治療萎縮癥或增加細胞生長的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及再生治療藥物領(lǐng)域，尤其是涉及肌細胞再生及減緩人體各種來源細胞程序性死亡的藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]以缺少細胞再生或細胞凋亡失調(diào)為特征的主要疾病有肌少癥和惡病質(zhì)。肌少癥有多個發(fā)病因素，但是，人們對其了解仍然很少，而肌少癥的后果，即失去自主感和出現(xiàn)代謝并發(fā)癥，是比較嚴重的公眾健康問題。老年人肌肉減少最明顯的代謝解釋是蛋白質(zhì)合成速率和降解速率之間不平衡，但是，也涉及其它原因，如不按比例增加的程序性細胞死亡(細胞凋亡)率、神經(jīng)退行性過程、同化激素分泌減少或敏感性(如胰島素、生長激素和性激素)、細胞因子分泌調(diào)節(jié)異常、炎癥事件響應(yīng)改變、營養(yǎng)攝入不充分及缺少運動。治療方案可以采用結(jié)合營養(yǎng)、鍛煉、激素、特異性同化藥物的多模方法，限制因年紀變大而患上肌少癥。但是，所有治療方法都存在嚴重的缺點，例如，激素和同化藥物通常具有嚴重的副作用。vonHaehling et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle (2010) 1:129-133 公開了肌少癥的共識定義。
[0003]肌少癥與缺乏體育鍛煉有關(guān)系。但是，僅僅通過體育鍛煉無法完全預(yù)防肌少癥。肌少癥治療方法的效果并不令人滿意。最常用的治療方法是施用與肌肉生長相互作用的激素，如睪丸素。遺憾的是，睪丸素可能引發(fā)心血管疾病或癌癥等副作用。
[0004]與癡呆癥一樣，肌少癥在老年人中比較常見，但是，年輕人中也有這種病癥。60-70歲人群肌少癥的患病率是5-11%，而80歲以上人群肌少癥的患病率是11-50%。據(jù)估計，未來30年內(nèi)患這種病的人數(shù)將達到2億人(Cruz-Jentoft A., Age and Ageing 2010,39)。
[0005]肌少癥不僅與年齡有關(guān)，而且臥床不起的患者、腫瘤患者或不進行體育鍛煉的人都存在顯著的肌肉組織減少。這些患者龐大的醫(yī)保費用、老年人口的快速增長以及年齡相關(guān)肌少癥的增加都要求找到一種有效治療肌少癥的方法。
[0006]惡病質(zhì)被定義為疾病引起的肌肉質(zhì)量和重量損失的身體消瘦?；疾±夏耆顺霈F(xiàn)惡病質(zhì)比較常見。此外，肌肉質(zhì)量損失是衰弱癥和肌少癥的特點。衰弱癥是由于強度減弱、步速減慢、體育活動減少、重量損失和衰竭引起的一種癥狀。因為其與肌肉質(zhì)量損失有關(guān)，因此，肌少癥和衰弱癥可以被歸為惡病質(zhì)的癥狀。
[0007]細胞凋亡描述了所謂的程序性細胞死亡，程序性細胞死亡是一種細胞被破壞的活動過程。這種破壞經(jīng)歷了某些具有特點的形態(tài)變化，如染色質(zhì)凝聚、細胞皺縮、膜起泡及凋亡小體形成。眾所周知的是，成年人體內(nèi)的細胞在細胞分裂和受控細胞死亡之間呈現(xiàn)完美平衡。細胞凋亡發(fā)生部位存在各種不同情況，例如，人體胚胎發(fā)育中手指和腳趾形成時，或細胞退化時，失去功能時與/或可能對動物有危險。細胞凋亡的特征在于受控的事件順序。首先的標志是染色質(zhì)凝聚、DNA-斷裂、蛋白水解酶表達及最終出現(xiàn)細胞破壞。可以采用不同的方法測定這些生化變化和形態(tài)變化，其中非常重要的一點是選擇能夠區(qū)分細胞凋亡和壞死的檢測方法，因為其中有些方法只能檢測通常的細胞死亡。
[0008]有證據(jù)表明，靶向肌核細胞凋亡提供了一種有效治療肌少癥的新手段(MarzettiE.et al.(2012)Gerontology 58/2:99-106)。由于肌肉細胞質(zhì)量損失是老年人面臨的嚴重問題，提供一種使這些患者重新獲得肌肉強度的治療方法非常重要。肌細胞損失亦稱為肌少癥。這種病目前沒有令人滿意的治療方法，誘導(dǎo)肌細胞生長可能是一種治療肌少癥的新方法。肌細胞損失是由于細胞分裂和受控細胞死亡(細胞凋亡)之間不平衡引起的。
[0009]本發(fā)明的目的是找到刺激細胞生長與/或減少細胞凋亡，治療各種消耗病的合適的藥物制劑和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供新型藥物SERF2用于此類治療。第一方面，本發(fā)明提供作為藥物使用的SERF2、編碼所述SERF2的核酸或表達SERF2的細胞。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防萎縮病或萎縮癥狀或細胞再生性治療或增加患者細胞生長的SERF2、編碼所述SERF2的核酸或表達SERF2的細胞。
[0011]本發(fā)明還提供一種增加干細胞或祖細胞增殖或降低所述細胞凋亡率的體內(nèi)或體外方法，包括對所述細胞施用SERF2或編碼所述SERF2的核酸。
[0012]第四方面，本發(fā)明提供一種包含SERF2或編碼SERF2的核酸的藥物組合物。所述組合物包括藥學(xué)上可以接受的載體或穩(wěn)定劑。
[0013]顯然，所有這些方面都彼此相關(guān)，是相當?shù)模械膬?yōu)選實施例與這些方面都等同相關(guān)。本發(fā)明的主題在權(quán)利要求書中進一步定義。
[0014]發(fā)明詳細說明
[0015]SERF2 (小EDRK-豐富因子2)是一種具有已知序列的蛋白質(zhì)，參見例如，Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫 PS4101 (人)、P84102 (小鼠)或 NCBI 數(shù)據(jù)庫 NP_001018118 (人蛋白)、NP_035484 (鼠蛋白)、NM_001018108 (人核苷酸)、NM_011354(小鼠核苷酸)。各亞型以保藏號 ΝΡ_001018118.1、ΝΡ_001186804.1、ΝΡ_001186805.1、ΝΡ_001186806.1 和ΝΡ_001186807.1在數(shù)據(jù)庫中保藏。過去，SERF2亦稱為H4F5rel (H4F5相關(guān)-SERF2與H4F5有 69%的序列是一致的，Scharf et al.nature genetics 20,1998:83-86)。SERF2 在 US2007/042392A1 (SEQ ID NO: 1143，EBI 數(shù)據(jù)庫保藏號 AGI32189)及 WO 2000/55351A1 (SEQID N0:1054，EBI數(shù)據(jù)庫保藏號AAB53514)進行了進一步的披露，這兩篇專利均通過引用而并入本專利中。SERF2 在 Van Ham Tjakko J et al., Cell, Vol.142, N0.4(2010), 601-612中，NCBI數(shù)據(jù)庫保藏號AAC63516進行了進一步披露)。
[0016]過去，對于SERF同源蛋白質(zhì)的功能能力存在不同的結(jié)果。有些文獻報道SERF通過淀粉樣蛋白質(zhì)聚集而存在有毒作用(例如，van Ham et al.Cell 142，2010:601-612)，而其它文獻報道描述了其通過在包涵體內(nèi)有毒蛋白質(zhì)沉積而起到保護作用。van Ham等描述的易聚集蛋白質(zhì)的纖維狀聚集體僅僅是神經(jīng)退行性疾病的標志，認識到這一點是非常重要的。
[0017]幾種神經(jīng)退行性疾病都與基因中的擴展三核苷酸序列CAG有關(guān)。由于CAG為氨基酸谷氨酰胺編碼，這些疾病統(tǒng)稱為多聚谷氨酰胺疾病。雖然不同多聚谷氨酰胺疾病涉及的基因(和蛋白質(zhì))幾乎沒有什么共同之處，但是，它們導(dǎo)致的疾病遵循的進程驚人的類似:如果擴展長度超過臨界值35-40，蛋白質(zhì)中谷氨酰胺重復(fù)數(shù)越大，疾病發(fā)病就越早，癥狀就越嚴重。這一事實表明，長度異常的谷氨酰胺束使其宿主蛋白質(zhì)毒害神經(jīng)細胞，而且，人們假設(shè)所有多聚谷氨酰胺疾病均通過共同的分子機制發(fā)展。細胞死亡的一個可能機制是谷氨酰胺長度異常的序列具有一種形狀，這種形狀阻止宿主蛋白質(zhì)折疊形成其正常形狀。多聚谷氨酰胺(PolyQ)疾病被歸為構(gòu)象神經(jīng)退行性疾病，與阿爾茨海默病和帕金森病一樣，它們是由于異常擴展的PolyQ延伸引起的。
[0018]利用多聚谷氨酰胺的計算機模型，結(jié)果表明，如果，以及只有如果，疾病中發(fā)現(xiàn)的多聚谷氨酰胺重復(fù)數(shù)的長度比臨界值長時，它才會獲得稱為螺旋的特別形狀。谷氨酰胺束的長度越長，形成螺旋的傾向性就越高。蛋白質(zhì)中多聚谷氨酰胺(PolyQ)的擴展導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集且與神經(jīng)退行性疾病中的細胞死亡有關(guān)。疾病的發(fā)病年齡與polyQ超出35-40個谷氨酰胺臨界值的插入長度有關(guān)。體外分離polyQ肽的聚集動力學(xué)亦表明存在類似的臨界-長度依賴性。利用分離PolyQ肽的計算機模擬，結(jié)果表明，聚集機制是單一 polyQ肽鏈從無規(guī)卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫新菪臉?gòu)象轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變在長度超過37個谷氨酰胺的肽中選擇性發(fā)生。明顯有毒的物質(zhì)-可溶低聚物-的產(chǎn)生-及其導(dǎo)致神經(jīng)元損害的能力取決于膜內(nèi)蛋白質(zhì)酶切的精確度。有些低聚物很小，溶解度足夠大，容易通過腦實質(zhì)擴散，影響突觸結(jié)構(gòu)和功能，從而最終影響神經(jīng)元的存活。
[0019]在系列實驗中，van Ham等(上文)試圖識別聚集體的修飾劑(M0AG-4/SERF作為秀麗隱桿線蟲中年齡-相關(guān)蛋白質(zhì)毒性的調(diào)控劑)。作者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)谷氨酰胺殘基的數(shù)量?40個殘基)，可以檢測蛋白質(zhì)聚集，當其在M0AG-4中引入點突變時，聚集減少。SERF蛋白質(zhì)家族成員似乎具有類似M0AG-4的功能。此外，SERF1/2過表達增加了鼠成纖維細胞中突變Huntington蛋白質(zhì)的聚集和細胞死亡。但是，盡管有這些有趣的發(fā)現(xiàn)，這篇文章的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了許多問題:
[0020]1.秀麗隱桿線蟲的功能研究通常并不能反映人類或哺乳動物的情況，例如，最近的研究表明，TCF蛋白質(zhì)的共活化劑相互作用比輔阻遏物相互作用具有更高程度的物種特異性，并且發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲和人TCF4穩(wěn)態(tài)核水平之間存在根本區(qū)別。另一個實例是一方面秀麗隱桿線蟲和果蠅導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)嚴重缺陷的unc-76突變體之間存在顯著差異，另一方面小鼠FEZl-/-敲除小鼠，并沒有顯示任何形態(tài)和任何強大的行為表型。
[0021]2.有文獻報道了 SERF蛋白質(zhì)家族具有保護作用而不是毒性作用。
[0022]3.M0AG4和SERF蛋白質(zhì)之間的AA-序列存在顯著差別(_50% )，因此，由于蛋白質(zhì)序列不同，功能也會不同。
[0023]4.最重要的是，采用了一種高度人工系統(tǒng)。僅僅在采用74個polyQ重復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染的細胞中(這是自然界中永遠無法實現(xiàn)的狀況)發(fā)生了聚集。此外，僅在采用淀粉樣蛋白質(zhì)時才看到聚集。因此，仍然有待了解在缺乏外源蛋白質(zhì)的情況下，是否存在M0AG4/SERF的任何天然功能。
[0024]盡管如此，在本發(fā)明的某些實施例中，需治療的疾病或癥狀并非選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈病，或任