從CHO細(xì)胞上清液進(jìn)行重組抗體的蛋白A純化。
[0306] 簡言之，取澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，過適當(dāng)大小和容量并用PBS平衡的蛋白A柱。 殘留培養(yǎng)基用PBS洗滌，且最終結(jié)合的IgG可以用低pH緩沖液洗脫，如pH為3. 0的0.1 M檸 檬酸-氫氧化鈉。洗脫的IgG應(yīng)立即用l/10th體積的pH7. 41M Tris/Cl中和。含IgG的 合并組分隨后可以在4°C下以PBS透析過夜。
[0307] 實施例4中提供的實驗方案向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了從實施例1和2中公開的結(jié) 構(gòu)中制備足量的純化重組抗體的方法。
[0308] 實施例5 :通過分選酶和分裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽作用生成位點特異性C端MMAE毒 性效應(yīng)分子結(jié)合單克隆抗體
[0309] 如下式所示的，連接到長5個氨基酸的甘氨酸短鏈和長6個氨基酸的SSP GyrB SllC-內(nèi)含肽分裂內(nèi)含肽的單甲基阿里他汀毒素，可以從合格的化學(xué)CRO公司定制訂購。
[0311] 式1:以vcPAB連接子進(jìn)行5-甘氨酸修飾的MMAE :
[0312] Me =甲基（-CH3)基團(tuán)
[0313] G=甘氨酸殘基
[0314]
[0315] 式2:攜帶vcPAB連接子以6氨基酸C-內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域GVFVHN和6氨基酸SAGSGK C-外顯肽修飾的MMAE :
[0316] Me =甲基（-CH3)基團(tuán)
[0317] GVFVHNSAGSGK = Gly-Val-Phe-Val-His-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Lys 短鏈
[0318] a) LPETG分選酶A基序標(biāo)記的重組IgG抗體的毒性MMAE效應(yīng)分子結(jié)合反應(yīng)
[0319] 五甘氨酸修飾的MMAE毒性效應(yīng)分子與LPETG分選酶A標(biāo)記IgGl抗體（可以根 據(jù)實施例1和4制備）的結(jié)合，可以用生理培養(yǎng)緩沖液（例如5mMTris/Cl，15mM NaCl，6mM CaCl2, pH 8. 0)，通過混合適當(dāng)比例的LPETG標(biāo)記的IgGl抗體和式1公開的甘氨酸修飾的 MMAE毒素（例如，1 :1比例和50 y M的濃度）和重組分選酶A(根據(jù)實施例3制備）（例如， 5 y M濃度），并在37°C至40°C下培養(yǎng)至少2小時。
[0320] 可以在停止反應(yīng)后，用抗His標(biāo)記和/或抗strepll標(biāo)記抗體通過免疫印跡分析 或ELISA分析6xHis標(biāo)記和/或strepll標(biāo)記來監(jiān)測結(jié)合效率。
[0321] 可以通過鎳-NTA柱或streptactin柱結(jié)合來富集完全結(jié)合產(chǎn)物，，所述柱分別結(jié) 合6xHis標(biāo)記或str印II標(biāo)記，所述標(biāo)記僅可存在于不完全反應(yīng)的IgGl底物中。最終的 IgG-效應(yīng)分子結(jié)合物最后可以如上所述使用蛋白A純化來進(jìn)行純化。
[0322] b) SSP GyrB SI IN-內(nèi)含肽標(biāo)記的重組IgG抗體與的毒性MMAE效應(yīng)分子的結(jié)合
[0323] SSP GyrB SllC-內(nèi)含肽氨基酸修飾的MMAE毒性效應(yīng)分子與N-內(nèi)含肽標(biāo)記的 IgGl抗體（可以通過以下實施例2和4制備）的結(jié)合，可用生理培養(yǎng)緩沖液（20mM Tris/ Cl，250mM NaCl，lmM EDTA，pH 8. 5)，混合適當(dāng)比例的N-內(nèi)含肽標(biāo)記的IgGl抗體與式2公開 的C-內(nèi)含肽氨基酸修飾的MMAE毒素（例如，比例為1:10或1 :25, IgG抗體濃度為5 y M)， 并在室溫下或在37°C下培養(yǎng)至少4個小時。
[0324] 可以在停止反應(yīng)后，用抗His標(biāo)記和/或抗strepll標(biāo)記抗體通過免疫印跡分析 或ELISA分析6xHis標(biāo)記和/或strepll標(biāo)記來監(jiān)測結(jié)合效率。
[0325] 可以通過鎳-NTA柱或streptactin柱結(jié)合來富集完全結(jié)合產(chǎn)物，，所述柱分別結(jié) 合6xHis標(biāo)記或str印II標(biāo)記，所述標(biāo)記僅可存在于不完全反應(yīng)的IgGl底物中。最終的 IgG-效應(yīng)分子結(jié)合物最后可以如上所述使用蛋白A純化來進(jìn)行純化。
[0326] 總之，以上公開的實施例1-5允許本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明中所述的，通 過分選酶A介導(dǎo)或裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽作用，進(jìn)行毒性效應(yīng)分子與C端的位點特異性酶促 結(jié)合。
[0327] 實施例6 :制備在輕鏈或重鏈上攜帶C端GS (甘氨酸-絲氨酸）連接子、LPETG分 選酶基序和附加的6x-His和Strep II親和純化標(biāo)記的曲妥單抗
[0328] 基本根據(jù)實施例1所述，生成編碼單克隆抗體曲妥單抗（Tras)重鏈和輕鏈的抗體 表達(dá)結(jié)構(gòu)，其中抗體無標(biāo)記（SEQ ID N0s:31-34)或C端攜帶GS(甘氨酸-絲氨酸）連接子、 LPETG分選酶基、和6x-His和Str印II標(biāo)記（SEQ ID NOs:35-38)。使用上述表達(dá)結(jié)構(gòu)，通 過與相應(yīng)表達(dá)結(jié)構(gòu)的共轉(zhuǎn)染，在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)Tras-HC-GS-LHS和Tras-LC-GS-LHS (HC = 重鏈，LC =輕鏈，GS =甘氨酸-絲氨酸，LHS = LPETG標(biāo)記+6xHis標(biāo)記+strepll標(biāo)記）。 Tras-HC-GS-LHS是輕鏈未修飾（SEQ ID NO :35-36)且重鏈C端具有GS (甘氨酸-絲氨酸） 連接子、LPETG分選酶基序、6xHis標(biāo)記和str印II標(biāo)記（SEQ ID NO :33-34)的曲妥珠單抗變 體。Tras-LC-GS-LHS是重鏈未修飾（SEQ ID NOs :31-32)且輕鏈C端具有GS (甘氨酸-絲 氨酸）連接子、LPETG分選酶基序、6xHis標(biāo)記和str印II標(biāo)記（SEQ ID NOs:37-38)的曲妥 珠單抗變體。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和通過蛋白A瓊脂糖層析法對抗體的親和純化，基本如實施例 4所述。
[0329] 實施例7:曲妥珠單抗輕鏈或重鏈與Gly5修飾DMl毒素的分選酶A介導(dǎo)結(jié)合
[0330] 在含每種單克隆抗體（mAb)各10. 5mg的Ix分選酶緩沖液（25mM Tris-HCl, pH8. 2 ;150mM NaCl ;7. 5mM CaCl2)中，進(jìn)行包含 Gly5-修飾的 DMl 毒素（購自 Concortis, San Diego, CA, U. S?，結(jié)構(gòu)如圖14a所示）和金黃葡萄球菌的17kD重組分選酶片 段（參見實施例3)的結(jié)合反應(yīng)，如下表1I所示。Tras-HC-GS-LHS在25°C下培養(yǎng)2小時； Tras-LC-GS-LHS結(jié)合反應(yīng)在25°C下培養(yǎng)18小時。每種反應(yīng)混合物隨后通過Strep-TactinK) 瓊脂糖柱（IBA Life-Sciences, :Odttixxgen，Germany)。為此，取 Iml Strep-Tactin 瓊脂 糖通過重力裝入多孔柱中，并以2柱體積的平衡緩沖液（IOOmM Tris-HCl，pH 8.0;150mM NaCl ;lmM EDTA)進(jìn)行平衡。每種結(jié)合混合物利用重力流經(jīng)過同一柱兩次（以增加樹脂上 的停留時間）。然后用又一柱體積的平衡緩沖液洗滌樹脂，以最大化結(jié)合物產(chǎn)率，然后將合 并組分立即裝入蛋白A柱。為此，使用10柱體積緩沖液（25mM磷酸鈉，pH 7.5)來平衡Iml 蛋白A HiTrap柱。令每種結(jié)合反應(yīng)物通過平衡后的柱，然后用5柱體積的緩沖液洗滌柱。 使用5柱體積的洗脫液（0.1 M琥珀酸，pH 2. 8)來洗脫結(jié)合的結(jié)合物，收集其中1柱體積部 分（收集在含有25% v/v IM Tris Base的試管中以中和酸）并分析其蛋白含量。將含蛋 白質(zhì)組分合并，并通過G25柱色譜法進(jìn)行制劑。為此，使用適用于每一種生產(chǎn)規(guī)模的NAP 25 柱，來對結(jié)合物制劑以供長期存儲。平衡所述柱，裝載，并以根據(jù)廠商說明，以IOmM pH 5.0 琥珀酸鈉，lOOmg/mL海藻糖，0. 1 % % w/v聚山梨醇酯20 (Kadcylak(T-DMl)的制劑緩沖 液，由Roche/Genentech銷售）洗脫。
[0331] Tras-HC-GS-LHS 和 Tras-LC-GS-LHS 的 DMl 結(jié)合體產(chǎn)率分別為 8.Omg (76. 2% )和 5. 9mg(56. 2%)。主要的過程損失發(fā)生在蛋白A和G25純化中，大多因為為了保證用于每個 后續(xù)步驟或存儲的最大產(chǎn)物濃度而進(jìn)行的削峰。
[0332]
[0333]表 2:Tras-HC-GS-LHS和Tras-LC-GS-LHS的結(jié)合條件
[0334] 通過疏水作用色譜（HIC)分析藥物負(fù)載，其中使用了 TOSOH Butyl-NPR4. 6mm x 3. 5cm, 2. 5 y m 柱（流速 0? 8mL/min，A-L 5M(NH4)2S04, 25mM NaPi, pH = 6. 95±0. 05 和 B-75% 25mM NaPi, pH = 6. 95±0. 05, 25% IPA 之間的 12 分鐘線性梯度）。HIC 數(shù)據(jù)表明， 對于Tras-HC-GS-LHS和Tras-LC-GS-LHS而言，均無可檢測的剩余未結(jié)合單克隆抗體，且每 種單克隆抗體中的大部分均負(fù)載了 2個藥物（參見圖8)。
[0335] 實施例8:分選酶A介導(dǎo)的曲妥單抗-DMl結(jié)合物的體外毒性測試
[0336] 下面研究DMl-分選酶A介導(dǎo)結(jié)合Tras-HC-GS-LHS和DMl-分選酶A介導(dǎo)結(jié) 合Tras-LC-GS-LHS的毒性，并使用SKBR3細(xì)胞和T47D-5R細(xì)胞與Kadcylal((Roche/ Genentech)進(jìn)行比較；SKBR3細(xì)胞是一種人乳腺癌細(xì)胞系，其過度表達(dá)曲妥單抗同源抗原 (Tras) HER-2/neu ;T47D-5R細(xì)胞是一種乳腺癌細(xì)胞系，其對HER-2/neu的天然表達(dá)水平低， 并改造為缺失細(xì)胞表面ffiR-2/neu (Graus-Porta et al. (1995)。將細(xì)胞接種在96孔板中 的100 y 1完全DMEM培養(yǎng)基中（每孔10000個細(xì)胞）。培養(yǎng)一天后，小心地從每個孔中移 除50 y 1的培養(yǎng)基，，并替換50 y L以完全DMEM培養(yǎng)基稀釋的每種ADC的3. 5倍系列稀釋 液，得到的ADC濃度范圍為20 y g/ml至0. 25ng/ml。每種稀釋液一式兩份或一式三份。在 加濕培養(yǎng)箱中以37°C、5% 0)2額外培養(yǎng)3天后，將板從培養(yǎng)箱中取出，并平衡至室溫。約 30分鐘后，每孔中加入100 y ]CellTiter-G丨0?發(fā)光溶液（Promega公司，Cat. No G7570)， 以450rpm搖動5分鐘后，不搖動地培養(yǎng)10分鐘，然后使用Tecan Infinity F200以每孔 1秒的積分時間測量發(fā)光。所有三種ADC對過量表達(dá)HER-2/neu的SKBR3乳腺癌細(xì)胞系 均具有高度細(xì)胞毒性，但對ffiR-2/neu陰性的T47D-5R乳腺癌細(xì)胞系則不然（參照圖9)。 HER-2/neu陽性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3的EC5。值分別為：KMCyla?:，32. 4ng/ml ;DM1結(jié)合的 Tras-HC-GS-LHS，45. 6ng/ml ;Tras-LC-GS-LHS，51. 4ng/ml，因此在體外腫瘤細(xì)胞殺傷實驗 中的有效范圍相仿。與之相比，HER-2/neu陰性的乳腺癌細(xì)胞系T47D-5R中沒有可檢測的 特異性細(xì)胞毒性，表明當(dāng)比較相同靶向抗體和相同毒素（DMl)時，分選酶A酶促結(jié)合的ADC 與傳統(tǒng)的化學(xué)結(jié)合ADC的功能等同（圖9)。
[0337] 但是，Tras-HC-GS-LHS 和 Tras-LC-GS-LHS 的分選酶 A 介導(dǎo)結(jié)合 ADCs，其與 Kadcyla1^的DAR(ca. 3-4)相比相對較低的藥物-抗體比例（ca. 1. 80,通過圖8中的DARl 和DAR2峰值整合推導(dǎo)得來），并不等同在體外腫瘤細(xì)胞殺滅實驗中得到成比例差異的細(xì)胞 毒性（圖9)。這一出乎意料的發(fā)現(xiàn)可能的原因在于，分選酶A介導(dǎo)的毒素-抗體結(jié)合更具 有限定性和位點特異性，而與之相比，通過隨機(jī)化學(xué)結(jié)合得到的KMeyk?限定性較低。
[0338] 實施例9:通過改變插入抗體重鏈和輕鏈C端與分選酶A識別基序之間的不同間 隔肽長度對抗體重鏈和輕鏈與效應(yīng)分子的分選酶A介導(dǎo)結(jié)合進(jìn)行同步性優(yōu)化
[0339] 下面將研究抗體重鏈或輕鏈C端和LPETG分選酶A識別基序之間的間隔肽長度的 影響。為此，基本根據(jù)實施例1所述，克隆抗體重鏈和輕鏈的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其中編碼了在C-端 包含LPETG分選酶A識別基序和str印-II純化標(biāo)記（SEQ ID NOs :39-46)且包含或不包 含二氨基酸GS (甘氨酸-絲氨酸）間隔子的嵌合⑶30特異性單克隆抗體AclO的重鏈和 輕鏈（HC 序列來自 US 2008213289Al，Seql;LC 序列來自 US 2008213289Al，Seq9)。使用 所述表達(dá)結(jié)構(gòu)，通過與相應(yīng)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)單克隆抗體AcIO-HC-GS-LHS/ LC-GS-LHS 和 Acl〇-HC-LS/LC-LS。Acl〇-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS 是 AclO 變體，其重鏈和輕 鏈的C端各以GS間隔肽、LPETG分選酶A基序、6xHis標(biāo)記和str印-II標(biāo)記修飾（SEQ ID NOs: 39-42 ;表3)。Acl〇-HC-LS/LC-LS是AclO變體，其重鏈和輕鏈的C端各以LPETG分選酶 A基序、6xHis標(biāo)記和strep-II標(biāo)記修飾，但不含所述二肽GS連接子（SEQ ID NOs:43-46 ; 表3。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和通過蛋白A瓊脂糖層析法對抗體的親和純化，基本如實施例4所述。
[0340] 為了研究結(jié)合效率，使用分選酶A的系列稀釋液，進(jìn)行五甘氨酸修飾的 FITC(Gly 5-FITC，參見如下式3)的結(jié)合反應(yīng)。
[0341]
[0342] 式3 :五甘氨酸修飾的FITC (Gly5-FITC)
[0343] G =甘氨酸殘基
[0344] 為此，使用分選酶A在Ix分選酶緩沖液（25mM Tris-HCl, pH8. 2 ;150mM NaCl ; 7. 5mM CaCl2)中，將Gly5-FITC與2種AclO變體結(jié)合，如表4所示。42°C下反應(yīng)4小時后，通 過變性還原性SDS-PAGE凝膠電泳分析反應(yīng)物。將凝膠置于UV箱中以可視化FITC (圖10)。 與重鏈的結(jié)合效率高，無論重鏈C端和LPETG分選酶識別基序之間是否存在GS-連接子。 出乎預(yù)料地，分選酶A介導(dǎo)的輕鏈結(jié)合效率顯著低于分選酶A介導(dǎo)的重鏈結(jié)合效率。此外， 令人吃驚地，發(fā)現(xiàn)位于抗體輕鏈C端和LPETG分選酶識別基序之間的二肽GS (甘氨酸-絲 氨酸）間隔子，顯著影響了連接效率。當(dāng)存在GS-連接子時，與輕鏈的結(jié)合效率比重鏈低約 5-10倍，而不存在連接子時，效率則降低50-100倍。因此，可以推斷，增加輕鏈和LPETG分 選酶識別基序之間的間隔妝長度可能進(jìn)一步提尚結(jié)合效率。
[0345] 因此，下面將研究增加輕鏈和LPETG分選酶識別基序之間的間隔肽長度對結(jié)合效 能的影響?；靖鶕?jù)實施例1所述制備表達(dá)結(jié)構(gòu)，其中編碼了以2至5個氨基酸的連接子 (SEQ ID NO :47-54)在C-端標(biāo)記了 LPETG分選酶識別基序和str印-II純化標(biāo)記的單克 隆抗體AclO輕鏈