有制劑儲存于2-8°C，然后與LAV現(xiàn)場混合。
[0133] 實施例8 測試具有rYF-DEN2嵌合減毒活病毒的制劑在佐劑和/或登革抗原（完整滅活的 rYF-DEN2)存在的情況下的相容性/穩(wěn)定性。
[0134] 將實施例7中制備的抗原/佐劑樣品與rYF_DEN2 LAV現(xiàn)場混合以制備共制劑，且 如下所述使用體外蝕斑測定對Vero細(xì)胞測試病毒活力。
[0135] 以4. 0 X 105個細(xì)胞/孔將Vero細(xì)胞（p40)接種至24孔板中。病毒和rYF-DEN2 +佐劑/完整滅活的YF-DEN2樣品的1:1混合物的制備基本上如實施例2中用于單價研究 所述。在96孔板中制備1:1 rYF-DEN2 LAV/抗原樣品的進(jìn)一步稀釋液以得到各測試樣品 的 1:10、1:100、1: 1，000、1:10, 000、1:100, 000 和 1: 1，000, 000 稀釋。在 T= 0 和 T= 24 小 時對樣品進(jìn)行的蝕斑測定基本上如實施例2中所述。
[0136] 結(jié)果表明，所有測試的制劑似乎對病毒活力不具有影響（參見圖4)。
[0137] 實施例9 在恒河猴（ifacaca aK/Jaiia)中評估登革引發(fā)-加強(qiáng)接種策略 恒河猴中進(jìn)行的該非GLP研究的目標(biāo)是評估共制劑"引發(fā)-加強(qiáng)"接種策略且將其與 常規(guī)的引發(fā)加強(qiáng)策略進(jìn)行比較。對于該研究，使用不同的方案施用2種疫苗候選，四價重 組登革亞單位疫苗候選（V180)和四價登革減毒活疫苗（LAV)。四價V180候選包含來自4 種登革病毒血清型（登革病毒（DENV) 1、DENV2、DENV3和DENV4)各自的截短的包膜糖蛋白 (DEN-80E)。四價LAV包含減毒活的嵌合黃熱/登革類型1-4 4的登革病毒（"YF-DEN")。 通過將編碼來自YFV 17D的prM和E蛋白的基因替換為四種登革血清型中各自的那些而構(gòu) 建黃熱病-登革嵌合疫苗載體。DNA克隆之后，轉(zhuǎn)錄RNA且轉(zhuǎn)染入Vero細(xì)胞，以獲得具有 YFV 17D復(fù)制機(jī)器和相關(guān)登革病毒的外殼的嵌合病毒。
[0138] 在本研究中利用任一性別（n=4/組）、稱重超過3 kg且通過中和滴度（對于DENV) 和ELISA (對于WNV)的黃病毒（DENV 1、2、3和4,和WNV)抗體陰性的健康成體、印度恒河 猴。如表5中所述施用疫苗。對于該研究，第1組在0和24周時皮下（SC)接受YF-DEN疫 苗。第2和3組接受常規(guī)的引發(fā)加強(qiáng)，其中在0周時給予YF-DEN疫苗，隨后在24周時給予 與MAA配制的V180。第2組通過標(biāo)準(zhǔn)SC途徑接受YF-DEN疫苗，而第3組通過肌內(nèi)（頂）途 徑接受疫苗。這使我們能夠評估頂給予的YF-DEN疫苗的免疫原性，所述頂是用于給予第 4和5組的共制劑的相同的施用途徑。第4和5組在0和24周時接受YF-DEN疫苗和V180 的共制劑。在第4組中，包括MAA作為佐劑，且在第5組中，包括ISC0MATRIX?作為佐劑。 以0. 5-mL/劑量施用所有疫苗。接種之后，每天觀察動物在接種部位的任何變化或可能指 示對疫苗的不利反應(yīng)的活動或攝食習(xí)慣的其他變化。
[0139] 表5.恒河猴免痔原件研究中伸用的時間表和制劑
[0140] 使用基于LiCor的微量中和測定每4周測定病毒中和活性，直至研究第32周。對 于LiCor測定，將Vero細(xì)胞以1. 5xl04個細(xì)胞/孔過夜接種于平底96孔組織培養(yǎng)板中的 100 μ 1 10%介質(zhì)199中。在分開的96孔板中，以1:10開始，一式兩份2倍連續(xù)稀釋血清 樣品，持續(xù)8次稀釋。對于沒有達(dá)到終點滴定的樣品，以較高稀釋度開始，重新測試樣品。將 血清與等體積的稀釋至50 pfu/孔的病毒孵育。在2%介質(zhì)199中進(jìn)行所有測定稀釋。將混 合物在37°C + 5% C02孵育1小時。中和之后，將整個混合物添加至鋪板的Vero細(xì)胞上，且 在37°C + 5% C02孵育4天。去除培養(yǎng)基之后，將細(xì)胞用PBS中的3. 7%甲醛固定30分鐘。 將板用200 μ 1 0. 1% Titon X-100/PBS洗滌2次，每次5分鐘。將板用50 μ 1 2. 8 μ g/ml 的4G2抗體染色。然后以7. 5 μ g/ml添加生物素化的馬抗小鼠 IgG，隨后添加 IRDye? 800CW (Li-Cor, Inc.，Lincoln, NE)鏈霉親和素（1:1000)和 DRAQ5 (1:10, 000)的混合物。將 板保持在黑暗中，用于該最后顯色。將抗體和試劑稀釋于補(bǔ)充〇. 2% Tween-20的Odyssey封 閉緩沖液中。在抗體更換之間，將板用〇. 1% Tween-20/PBS洗滌3次。孵育步驟在室溫進(jìn) 行 1 小時。使用 BioTek?EL406 洗板器系統(tǒng)（BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT)將 洗滌和分配步驟自動化。將板風(fēng)干且用紅外Odyssey? Sa成像系統(tǒng)（Li-Cor Biosciences) 掃描。將原始數(shù)據(jù)輸入Excel處理工作表。取一式兩份孔平均值，且將血清終點中和滴度 定義為當(dāng)與各測定板上包括的病毒對照相比時使800nm/700nm熒光積分強(qiáng)度比率減少大 于50%的最高血清稀釋度的倒數(shù)。Prism? (GraphPad Software, Inc.)用于繪制結(jié)果。以 1:10稀釋度開始，設(shè)置所有樣品。如果樣品在該稀釋度沒有中和，則分配1:5的滴度。
[0141] 對于第4周（劑量1后4周）的所有組的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的幾何平 均中和滴度總結(jié)于圖5中。在該時間點，在所有免疫的動物（除了第1組中沒有對DENV 3 響應(yīng)的一個動物）中檢測到病毒中和抗體應(yīng)答。來自第4周的關(guān)鍵結(jié)論是： ?與當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)SC途徑給予疫苗時誘導(dǎo)的中和滴度相比，頂給予的四價YF-DEN疫苗 刺激等效（如果不是更好的話）的中和滴度（比較第3組與第1和或2組）。 ?與當(dāng)單獨給予YF-DEN疫苗時誘導(dǎo)的中和應(yīng)答（第1、2和3組）相比，在劑量1后四 周時的共制劑組（第4和5組）中測量的中和應(yīng)答是等效的（如果不是更好的話）。這表 明，YF-DEN疫苗與V180亞單位疫苗和佐劑（MAA或ISC0MATRIX?)的共制劑不會負(fù)面影響 對疫苗的第一劑量中的LAV的應(yīng)答。
[0142] 對于第28周（劑量2后4周）的所有組的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的幾何 平均中和滴度總結(jié)于圖6中。在該時間點，在所有免疫的動物中都檢測到病毒中和抗體應(yīng) 答。來自第28周的關(guān)鍵結(jié)論是： ?與四價YF-DEN疫苗（第1組）相比，常規(guī)的引發(fā)加強(qiáng)（第2和3組）和共制劑引發(fā) 加強(qiáng)方法（第4和5組）兩者均誘導(dǎo)針對所有四種DENV類型的優(yōu)異的中和滴度。取決于 DENV類型，滴度范圍為高3至19倍。 ?與接受常規(guī)的引發(fā)-加強(qiáng)方案的組（第2和3組）中誘導(dǎo)的中和應(yīng)答相比，在劑量2 后四周時的共制劑組（第4和5組）中測量的中和應(yīng)答是等效的。這表明，YF-DEN疫苗與 V180亞單位疫苗和佐劑（MAA或ISC0MATRIX?)的共制劑不會負(fù)面影響對所述亞單位加強(qiáng)的 應(yīng)答。
[0143] 對于所有組的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的縱向幾何平均中和滴度顯示于圖7 中。總而言之，數(shù)據(jù)表明，共制劑引發(fā)-加強(qiáng)方案（其中在第0和24周時向動物施用與四 價LAV -起混合的V180亞單位疫苗），誘發(fā)與常規(guī)的引發(fā)-加強(qiáng)方法相當(dāng)?shù)膽?yīng)答且所述應(yīng) 答優(yōu)于作為同源疫苗給予的LAV。
【主權(quán)項】
1. 登革病毒疫苗組合物，其包含第一登革疫苗和第二登革疫苗，其中所述第一登革疫 苗是減毒活登革疫苗且所述第二登革疫苗是非復(fù)制型登革疫苗；其中所述減毒活登革疫苗 包含至少一種減毒活登革病毒或至少一種減毒活嵌合黃病毒。2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述非復(fù)制型登革疫苗是重組登革亞單位疫苗或滅活登 革疫苗。3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所述第二登革疫苗是四價登革亞單位疫苗， 其包含來自登革病毒1型（DENl)、登革病毒2型（DEN2)、登革病毒3型（DEN3)和登革病毒 4型（DEM)的登革E蛋白或其片段。4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述E蛋白各自構(gòu)成DEN1、DEN2、DEN3和DEM的野生型 E的從其N-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80%。5. 權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。6. 權(quán)利要求5的組合物，其中所述佐劑是鋁鹽佐劑。7. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物中的元素鋁的量為約50 y g至約I. 25mg。8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物中的元素鋁的量為約200 y g至約850 y g。9. 權(quán)利要求5的組合物，其中所述佐劑是基于皂苷的佐劑。10. 權(quán)利要求3-8中任一項的組合物，其中所述組合物中的各E蛋白的量為約0. 5 y g 至約500 y g。11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述組合物中的各E蛋白的量為約I. 0 y g至約100 y g〇12. 權(quán)利要求11的組合物，其中DEM E蛋白的量是DEN1、DEN2和DEN3 E蛋白的量的 約1. 5至約2. 5倍。13. 權(quán)利要求10-12中任一項的組合物，其中各E蛋白在昆蟲宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生且表 達(dá)。14. 權(quán)利要求1-13中任一項的組合物，其中所述減毒活登革疫苗是四價的。15. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述減毒活登革疫苗包含四種嵌合黃病毒；其中各嵌 合黃病毒包含單一登革病毒血清型的PrM和E蛋白和不同的黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白， 其中各嵌合黃病毒是減毒的。16. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述四種嵌合黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自黃熱病 毒。17. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述四種嵌合黃病毒各自的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自與 prM和E蛋白不同的登革血清型。18. 權(quán)利要求14-17中任一項的組合物，其中所述減毒活登革疫苗的效價是10至約 IxlO7蝕斑形成單位（PFU)。19. 權(quán)利要求18的組合物，其中所述減毒活登革疫苗的效價是約1x103至約IxlO5 PFU。20. 在有需要的患者中誘導(dǎo)針對登革的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述患者施用有效 量的權(quán)利要求1-19中任一項的登革病毒疫苗組合物。21. 在有需要的患者中預(yù)防登革感染、或預(yù)防或改善其癥狀的方法，其包括向所述患者 施用有效量的權(quán)利要求1-19中任一項的登革病毒疫苗組合物。22. 預(yù)防登革感染、或預(yù)防或改善其癥狀的方法，其包括以下步驟： (a) 混合第一登革疫苗和第二登革疫苗以形成登革病毒疫苗組合物，其中所述第一登 革疫苗是減毒活登革疫苗且第二登革疫苗是非復(fù)制型登革疫苗；和 (b) 向其中登革感染或其癥狀待預(yù)防或改善的患者施用步驟（a)的登革病毒疫苗組 合物。23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述非復(fù)制型登革疫苗是重組登革亞單位疫苗或滅活登 革疫苗。24. 權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的方法，其中所述第一登革疫苗是四價的，且包含 DENl、DEN2、DEN3和DEN 4組分，其中各組分包含減毒活登革病毒或減毒活嵌合黃病毒。25. 權(quán)利要求23或24的方法，其中所述第二登革疫苗是四價重組登革亞單位疫苗，其 包含來自DEN1、DEN2、DEN3和DEM的登革E蛋白或其片段。26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述減毒活疫苗是凍干的，且所述重組亞單位疫苗在混 合之前是液體。27. 權(quán)利要求26的方法，其中步驟（a)的混合包括用液體疫苗重構(gòu)凍干疫苗。28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述凍干疫苗用無菌稀釋劑重構(gòu)，然后與步驟（a)中的液 體疫苗混合。29. 權(quán)利要求25的方法，其中所述減毒活疫苗和所述重組亞單位疫苗兩者在混合之前 呈液體形式。30. 權(quán)利要求25-29中任一項的方法，其中所述E蛋白各自構(gòu)成DEN1、DEN2、DEN3和 DEM的野生型E的從其N-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80%。31. 權(quán)利要求22的方法，其中所述減毒活疫苗包含四種嵌合黃病毒；其中各嵌合黃病 毒包含單一登革病毒血清型的prM和E蛋白和不同的黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中各 嵌合黃病毒是減毒的。32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述四種嵌合黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自黃熱病 毒。33. 權(quán)利要求31的方法，其中所述四種嵌合黃病毒各自的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自與 prM和E蛋白不同的登革血清型。34. 預(yù)防或降低有需要的患者中的登革感染的可能性的方法，其包括以下步驟： (a) 向所述患者施用根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項的第一登革病毒疫苗組合物； (b) 步驟（a)之后等待過去預(yù)定量的時間； (c) 向所述患者施用根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項的第二登革病毒疫苗組合物；由此 在所述患者中預(yù)防登革感染或降低被登革感染的可能性。35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述第一登革病毒疫苗組合物和所述第二登革病毒疫苗 組合物是相同的。36. 權(quán)利要求34或35的方法，其中步驟（b)中的時間量為2個月至2年。37. 權(quán)利要求34-36中任一項的方法，其進(jìn)一步包括重復(fù)步驟（b)和（c) 一次或多次。38. 權(quán)利要求34-36中任一項的方法，其中所述第一登革病毒疫苗組合物和所述第二 登革病毒疫苗組合物通過肌內(nèi)或皮下注射來施用。39. 權(quán)利要求1-19中任一項的登革病毒疫苗組合物用于治療或預(yù)防與登革感染相關(guān) 的疾病的用途。40. 權(quán)利要求1-19中任一項的登革病毒疫苗組合物用于在患者中誘導(dǎo)針對登革病毒 的免疫應(yīng)答的用途。41. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項的登革病毒疫苗組合物，其用于治療或預(yù)防與登革感 染相關(guān)的疾病。
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含第一登革疫苗和第二登革疫苗的登革病毒疫苗組合物，其中所述第一登革疫苗是減毒活登革疫苗且所述第二登革疫苗是重組登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗；其中所述減毒活登革疫苗包含至少一種減毒活登革病毒或至少一種減毒活嵌合黃病毒。本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種佐劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第一登革疫苗和第二登革疫苗是四價的。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物來治療或預(yù)防登革感染或預(yù)防、改善或延遲其臨床表現(xiàn)的發(fā)作或進(jìn)展的方法。
【IPC分類】A61K39/12, A61K39/193
【公開號】CN105246506
【申請?zhí)枴緾N201480031059
【發(fā)明人】A.貝特, B-A.G.科勒, G.達(dá)納塞卡蘭, R.V.金塔拉
【申請人】默沙東公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2014年6月17日
【公告號】EP3010536A1, US20160151477, WO2014204892A1