質(zhì)獲自AvantiPolar Lipids扣SA)或SigmaA1化ich(USA)并且在不進(jìn)行進(jìn)一步純化的情況下使用。將脂質(zhì) (卵憐脂酷膽堿：膽固醇：TPGS，15:35:5)與不同濃度的叔胺值MHDA)和季胺值0TMA) (90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 10:90 ;DMHDA:D0TMA)于 1. 0血小瓶中組合。添加額外的 乙醇W達(dá)到180yL的體積。隨后將其與420yLlOmM巧樣酸緩沖液組合W達(dá)到30%乙 醇的終濃度。W15:1的胺對(duì)憐酸鹽的比率（N:巧組合制劑與G3139(Genasense)0DN。 讓制劑溫育15分鐘，隨后用無(wú)血清RPMI1640 (Mediatech)稀釋至300yL的總體積。 Lipofectamine2000 (Invitrogen)用作陽(yáng)性對(duì)照，W相同的N:P將其與相同量的0DN組合， 并稀釋至相同的總體積。 陽(yáng)142]轉(zhuǎn)染前2地，將在37°C、5%C02氣氛下于RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的邸化eLa的亞 系）細(xì)胞104個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在96孔板中。將細(xì)胞生長(zhǎng)至大致80%的匯合， 除去含血清培養(yǎng)基。用70iiL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞，處理地。W-式4份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在完 成處理后，用IXPBS洗涂細(xì)胞，恢復(fù)含血清RPMI1640。完成處理后48h，分析細(xì)胞的Bd-2 下調(diào)。將實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)用于評(píng)價(jià)Bcl-2相對(duì)于肌動(dòng)蛋白的下調(diào)。如圖2 中顯示的，利用含DMHDA/DOTAP巧0/10摩爾比）的制劑的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致相較于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞Bd-2 表達(dá)的大于75%的下調(diào)。Lipofectamine?、單獨(dú)的DMHDA和單獨(dú)的D0TAP用作對(duì)照。W備 選比例存在的DMHDA/DOTAP的制劑顯示較低比率的轉(zhuǎn)染率。 陽(yáng)1創(chuàng)連施倆I3 陽(yáng)144]分析不同SPLN-G制劑的轉(zhuǎn)染率：SPLN-G50 (40:5:50:5的摩爾比的DMHDA、DOTAP、GRAM、TPGS)、SPLN-G35 (40:5:35:15:5 的摩爾比的DMHDA、DOTAP、 0^1、00口6、1口65)、8^^^-630(40:5:30:20:5 的摩爾比的01皿4、0(1^口、0尺八1、 00口6、1口65)、5口^^-620(40:5:20:30:5 的摩爾比的01皿4、0(1^口、0^1、00陽(yáng)、 TPGS)、SPLN-G10 (40:5:10:40:5 的摩爾比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS)和 SPLN-G0(40:5:50:5 的摩爾比的DMHDA、DOTAP、DOPE、TPGS)。所有脂質(zhì)購(gòu)自Avanti化lar Lipids扣SA)或SigmaA1化ich(USA),并且可無(wú)需進(jìn)一步純化的情況下使用。將脂質(zhì)和膚 溶解于乙醇中，W適當(dāng)?shù)谋壤M合W形成LN。添加額外的乙醇和巧樣酸緩沖液W獲得30% 的終乙醇含量。將2.Omg/mL的LN溶液與siRNA或0DNW15:1的N:P比組合，使其在室溫 下反應(yīng)15min，隨后進(jìn)一步稀釋。制劑的粒度在100與300nm之間的范圍內(nèi)變化。對(duì)于含短 桿菌膚的制劑，利用去離子水稀釋的并與c-myb0DN組合的制劑的C電位測(cè)量（圖3)顯 示了在5與15mV之間的范圍內(nèi)變化的C電位。運(yùn)與顯示高于35mV的C電位的陽(yáng)性對(duì)照 Lipofectamine2000形成鮮明對(duì)比。 陽(yáng)145]將在37°C、5% %氣氛下于補(bǔ)充有10%FBS和1%鏈霉素/青霉素的DMEM培養(yǎng) 基（GIBC0)中培養(yǎng)的SK-HEP-1細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，隨后W2x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在 96孔板中。將蛋火蟲蛋光素酶（GL2+GL3)siRNA與制劑WN:P15:1組合。使制劑與脂質(zhì) 制劑在室溫下組合15min，隨后用DMEM進(jìn)行稀釋。在無(wú)血清和20%血清的條件下測(cè)試轉(zhuǎn)染 率。除去培養(yǎng)基，用每孔70iiL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基替代所述培養(yǎng)基。處理細(xì)胞地，隨后用IXPBS 洗涂3次。處理后4化小時(shí)，通過(guò)MTS測(cè)定和蛋光素酶測(cè)定試劑盒分別分析細(xì)胞活力（圖 4)和蛋光素酶表達(dá)（圖5)。包含35%或更少的短桿菌膚的制劑在高血清轉(zhuǎn)染條件下顯示 比Lipofectamine2000更低的細(xì)胞毒性和更高的轉(zhuǎn)染率。 陽(yáng)146] 在MCF-7(邸陽(yáng)性乳腺癌）細(xì)胞中研究0DNG3139對(duì)Bcl-2的下調(diào)。在20%血清存 在的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將RT-PCR用于評(píng)價(jià)Bcl-2相對(duì)于肌動(dòng)蛋白的下調(diào)（圖6)。SLN-G20 相對(duì)于Lipofectamine2000顯示顯著的Bcl-2的下調(diào)。W重復(fù)方式（n= 3)在邸細(xì)胞中 重復(fù)該研究，如圖7中顯示的。
[0147] 連施倆I4
[0148] 通過(guò)使用邸C/N服交聯(lián)乳糖醒酸與D0PE(1:5:10:5，D0PE:LA:EDC:N服） 來(lái)形成乳糖化DOPE(L-D0P巧。將脂質(zhì)和膚（45:5:5:10:28:2:10摩爾比的 D0DAP:D0TAP:L-D0PE:DMG-PEG:短桿菌膚）在IXPBS中組合。用L-D0PE(用DOPE取代） 和/或短桿菌膚完成其它對(duì)照制劑。配制的LN的粒度（圖8)落在50至150皿之間。制 劑在30天的時(shí)期中顯示膠體穩(wěn)定性。LN的C電位（圖8)在-10與lOmV之間的范圍內(nèi)變 化。0DN加載效率的研究顯示超過(guò)75%的凝聚。
[0149] 將蛋光素酶測(cè)定法用于測(cè)定LLN在表達(dá)蛋光素酶的SK-HEP-1細(xì)胞中的祀向效率。 將在37°C、5%C〇2氣氛下于補(bǔ)充有10%FBS和1%鏈霉素/青霉素的DMEM培養(yǎng)基（GIBC0) 中培養(yǎng)的SK-HEP-1細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，隨后W2x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在96孔板中。 將蛋火蟲蛋光素酶（GL2+GL3)siRNA與制劑WN:P10:1組合。使制劑與脂質(zhì)制劑在室溫下 組合lOmin，隨后用DMEM進(jìn)行稀釋。在無(wú)血清、10%和20%血清的條件下測(cè)試轉(zhuǎn)染率。除 去培養(yǎng)基，用每孔70yL的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（siRNAlOOnM)替代所述培養(yǎng)基。處理細(xì)胞地，隨 后用IXPBS洗涂3次。處理后4化小時(shí)，通過(guò)蛋光素酶測(cè)定試劑盒分析蛋光素酶表達(dá)（圖 9)。包含短桿菌膚W及ASGR的制劑顯示比任一種單獨(dú)的LN修飾更高的轉(zhuǎn)染率。
[0150] 利用巧光顯微鏡檢查（圖10)和流式細(xì)胞術(shù)（圖11)分析LLN的吸收。將DAPI核 用于肝細(xì)胞癌（HCC)細(xì)胞，添加cy3-標(biāo)記的寡核巧酸W顯示細(xì)胞吸收。如通過(guò)巧光圖像顯 示的，ASGR祀向是siRNA和0DN至細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠的有效遞送所必需的。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù) 顯示祀向LLN與非祀向LLN之間約3. 3倍的差異，進(jìn)一步支持祀向遞送的有利方面。利用 RT-PCR評(píng)估LN-antagomir制劑對(duì)miR-155的下調(diào)（圖12)。實(shí)現(xiàn)了miR-155相對(duì)于RNU她 的約60%的下調(diào)。使用lOOnM anti-miR-155。 陽(yáng)巧1] 連施倆I5 陽(yáng)152] 將脂質(zhì)化0:35:5的摩爾比的DDAB、OTOL Tween 80)溶解于100%乙醇中。將 100yL的該溶液稀釋于900yL IX PBS中。將不同w/w比率的LN與L0R-1284(購(gòu)自化armacon的SiRNA) (0. lyg)組合W進(jìn)行凝膠遷移率變動(dòng)分析（圖13)。阻滯在 l:8(siRNA:LN)上發(fā)生。將LN與0.lyMSiRNA組合W進(jìn)行下調(diào)研究。使用肌動(dòng)蛋白（作 為對(duì)照）W及1:20和l:30(siRNA:LN)的w/w比率通過(guò)RT-PCR評(píng)估LN-siRNA11)1?-1281審。 劑對(duì)RNR R2的下調(diào)。在轉(zhuǎn)染之前2地，將在37°C、5% C〇2氣氛下于RPMI 1640培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)的KB細(xì)胞W 3. Ox 105個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板涂板在6孔板中。使細(xì)胞生長(zhǎng)至大致80% 的匯合，除去含血清培養(yǎng)基。用1000yL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞，處理地。在含10%血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。W-式S份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在處理完成后，用IX PBS 洗涂細(xì)胞，恢復(fù)含血清RPMI1640。在處理完成后48h，利用RT-PCR，W肌動(dòng)蛋白作為管家基 因來(lái)分析細(xì)胞的RNRR2表達(dá)水平。結(jié)果示于圖14中。對(duì)于l:30siRNA:LN制劑，發(fā)生顯著 的下調(diào)。 陽(yáng)153] 將先前步驟的LN(1:30,siRNA:LN)與不同量的用L0R-1284預(yù)混合的P巧組合，在 室溫進(jìn)行15min。轉(zhuǎn)染前2地，將在37°C、5%C〇2氣氛下于RBO1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的?。?腔癌）細(xì)胞W3.Ox105個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在6孔板中。將細(xì)胞生長(zhǎng)至大致80%的匯 合，除去含血清培養(yǎng)基。用1000yL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞，處理地。在含0%、5%和10%血 清的RPMI1640培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。W-式3份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在完成處理后，用IX PBS洗涂細(xì)胞，恢復(fù)含血清RPMI1640。完成處理后48h，利用RT-PCR分析細(xì)胞的RNRR2表達(dá) 水平，肌動(dòng)蛋白用作管家基因。結(jié)果示于圖15中。對(duì)于含血清培養(yǎng)基，0. 3:1 :LN-PrK:SiRNA LOR-1281的制劑相較于無(wú)P巧的制劑顯示顯著的下調(diào)。還在相同轉(zhuǎn)染參數(shù)下，利用含10% 血清的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞活力研究。LN和PrK-LN在處理的水平上都未顯示顯著的細(xì)胞毒性 (圖16)。PrK-siRNA復(fù)合物在血清中的保護(hù)作用通過(guò)在新鮮小鼠血漿中溫育LN-siRNA和 PrK-LN-siRNA復(fù)合物來(lái)進(jìn)行研究（圖17)。在制劑中包含P巧在3天的時(shí)期中相較于無(wú)保 護(hù)制劑顯示顯著的保護(hù)活性。 陽(yáng)154] 其它研究調(diào)查了PrK-LN的溫度效應(yīng)。將PrK、L0R-1284和LNW0. 3:1:30的重量 比通過(guò)滿旋組合，將其維持在4°C、18°C、37°C和55°C的溫度。測(cè)量形成的復(fù)合物的C電位 (圖18)。在18°C和37°C混合的復(fù)合物具有比在4°C和55°C混合的復(fù)合物高得多的C電 位。測(cè)試在不同溫度形成的復(fù)合物的體外活性。轉(zhuǎn)染前24h，將在37°C、5%C02氣氛下于RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的邸細(xì)胞W3x105個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在96孔板中。將細(xì)胞 生長(zhǎng)至大致80%的匯合，除去含血清培養(yǎng)基。用1000iiL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞，處理地。轉(zhuǎn) 染在含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行。W-式兩份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在處理完 成后，用IXPBS洗涂細(xì)胞，恢復(fù)含血清RPMI1640。完成處理后48h，利用肌動(dòng)蛋白作為管 家基因，通過(guò)RT-PCR分析細(xì)胞的RNPR2表達(dá)水平。結(jié)果示于圖19中。在較高溫度（37°C 和55°C)復(fù)合的制劑相對(duì)于在較低溫度形成的制劑顯示轉(zhuǎn)染率的少量增加。
[01巧]連施倆I6
[0156]研究了用于anti-miR至MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)的遞送的SPLN-G20。如上所述制備SPLN-G20。在轉(zhuǎn)染前2地，將MDA-MB-468(S陰性乳腺癌細(xì)胞）W2x104個(gè)細(xì)胞/cm2的 密度于補(bǔ)充有1%青霉素/鏈霉素和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中涂板在6孔板中。將 SPLN-G20與anti-miR-221組合W測(cè)定其上調(diào)miR-221的下游祀p27/Kipl(腫瘤抑制因子） 的能力。anti-miR-22!的序列如下：5'-gsasaacccagcagacaaugUsasgsCsU-Qiol-3'[沈QID NO. 1]。該序列包含2' -0-甲基-修飾的寡核巧酸（小寫字母）和硫代憐酸醋連接（S下 標(biāo)）W促進(jìn)反義寡核巧酸的核酸酶穩(wěn)定性。此外，疏水性部分（膽固醇（化〇1))至3'末端 的添加用于更好地促進(jìn)與脂質(zhì)納米顆粒制劑的締合。在20%血清存在的情況下，使用具有 50、100和250nManti-miR-221的SPLN-G20轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細(xì)胞。使處理進(jìn)行地，隨后 除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基（補(bǔ)充有10%FB巧替代所述培養(yǎng)基。讓細(xì)胞增殖額外的 4地，隨后開始RT-PCR。利用TRIzolReagent化ifeTechnologies)從細(xì)胞提取RNA，按照 制造商的說(shuō)明書，利用沒(méi)UperScript?III第一鏈合成系統(tǒng)化ifeTechnologies)產(chǎn)生 cDNA。隨后使用SYBRgreen(LifeTechnologies)和針對(duì)p27/kipl的引物（AlphaDM)(正向：5，CGTGCGAGTGTCTAACGG-3,[沈QIDNO. 2],反向：5，-CGGATCAGTCTTTGGGTC-3,[沈Q IDNO. 3])進(jìn)行RT-PCR。 陽(yáng)157]將P-肌動(dòng)蛋白（正向：5' -CGTCTTCCCCTCCATCG-3'[SEQIDNO. 4],反向： 5' -CTCGTTAATGTCACGCAC-3'）[沈QIDNO.引用作對(duì)照。如圖24中顯示的，mRNA通過(guò) SPLN-G/anti-miR-221的處理W劑量依賴性方式被上調(diào)數(shù)倍。 陽(yáng)15引 連施倆I7
[0159]如先前所述制備包含 40:5:20:30:5 的摩爾比的DMHDA、D0TAP、GRAM、DOPE、TPGS 的SPLN-G20 第 1 版（SPLN-G20vl)。還用DODAP和SoyPC(SPC)分別替代DMHDA和DOPE 來(lái)產(chǎn)生了SPLN-G20的第2版（SPLN-G20v2)。D0DAP也是叔胺，并且在轉(zhuǎn)染上比DMHDA得 到更好地表征。在該實(shí)施方案中，選擇用SPC替代輔助脂質(zhì)是因?yàn)榛贒OPE的制劑通常 因與血清蛋白的相互作用而顯示減小的體內(nèi)活性。將終組成設(shè)置在40:5:20:30:5值孤A P:D0TAP:GRAM:SPC:TPG巧的摩爾比。所有脂質(zhì)和膚購(gòu)自AvantiPolarLipidsOJSA)或 Sigma-Al化ichOJSA)，并且在無(wú)需進(jìn)一步純化的情況下使用。將脂質(zhì)和膚溶解于乙醇中，W 適當(dāng)?shù)谋壤M合。添加額外的乙醇和抑4. 0的巧樣酸緩沖液W達(dá)到30%的終乙醇含量。此 時(shí)，將2.Omg/mL的脂質(zhì)納米顆粒溶液與anti-miRW15:1的N:P組合，浸浴超聲處理5min， 并使其在室溫15分鐘W形成靜電復(fù)合物，隨后進(jìn)一步稀釋。制劑的粒度在100與200nm之 間的范圍內(nèi)變動(dòng)。
[0160]將Anti-miR-221與SPLN-G20V1和SPLN-G20V2W15:1的N:P組合。就miR-221 的下游離祀p27/kipl(牽設(shè)細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控的基因）和雌激素受體a(邸a,負(fù)責(zé)雌激素受 體的表達(dá)，從而負(fù)責(zé)對(duì)基于激素的療法的致敏的基因）的上調(diào)測(cè)試BT-549 (S陰性乳腺癌 細(xì)胞系）。轉(zhuǎn)染前24h，將細(xì)胞W2X104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度于補(bǔ)充有5%FBS和l%青霉素 /鏈霉素化ifeTechnologies)的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中涂板在6孔板中。轉(zhuǎn)染時(shí)，用含 20%血清的培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基。將20%血清用于模擬體內(nèi)的高血清條件。用適當(dāng)?shù)膶?duì)照或 基于加載了 250nManti-miR-221的SPLN-G的制劑在37°C轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行地。處理期結(jié)束 時(shí)，用IXPBS洗涂細(xì)胞2次。讓細(xì)胞增殖4地，隨后開始RT-PCR。利用TRIzol試劑化ife Technologies)從細(xì)胞提取RNA，按照制造商的說(shuō)明書，利用Superscript彼III第一鏈 合成系統(tǒng)(XifeTechnologies)產(chǎn)生cDNA。隨后使用SYBRgreen(LifeTechnologies)W 及針對(duì)p27/kipl和雌激素受體a的引物進(jìn)行RT-PCR。P-肌動(dòng)蛋白用作參照基因。如圖 25中顯示的，游離的anti-miR-221顯示最小的活性，然而SPLN-G20V1和SPLN-G20V2分別 顯示p27/Kipl的~1.75和~2. 5倍上調(diào)。對(duì)于邸a表達(dá)，觀察到相似的結(jié)果，如圖26中 顯示的。SPLN-G20V1上調(diào)邸a近3倍，而SPLN-G20V2上調(diào)邸a超過(guò)5倍。運(yùn)些數(shù)據(jù)顯示 SPLN-G20V2是體內(nèi)anti-miR遞送的特別有用的納米載體。
[0161] 連施倆I8
[0162] 合成包含乳糖醒酸（LA)、具有半乳糖部分和連接于憐脂的親脂性無(wú)唾液酸糖蛋白 受體（ASGR)祀向配體，將其滲入LNW用于anti-miR-155的肝特異性遞送。還將短桿菌 膚A滲入LNW促進(jìn)anti-miR的內(nèi)涵體釋放。該制劑在本文中稱為基于乳糖化短桿菌膚的 LN化ac-GLN)。在化pG2細(xì)胞和在小鼠中評(píng)價(jià)肝細(xì)胞祀向。研究了物理化學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞吸收、 體外和體內(nèi)遞送效率。
[0163] 1，2-二油酷基-3-二甲錠-丙烷值孤A巧和ka-二油酷基憐脂酷乙醇胺 值0口巧購(gòu)自4￥日111：1?〇1日1'1^1口1(13(41油日3161',41^;1,2-二肉豆違-3]1-甘油和甲氧基 聚乙二醇（DMG-PEG)購(gòu)自N0FAmericaCo巧oration巧lysian,MN) ;1-乙基-3-[3-二 甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸化物巧DC)和N-徑基班巧酷亞胺（N服）購(gòu)自Thermo Scientific(Rockford,IL)。單甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酷憐脂酷乙醇胺（mPEG-DSP巧 獲自GenzymeF*ha;rmaceuticals(Camb;ridge,MA)。膽固醇、乳糖醒酸、短桿菌膚A和所有其 它試劑購(gòu)自Sigma-Al化ich(St.Louis，M0)而無(wú)需進(jìn)一步純化。蛋火蟲蛋光素酶（GL2+GL3) siRNA(Luci-siRNA)(AM4629)、陰性無(wú)序?qū)φ眨ˋM17010)和Lipofectamine2000 購(gòu)自 Invitrogen(GrandIsland,NY)〇
[0164] Anti-miR-155(序列：5, -A*C*CCCUAUCACGAUUAGCAUU*A*A-3'（SEQIDNO. 6)，包 含硫代憐酸醋連接（*)和2' -〇-甲基）、切3標(biāo)記的anti-miR-155(切3-anti-miR-155)和 切5. 5標(biāo)記的anti-miR-155(切5. 5-anti-miR-15f5)由A1 地aDNA(Montreal,Canada)合成。 用于miR-155 (002623)和RNU她(001093)的實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定的hginan試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems(Carlsbad,CA)。 陽(yáng)1化]乳糖醒酸由EDC活化，并轉(zhuǎn)化成其N服醋，隨后將其與DOPE反應(yīng)W產(chǎn)生n-乳糖基（lactobionyl)-DOPE(Lac-DOP巧。在化XUS