脂質(zhì)納米顆粒組合物以及制備和使用其的方法
【專利說明】脂質(zhì)納米顆粒組合物從及制備和使用其的方法
[oow] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2012年5月23日提交的美國臨時申請61/650, 729和2013年3月14 日提交的美國臨時申請61/784, 892(將所述臨時申請的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文） 的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明
[0004] 本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院授予的基金號R01CA135243、DK088076和CA152969下 由政府資助進(jìn)行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。 陽00引序列表
[0006] 本申請包含已通過EFS-web提交并且通過引用整體并入本文的序列表。于2013 年5月22日創(chuàng)建的ASCn副本被命名為604_54848_WQ_LIST_0SU-2013-246.txt，大小為 3, 490字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0007] 本公開內(nèi)容設(shè)及可用于遞送治療性組合物包括但不限于核酸（NA)的脂質(zhì)納米顆 粒（LN)。 陽00引發(fā)明背景
[0009] 脂質(zhì)體是由一個或多個脂雙層組成的小囊泡，其能夠運(yùn)載親水性分子（在含水核 屯、內(nèi)）或疏水性分子（在其脂雙層中）。如本文中所用，"脂質(zhì)納米顆粒"（LN)為描述亞微 米范圍內(nèi)的基于脂質(zhì)的顆粒的一般術(shù)語。LN可具有脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)特征和/或具有可選擇的 非雙層類型的結(jié)構(gòu)。利用LN通過全身性途徑進(jìn)行的藥物遞送需要克服幾個生理屏障。網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RE巧負(fù)責(zé)從循環(huán)清除LN。一旦逸出脈管系統(tǒng)并到達(dá)祀細(xì)胞，LN通常通過胞吞 作用被吸收，并且必須在酸性內(nèi)涵體條件中的降解之前將藥物釋放至細(xì)胞質(zhì)中。
[0010] 特別地，運(yùn)樣的核酸（NA)(包括siRNA和其它治療性寡核巧酸）的遞送是限制它 們用于臨床轉(zhuǎn)換（clinicaltranslation)的潛力的主要技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0011] 高效遞送媒介物的開發(fā)是寡核巧酸（〇腳治療劑的臨床轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵。期望LN制劑 應(yīng)當(dāng)能夠（1)保護(hù)藥物免受酶促降解；（2)橫穿毛細(xì)血管內(nèi)皮；(3)特異性到達(dá)祀細(xì)胞類型 而不引起過度免疫活化或脫祀細(xì)胞毒性；(4)促進(jìn)胞吞作用和內(nèi)涵體釋放；和（5)形成具有 膠體穩(wěn)定性和長膽存期的穩(wěn)定制劑。 陽〇1引發(fā)明概述
[0013] 本文中提供了可高效率封裝治療性寡核巧酸并且達(dá)到有效遞送的物理和生 物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)納米顆粒。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含具有叔胺和季胺頭基的 陽離子脂質(zhì)的組合。在某些實(shí)施方案中，除了脂質(zhì)W外，脂質(zhì)納米顆粒還包含小膚例如短桿 菌膚。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含RNA酶或DNA酶降解試劑例如蛋白酶K。還 提供了運(yùn)些實(shí)施方案的組合。季胺和叔胺-陽離子脂質(zhì)的組合（QTsome)、短桿菌膚（A、B、 C或D) (SPLN-G)和/或蛋白酶K化Ksome)的滲入增加了脂質(zhì)納米顆粒制劑的轉(zhuǎn)染率。
[0014] 在第一廣泛方面，本文中提供了包含叔胺和季胺-陽離子脂質(zhì)的組合的脂質(zhì)納米 顆粒。在某些實(shí)施方案中，叔胺-陽離子脂質(zhì)選自DODAP、DODMA、DC-CHOレN，N-二甲基十六 烷基胺或其組合。在某些實(shí)施方案中，季胺-陽離子脂質(zhì)選自DOTAP、DOTMA、DDAB或其組 合。在某些實(shí)施方案中，叔胺-陽離子脂質(zhì)的濃度低于總脂質(zhì)含量的50.0摩爾百分率。在 某些實(shí)施方案中，季胺-陽離子脂質(zhì)的濃度低于總脂質(zhì)含量的20. 0摩爾百分率。在特定實(shí) 施方案中，脂質(zhì)納米顆粒W選自45:0、5:40、15:30、22. 5:22. 5、30:15或40:5的摩爾比包含 脂質(zhì)DODMA和DOTMA。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒W選自90:10、70:30、50:50、30:70 或10:90的摩爾比包含脂質(zhì)DMHDA和DOTAP。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒封裝選自核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、放射性物 質(zhì)、治療劑、前藥、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、生物標(biāo)志物或其組合的分子。在某些實(shí)施方案中，封裝的分 子包括選自質(zhì)粒DNA、反義寡核巧酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其組合的核酸。在某 些實(shí)施方案中，治療劑或核巧酸的封裝率為20 %或更高。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒還包含陽離子聚合物。在具體的實(shí)施方案中，陽 離子聚合物選自：精胺、贓嗦、S精胺、四精胺、寡精胺、thermine、精脈、二精脈、S精脈、寡 精脈、腐胺、聚賴氨酸、聚精氨酸、分枝或直鏈類型的聚乙締亞胺和聚締丙胺。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒還包含融合膚。
[0018] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒具有小于300nm的直徑。
[0019] 在另一個廣泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直徑并且包含膚的脂質(zhì) 納米顆粒。在某些實(shí)施方案中，膚選自短桿菌膚A、B、C、D或S;JTS-1 ;蛋白酶K(PrK); trichorovin-Xlla;狂犬病病毒糖蛋白；白細(xì)胞介素-1P;HIV-化t;單純瘤疹病毒VP22蛋 白；及其組合。在某些實(shí)施方案中，膚包括抗生素。在特定實(shí)施方案中，抗生素選自短桿菌 膚A、B、C、D或S。在特定實(shí)施方案中，膚基本上由脂質(zhì)化（lipidated)JTS-l融合膚組成。 在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì)化（lapidated)JTS-1融合膚W總制劑的約0至約30摩爾百分率 存在。
[0020] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒還包含蛋白酶K。蛋白酶K可總制劑的約0 至約30摩爾百分率存在。
[0021] 在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒封裝選自核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、放射性物 質(zhì)、治療劑、前藥、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、生物標(biāo)志物或其組合的分子。在某些實(shí)施方案中，封裝的分 子包括選自質(zhì)粒DNA、反義寡核巧酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其組合的核酸。
[0022] 在另一個廣泛的方面本文中提供了包含DM酶或RNA酶降解試劑的脂質(zhì)納米顆 粒。在某些實(shí)施方案中，DNA酶或RNA酶降解試劑基本上由蛋白酶K組成。在某些實(shí)施方 案中，納米顆粒封裝選自核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、放射性物質(zhì)、治療劑、前藥、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、 生物標(biāo)志物或其組合的分子。在具體實(shí)施方案中，封裝的分子包括選自pDNA、反義寡核巧 酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其組合的寡核巧酸。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒 具有小于300nm的直徑。
[0023] 在另一個廣泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直徑并且包含如下物質(zhì)的 兩種或更多種的組合的脂質(zhì)納米顆粒：叔胺和季胺-陽離子頭基的混合物；抗生素；和DNA 酶或RNA酶降解試劑。在某些實(shí)施方案中，DNA酶或RNA酶降解試劑基本上由蛋白酶K組 成。在某些實(shí)施方案中，抗生素包括短桿菌膚A、B、C、D或S。
[0024] 本文中描述的脂質(zhì)納米顆粒制劑的任何制劑可包含聚乙二醇-脂質(zhì)綴合物。在某 些實(shí)施方案中，聚乙二醇-脂質(zhì)綴合物選自聚山梨醋80、TPGS、mPEG-DSPE、陽G-DMG。在某 些實(shí)施方案中，聚乙二醇-脂質(zhì)W低于約10.0摩爾百分率的濃度存在。在某些實(shí)施方案中， 脂質(zhì)納米顆粒還包含N，N-二甲基十六烷基胺。在具體實(shí)施方案中，N，N-二甲基十六烷基 胺W低于制劑的約60. 0摩爾百分率的濃度存在。
[00巧]在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒還包含能夠結(jié)合祀細(xì)胞或祀分子的配體。在某 些實(shí)施方案中，配體為抗體或抗體片段。在具體實(shí)施方案中，配體選自cRGD、含半乳糖部分、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸、低密度脂蛋白或表皮生長因子。
[00%] 在另一個廣泛的方面本文中提供了包含本文中描述的脂質(zhì)納米顆粒和藥學(xué)上可 接受的賦形劑的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或經(jīng)皮膚施用 藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，將藥物組合物制備為口服施用片劑、無菌溶液、無菌懸浮 液、凍干粉劑或栓劑。
[0027] 在另一個廣泛的方面，本文中提供了診斷或治療癌癥或傳染病的方法。方法包括 給有此需要的患者施用有效量的本文中描述的藥物組合物。
[0028] 附圖概述
[0029] 圖1 :SK-HEP-1細(xì)胞中蛋光素酶表達(dá)的下調(diào)。用通過LN遞送的蛋光素酶特異 性siRNA處理表達(dá)蛋光素酶的細(xì)胞，所述LN包含數(shù)種不同的叔胺值0DMA，DMA)和季胺 值0TMA，TMA)的組合（QTsome)。將Lipofectamine2000 化ipo2000)用作陽性對照。蛋光 素酶活性表達(dá)為相對于未處理的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
[0030] 圖2 :QTsome中的G3139對邸細(xì)胞中的Bcl-2表達(dá)的下調(diào)。評價了包含不同量 的DMHDA的QTsome。將Lipo2000用作陽性對照。通過RT-PCR測定相對于肌動蛋白的 Bcl-2mRNA表達(dá)，其中未處理的邸細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。 陽的1] 圖3 :W15:1的N:P凝聚了c-myb的SPLN-G的C電位。
[0032] 圖4 :在0%和20%的血清條件下用SPLN-G處理的SK-HEP-1細(xì)胞的活力。細(xì)胞 活力表達(dá)為相對于未處理的SK-HEP-1細(xì)胞的平均活力的百分?jǐn)?shù)。
[0033] 圖5 :使用SPLN-G遞送的蛋光素酶-SiRNA對SK-HEP-1細(xì)胞中的蛋光素酶表達(dá)的 下調(diào)。將Lipofectamine2000化ipo2000)用作陽性對照。蛋光素酶活性表達(dá)為相對于未 處理的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。 W34] 圖6 :使用加載有G3139 (針對Bcl-2的AS0)的SPLN-G對MCF-7細(xì)胞中的Bd-2 表達(dá)的下調(diào)。將Lipo2000用作陽性對照。通過RT-PCR測定相對于肌動蛋白的Bcl-2mRNA表達(dá)，其中未處理的MCF-7細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。
[0035] 圖7 :使用加載有G3139 (針對Bcl-2的AS0)的SPLN-G對邸細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的 下調(diào)。將Lipo2000用作陽性對照。通過RT-PCR測定相對于肌動蛋白的Bd-2mRNA表達(dá)， 其中未處理的邸細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。
[0036] 圖8:乳糖化對SPLN-G尺寸和C電位的影響。運(yùn)些通過無唾液酸糖蛋白受體 (ASGR)祀向肝和肝癌細(xì)胞。
[0037] 圖9 :通過蛋光素酶測定在表達(dá)蛋光素酶的SK-HEP-1細(xì)胞中評價無唾液酸糖蛋白 受體（ASGR)祀向和SPLN-G中的短桿菌膚。蛋光素酶活性表達(dá)為相對于未處理的細(xì)胞的百 分?jǐn)?shù)。
[0038] 圖10 :通過共聚焦顯微鏡觀察的SPLN-G的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。DAPI(藍(lán)色）用于對細(xì)胞的 細(xì)胞核染色。siRNA-切3(紅色）用于跟蹤siRNA的內(nèi)化。疊加顯示高百分?jǐn)?shù)的siRNA被遞 送至胞質(zhì)溶膠。 W39] 圖11 :通過流式細(xì)胞術(shù)觀察的封裝切3-siRNA的非祀向SPLN-G和乳糖化 SPLN-G(Lac-SPLN-G)的細(xì)胞吸收。
[0040] 圖 12 :Lac-SPLN-G-anti-miR-155 對SK-肥P-1 細(xì)胞中的miR-155 的下調(diào)。無序 對照（scrambledcontrol)miRNA(SC)用作陰性對照。通過RT-PCR測定相對于RNU她的 miR-155表達(dá)，其中未處理的SK-HEP-1細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。
[0041] 圖13 :不同的脂質(zhì)-對-siRNA(w/w)比率的Lac-SPLN-G-siRNA復(fù)合物的凝膠遷 移率變動分析。
[0042] 圖14 :使用具有L0R-1284 (祀向核糖核巧酸還原酶RNRR2亞單位的SiRNA)(購 自化armacon)的PrKsome對邸細(xì)胞中的RNRR2表達(dá)的下調(diào)。通過qRT-PCR測定相對于 肌動蛋白的RNRR2mRNA表達(dá)，其中未處理的邸細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。
[0043] 圖15A-B:不同血清條件下陽'Ksome對RNRR2表達(dá)水平的下調(diào)。圖15A顯不無血 清；圖15B顯示5%FBS。圖15C顯示10%FBS。通過實(shí)時RT-PCR測定相對于肌動蛋白的 RNRR2mRNA表達(dá)，其中未處理的邸細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。 W44] 圖16 :具有和不具有P巧的脂質(zhì)納米顆粒的細(xì)胞活力比較研究。細(xì)胞活力表達(dá)為 相對于未處理的KB細(xì)胞的平均活力的百分?jǐn)?shù)。
[0045] 圖17 :L0R-1284siRNA在血漿中的穩(wěn)定性研究。在72小時的時期內(nèi)在小鼠血漿中 溫育陽'Ksome制齊Ij，通過凝膠電泳顯現(xiàn)剩余的siRNA的相對量。
[0046] 圖18 :包含1:0. 3的siRNA:Pri((w/w)的hKsome的溫度依賴性C電位。
[0047] 圖19 :通過10%FBS培養(yǎng)基中的hKsome遞送的L0R-1284siRNA對RNRR2下調(diào) 的溫度依賴性效率。通過實(shí)時RT-PCR測定相對于肌動蛋白的RNRR2mRNA表達(dá)，其中未處 理的邸細(xì)胞用作mRNA表達(dá)的基線。
[0048] 圖20 :QTsome的作用機(jī)制。
[0049]圖 21 :SPLN-G的描述。
[0050] 圖22 :蛋白酶K包衣保護(hù)寡核巧酸免受存在于血清中的DNA酶和RNA酶降解。
[0051] 圖23 :具有JTS-1融合膚的SPLN-J和具有蛋白酶K包衣的LN的簡圖。
[0052]圖 24 :加載有anti-miR-221 的SPLN-G20 在MDA-MB-468 乳腺癌細(xì)胞中對p27/ kiplmRNA的上調(diào)。運(yùn)顯示SPLN-G20是用于遞送anti-miR的有效媒介物。P27/Kipl是 miR-221的祀。該上調(diào)表明miR-221功能的抑制。
[0053]圖 25 :BT-549 細(xì)胞的p27/Kipl中的SPLN-G20 轉(zhuǎn)染。
[0054]圖26 :BT-549細(xì)胞的邸a中的SPLN-G20轉(zhuǎn)染。 陽化5] 圖27 :Lac-D0PE(藍(lán)色）、DOPE(紅色）和乳糖醒酸（綠色）的FTIR光譜。 W56] 圖28A-B:Lac-GLN的表征：圖28A顯示具有不同程度的乳糖化的GLN的粒 度和C電位。每一個值代表5個測量的平均值+SD。圖28B顯示通過TEM顯示的 anti-miR-155-Lac-GLN的形態(tài)學(xué)。比例尺代表lOOnm。
[0057]圖29A-29B:Lac-GLN的表征：圖29A)Lac-GLB的膠體穩(wěn)定性。將Lac-GLN-anti-miR-155于4°C或25°C膽存，隨時間過去測量粒度。結(jié)果為3個單獨(dú)實(shí)驗(yàn) 的平均值。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖29B)anti-miR-155-Lac-GLN的血清穩(wěn)定性。將單獨(dú)的 anti-miR-155 或anti-miR-155-Lac-GLN與 50%FBS在 37°C混合 0虹、4虹和 12虹。隨后 利用凝膠電泳分析樣品。 陽化引 圖30 :包含anti-miR-155的化N和Lac-GLN的物理化學(xué)性質(zhì)。值為平均值±SD(n=5)。
[0059] 圖31 :包含切3-anti-miR-155的Lac-GLN和其它對照制劑在化pG2細(xì)胞中的細(xì) 胞吸收，如通過共聚焦顯微鏡測定的。
[0060] 圖32A-C:用GLN、Lac-GLN或利用20mM乳糖和1 %BSA預(yù)溫育的Lac-GLN處理 化pG2細(xì)胞。在FACS化libur流式細(xì)胞儀上測量巧光信號。圖32A顯示利用GLN或Lac-GLN 處理化pG2細(xì)胞。圖32B和圖32C分別顯示利用20mM乳糖和1 %BSA的預(yù)溫育對Lac-GLN 的影響。結(jié)果示于直方圖中，X和Y軸分別表示巧光強(qiáng)度和細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0061] 圖33A-33C:Lac-GLN和其它制劑的體外遞送。圖33A)包含Luci-siRNA的Lac-GLN 和其它對照制劑的體外遞送。用包含lOOnM的濃度的luci-siRNA的Lac-GLN轉(zhuǎn)染SK-肥P-1 細(xì)胞，進(jìn)行4虹，轉(zhuǎn)染后48虹評價蛋光素酶基因表達(dá)。結(jié)果為4個重復(fù)的平均值。誤差棒代表 標(biāo)準(zhǔn)差。圖33B)來自MTS分析的Lac-GLN的細(xì)胞毒性。結(jié)果代表平均值+SD。圖33C)包 含anti-miR-155的Lac-GLN和對照制劑的體外遞送。用包含lOOnM的濃度的anti-miR-155 的Lac-GLN轉(zhuǎn)染化pG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48虹評價miR-155表達(dá)。結(jié)果為3個重復(fù)的平均值。 誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。 W62] 圖34A-B:不同濃度的anti-miR-155處理對miR-155和祀基因表達(dá)的體外評價。 圖34A顯示不同濃度的anti-miR-155處理對miR-155表達(dá)的評價。用包含lOOnM或200nM anti-miR-155 的Lipofectamine2000 和Lac-GLN轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞，進(jìn)行 4虹，轉(zhuǎn)染后 48虹評 價miR-155表達(dá)。值代表平均值±SD(n= 3)。圖34B顯示miR-155祀向基因表達(dá)的評價。 在用陽性對照或包含lOOnM和200nManti-miR-155的Lac-GLN轉(zhuǎn)染化pG2細(xì)胞后48虹，評 價C/EBPP和F0XP3基因表達(dá)。結(jié)果為3個重復(fù)的平均值。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。 W63] 圖35A-35B:包含切5-anti-miR-155的化N和Lac-GLN的組織分布。在包含 切5-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的靜脈內(nèi)施用后4虹，從C57BL/6小鼠收集屯、臟、肺、 脾、腎和肝。通過IVIS成像系統(tǒng)測量切5巧光信號。
[0064]圖36A和36B:包含切3-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN在肝和其它器官中的共 聚焦顯微鏡檢查。圖36A顯示在包含切3-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的靜脈內(nèi)施用 后4虹，從巧7B1/6小鼠收集肝、肺和脾。在OlympusFVlOOOFilter共聚焦顯微鏡上顯現(xiàn) 切e3巧光信號。在圖36A中，紅色和黃色箭頭分別表示切4-anti-miR-155被肝細(xì)胞和枯否 細(xì)胞吸收。 W65] 圖37A-C:anti-miR-155處理對miR-155和祀基因表達(dá)的體內(nèi)評價。用包含 1. 5mg/kganti-miR-1